劉伊彤，周霞，山廣志

腫瘤免疫療法是繼傳統(tǒng)手術(shù)、化療、放療等后出現(xiàn)的腫瘤治療新手段，其通過對免疫細胞進行正向調(diào)節(jié)進而激活、重建自身的免疫系統(tǒng)，實現(xiàn)對腫瘤細胞的捕獲與清除。目前臨床主要的腫瘤免疫療法包括腫瘤免疫治療藥物 IFN-α、細胞免疫療法（CAR-T）、免疫檢查點抑制劑（PD1/PDL1）等。色氨酸是 T 細胞活化的關(guān)鍵氨基酸，同時吲哚胺 2,3 雙加氧酶 1（IDO1）是 L-色氨酸（L-Trp）主要代謝通路的第一步驟的催化限速酶，IDO1 過度表達可導致局部微環(huán)境中L-色氨酸耗竭及隨后的 T 細胞功能受損，使腫瘤細胞逃脫機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控與殺滅，誘發(fā)腫瘤免疫耐受。近年來，在胃癌、乳腺癌、腦癌等多種腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)了 IDO1 的過表達，且發(fā)現(xiàn) IDO1 酶水平上調(diào)與多種癌癥類型的不良預后相關(guān)。因而 IDO1 已成為一個潛在的重要免疫檢查點，其抑制劑的成功開發(fā)與應用將是一種有效的腫瘤控制策略。

1 IDO1 與色氨酸代謝

L-色氨酸是人體 8 種必需氨基酸（嬰兒為 9 種）之一，只可通過外界食物攝取而無法自身合成，約占氨基酸總量的1%，在人體血漿中的濃度為 40 ～ 80 μmol/L，是當前已知與人體免疫系統(tǒng)功能失調(diào)有關(guān)的關(guān)鍵氨基酸[1]。在人體內(nèi)，約 5% 的 L-色氨酸用于蛋白質(zhì)合成或通過 5-羥色胺途徑代謝為 5-羥色胺與褪黑素，其余 95% L-色氨酸均通過犬尿氨酸（Kyn）途徑代謝為色氨酸代謝產(chǎn)物即系列犬尿氨酸衍生物[2]。多種研究表明，經(jīng)犬尿氨酸途徑代謝生成的色氨酸代謝產(chǎn)物可誘導免疫抑制，促進免疫系統(tǒng)效應細胞的凋亡，在自身免疫性疾病、炎癥、感染和妊娠期間對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用[3-4]。

IDO1、IDO2 和色氨酸 2,3 雙加氧酶（tryptophan 2,3-dioxygenase，TDO）是機體內(nèi) L-色氨酸經(jīng)犬尿氨酸途徑分解代謝的首個反應的關(guān)鍵限速酶，三種同工酶發(fā)揮作用時在色氨酸的吲哚環(huán)上插入一個氧分子，催化 L-色氨酸轉(zhuǎn)化為 N-甲酰犬尿氨酸（N-formylkynurenine，NFK），均屬于雙加氧酶[5]，但其分布、機制及底物識別特異性各不相同。

IDO 家族分為兩個亞型：IDO1 與 IDO2。IDO1 首次發(fā)現(xiàn)于 1967年[6]，由位于第 8號染色體的INDO基因編碼（IDO1; EC 1.13.11.52）[7]，蛋白大小約 45 kD，是一種廣泛分布于肺、脾、肝、腎、腦等各個器官的胞質(zhì)酶，可在不同的細胞中表達，包括抗原呈遞細胞（APCs），如單核細胞來源的巨噬細胞、樹突狀細胞（DCs）和成纖維細胞[8]。IDO2 于 2007年被首次發(fā)現(xiàn)[9]，由位于第 8 號染色體上的INDOL1 基因編碼（EC:1.13.11.-）[7]，蛋白大小約 47 kD，其主要表達于小鼠肝臟和腎臟，以及人類的肝臟、腎臟及生殖器官中[10]。TDO 首次發(fā)現(xiàn)于 1936年，由位于第 4 號染色體上的TDO2基因編碼（TDO; EC 1.13.11.11）[7]，蛋白大小約 48 kD，主要分布于肝臟及大腦[6]。IDO1 與 IDO2間的序列相似性為 43%，與 TDO 蛋白基因的序列同源性只有 10%[6]。

IDO2 與 TDO 均對底物 L-色氨酸具有高度特異性，而 IDO1 可廣泛識別 L-色氨酸、D-色氨酸、5-羥基色氨酸、色胺等多種色氨酸類似物[8,11]。IDO1 與 TDO 均具有較高的催化效率，而 IDO2 的酶活性只有 IDO1 的 3% ～5%[12]。因 IDO1 分布廣泛，具有較高的 L-色氨酸底物催化活性，是促進色氨酸降解的主要亞型，近年來一直被作為重要靶點進行廣泛研究。

犬尿氨酸代謝途徑是 L-色氨酸代謝的主要途徑（圖1）。首先，在 IDO1、IDO2 或 TDO的催化下，L-色氨酸吲哚環(huán)上的 2,3-雙鍵氧化斷裂轉(zhuǎn)化為 NFK，此步是該途徑的第一步也是限速步驟[13]。NFK 自發(fā)地或基于犬尿氨酸甲酰胺酶的活性水解成第一個穩(wěn)定的中間代謝產(chǎn)物——L-犬尿氨酸（L-kynurenine，KYN），然后通過 3 種途徑生成不同的酶代謝產(chǎn)物。其中，犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（kynurenine aminotransferase，KATs）可催化 KYN 生成犬尿喹啉酸（kynurenic acid，KYNA）；犬尿氨酸-3-單加氧酶（kynurenine-3-monooxygenase，KMO）可將 KYN 轉(zhuǎn)化為3-羥基犬尿氨酸（3-hydroxy-kynurenine，3-HK），再經(jīng)犬尿氨酸酶（kynureninase，KYNU）催化生成 3-羥基鄰氨基苯甲酸（3-hydroxyanthranilic acid，3-HAA），而 KYN 在KYNU 直接催化下可生成產(chǎn)物鄰氨基苯甲酸（anthranili acid，AA），進而轉(zhuǎn)化為 3-HAA。3-HAA 經(jīng)多階段酶反應可轉(zhuǎn)化為吡啶甲酸（picolinic acid，PIC）與喹啉酸（quinolinic acid，QUIN），而 QUIN 是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）生物合成的前體物質(zhì)[8,13]。NAD 是一種關(guān)鍵的酶輔助因子，參與多種基本生物學循環(huán)，包括在糖酵解和氧化磷酸化過程中作為電子傳遞因子，以及被蛋白質(zhì)和信號酶的共價修飾所消耗，可調(diào)節(jié)細胞衰老和維持機體正常功能[7,13]。

圖1 L-色氨酸代謝通路（KYNU：犬尿氨酸酶；KATs：犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；KMO：犬尿氨酸-3-單加氧酶；3-HAO：3-羥鄰氨苯丙酸-3,4-雙加氧酶；NAD+：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）

2 IDO1 與腫瘤免疫逃逸

與正常生理情況相比，發(fā)生腫瘤免疫逃逸的多種癌細胞中呈現(xiàn) IDO1 酶水平顯著增加，1 型輔助性 T 淋巴細胞（T helper 1，Th1）免疫應答的促炎癥因子是激活 IDO1 過表達的主要因素，尤其是 IFN-γ、IL-1β、TNF-α 和 IL-6 等炎癥因子也誘導 IDO1 進行不同程度的誘導表達[7,14]。研究表明，IDO 過度活躍時將導致局部微環(huán)境的 L-色氨酸耗竭及犬尿氨酸途徑代謝產(chǎn)物蓄積，這是誘導腫瘤免疫耐受效應的關(guān)鍵機制[15]（圖2）。

圖2 IDO1 介導腫瘤免疫逃逸的機制[16]

目前關(guān)于 IDO1 蛋白介導腫瘤免疫逃逸的機制主要有下述通路：①T 細胞對低色氨酸水平特別敏感，當 T 細胞通過未帶電的 tRNAs 感知低色氨酸水平后，壓力應答激酶（general control nonderepressible 2，GCN2）被激活，干擾T 細胞的信號調(diào)節(jié)通路，導致 G1 期細胞周期阻滯及細胞凋亡[17]。②L-色氨酸的過度消耗抑制了氨基酸感應激酶（GLK1），進而抑制了哺乳動物雷帕霉素（絲/蘇氨酸蛋白激酶）復合物（mammalian target of rapamycin1，mTORC1）信號通路，啟動氨基酸饑餓效應，進而觸發(fā)了 T 淋巴細胞在腫瘤微環(huán)境中的自噬及免疫無能。③KYN、3-HK、KA、QC 等色氨酸代謝產(chǎn)物是芳香烴受體（AhR）的內(nèi)源性配體[18]，AhR 的激活促進了人叉頭框蛋白 P3（FOXP3）調(diào)節(jié) T 細胞（Tregs）的分化，抑制了抗腫瘤免疫反應，最終導致效應 T 細胞無能及 Tregs 免疫抑制功能激活[19-21]。犬尿氨酸代謝通路是腫瘤細胞建立腫瘤抗原免疫耐受的關(guān)鍵途徑之一，多種免疫抑制機制協(xié)合調(diào)控導致腫瘤細胞逃脫了機體的免疫監(jiān)控。IDO1 作為腫瘤細胞中過表達的免疫檢查點，其抑制劑的開發(fā)已成為抗腫瘤治療的重要手段。

3 IDO1 抑制劑臨床前生物學評價

3.1 酶抑制活性評價

酶抑制活性評價是最常見且基礎的生物學評價方法。IDO1 的酶學試驗包括高效液相色譜分析、KYN 加和物試驗法、NFK 試驗法、KYN 試驗法、NFK 或 KYN 衍生熒光試驗法及 NFK-green（染料）法等[15]。其中，KYN 加和物試驗法已成功應用于臨床抑制劑如 NLG-919 等的酶學試驗評價。該研究將濃度為 100 μmol/L ～ 200 pmol/L 的待測化合物加至含有 70 nmol/L IDO1 蛋白的 37 ℃ 孵育體系中反應 15 min，加入 5% 總體積的 30% 三氯乙酸終止反應，并于 60 ℃ 下孵育 30 min 以促進 NFK 的生成。離心后取上清加入等體積 2%（W/V）二甲胺基甲硼烷（DMAB）醋酸溶液，25 ℃ 反應 10 min 得到黃色加和衍生物，并于 480 nm 下檢測其熒光強度，進而測定其酶抑制活性，最終測得 NLG-919 的 IC50值為 28 nmol/L[22]。研究顯示，該方法具有良好的重復性，但準確度易受到 3-HK與 3-HAA 吸光度的干擾[15]。

3.2 細胞活性評價

細胞水平活性評價是另一常見生物學評價方法。HEK293 試驗及 HeLa 試驗是最為常用的 IDO1 細胞活性評價方法。HEK293 試驗是將 IDO1 真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293 細胞中從而過表達 IDO1 蛋白，而 HeLa 試驗是IFN-γ 的刺激下過表達 IDO1 蛋白，進而建立 IDO1 蛋白細胞水平篩選評價體系。此外，其他研究也已成功應用了IFN-γ 激活下的 MDA-MB-231 細胞、A172 細胞與 A431細胞篩選體系[15]?；?HeLa 試驗進行的 INCB024360 抑制活性測定目前已被報道。于 HeLa 細胞密度為 5 × 103/孔的 96 孔板中添加 IFN-γ 至終濃度為 50 ng/μl 及系列稀釋化合物共孵育 48 h，后移取每孔上清 140 μl 并分別加入6.1 mol/L 三氯乙酸 10 μl，于 50 ℃ 下孵育 30 min。離心后取 100 μl 上清后，各加入等體積 2%（W/V）DMAB 醋酸溶液，480 nm 下測定其黃色加和物的熒光強度，最終測得臨床抑制劑 INCB024360 IC50值為 7.4 nmol/L[23]。

3.3 X-射線衍射技術(shù)

X-射線衍射技術(shù)是解析蛋白質(zhì)三維晶體結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)，近年來已逐步應用于復雜生物大分子及復合物晶體結(jié)構(gòu)的測定。該技術(shù)從原子層面上輔助科研人員深入理解蛋白質(zhì)的生物學功能，以及精確認識蛋白-小分子相互作用的空間取向與結(jié)合特征，可輔助驗證配體與受體靶點的結(jié)合，進而通過進一步分析，對小分子抑制劑進行基于結(jié)構(gòu)的藥物設計，最終得到活性更佳的候選化合物[24]。Peng 等[25]為深入解析小分子抑制劑與 IDO1 間的相互作用，共晶得到了復合物晶體結(jié)構(gòu)，通過后續(xù)構(gòu)效關(guān)系分析及優(yōu)化，尋找到了可更好擬合 IDO1 蛋白口袋的取代基，最終得到具有更高效力的候選化合物。

3.4 表面等離子體共振

表面等離子體共振（SPR）技術(shù)是目前研究、分析分子間相互作用的重要手段，其原理為 SPR 信號與結(jié)合在金屬薄膜表面的生物分子質(zhì)量成正比，進而可實時監(jiān)測生物分子間的相互作用，精確獲得其親和力及動力學等數(shù)據(jù)[26]。目前，此技術(shù)已廣泛應用于 IDO1 蛋白小分子抑制劑的高通量篩選，及分子層面與其抑制劑的相互作用研究。Gao 和Li[27]通過酶活實驗及細胞實驗測定茚酮類小分子化合物的IC50及 EC50分別為（2.780 ± 0.408）μmol/L 和（9.171 ±0.356）mmol/L。為進一步驗證抑制劑與 IDO1 蛋白之間的相互作用，此研究利用 Biacore T200 光學生物傳感器，在HBS-EP 緩沖液體系下將 IDO1 蛋白固定于 CM5 芯片上，最終測定該茚酮類抑制劑的平衡解離常數(shù)（KD）為9.828 μmol/L，證實了其與 IDO1 靶標蛋白的結(jié)合親和力。

3.5 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法（ITC）是直接測定生物分子（如蛋白-小分子，蛋白-蛋白）締合過程中釋放或吸收熱量的一種簡便而廣泛應用的方法，并可定量測定相互作用的親和力。ITC 是當前唯一可以在單個實驗中同時測定所有結(jié)合參數(shù)的技術(shù)，它提供了有關(guān)分子相互作用的完整熱力學信息。此外，ITC 無需對受體蛋白進行熒光標記或固定，因而可測定自然狀態(tài)下反應物之間的準確、真實的親和力結(jié)果[28]。目前也已有文獻報道了應用 ITC 技術(shù)進行 IDO1 酶生物學評價的應用[29]。

4 進入臨床試驗的 IDO1 抑制劑

近年來，隨著 PD1、PDL1 單抗上市、CAR-T 療法獲批，免疫腫瘤學領(lǐng)域的研究非?；钴S?；?IDO1 在免疫抑制和癌癥中的關(guān)鍵作用，其成為了腫瘤免疫治療的極具吸引力的新型藥物靶點。近年來，多種新結(jié)構(gòu)類型 IDO1 抑制劑被發(fā)現(xiàn)，少部分已經(jīng)進入臨床階段（表1），如indoximod、epacadostat 和 navoximod 等，目前尚未有成功上市的藥物。本文根據(jù)小分子抑制劑化學骨架，分別綜述了不同結(jié)構(gòu)類型的 IDO1 抑制劑的主要臨床研究進展。

表1 IDO1 抑制劑及其臨床研究項目

4.1 色氨酸衍生物

色氨酸衍生物類抑制劑是最早報道的一種 IDO1抑制劑，其中最具有代表性的是 1-甲基-色氨酸（1-methyl-DL-tryptophan，1-MT）。1-MT 存在兩種同分異構(gòu)體，即 D-1-MT 與 L-1-MT（圖3）。研究結(jié)果顯示，體外細胞實驗中，L-1-MT 可更好地抑制 IDO1 的酶活性，而 D-1-MT 具有更佳的體內(nèi)外 T 細胞增殖激活及抗癌活性[19]。當腫瘤細胞中由于 IDO1 過表達而造成色氨酸耗竭時，D-1-MT 作為色氨酸模擬物，可恢復 mTORC1 蛋白活性，能夠抑制下游 IDO1 介導的 mTORC1 靶蛋白信號通路和氨基酸敏感通路。

圖3 1-MT（A）、D-1-MT（B）、L-1-MT（C）的化學結(jié)構(gòu)

目前 D-1-MT 是一種由 NewLink Genetics 公司研發(fā)的 IDO1 臨床在研抑制劑（indoximod，NLG8189），研究數(shù)據(jù)顯示，indoximod 與多種藥物聯(lián)合用藥時，可在一定程度上逆轉(zhuǎn)多種癌癥相關(guān)的免疫抑制作用。第一例應用于人體的臨床試驗研究了 indoximod 治療惡性實體腫瘤的安全性、毒性及最大有效劑量。在劑量增加試驗中，口服劑量達每日兩次、每次 2000 mg，仍表現(xiàn)為耐受性較好。每日攝入200 mg indoximod 的 7 名受試者試驗數(shù)據(jù)顯示，4 名患者表現(xiàn)出了病情穩(wěn)定，3 名出現(xiàn)了病情進展，分析推測與D-1-MT 對炎癥反應的不同影響有關(guān)[30]。另外一項臨床研究試驗中，在晚期黑色素瘤患者中，聯(lián)合使用 indoximod 和PD-1 抗體派姆單抗的總緩解率為 61%，包括 10 個完全緩解（20%）和 21 個部分緩解（41%）。聯(lián)合治療的中位無進展生存期為 12.9 個月，1年生存率為 56%，提示indoximod 與派姆單抗協(xié)同抗腫瘤治療效果明顯[31]。

4.2 羥基脒類及其衍生物

Epacadostat（INCB024360）是由 Incyte 公司開發(fā)的臨床上最先進的羥基脒類口服 IDO1 抑制劑（圖4）。Epacadostat 是 IDO1 底物 L-色氨酸的競爭性底物，競爭結(jié)合 IDO1 的酶活性催化結(jié)構(gòu)域，干擾腫瘤細胞內(nèi)色氨酸的異常代謝，進而降低 Kyn 水平并抑制腫瘤生長[20]。Epacadostat 已在小鼠模型中顯示出抑制腫瘤生長的作用。在頭頸癌相關(guān)臨床試驗中，一份關(guān)于 38 例既往治療患者的臨床報告表明，聯(lián)合使用 PD-1 抗體時，epacadostat 可提高整體應答率和疾病控制率，且未增加明顯副作用[32]；針對黑色素瘤的臨床試驗數(shù)據(jù)顯示，epacadostat 與 CTLA-4抗體伊匹單抗聯(lián)合使用，7 名患者中的 6 名在停止治療前均顯示疾病穩(wěn)定，7 名患者的后續(xù)治療時間均大于 90 d，其中有 4 名大于 180 d；另一組相同劑量下試驗數(shù)據(jù)顯示，8 名患者中的 6 名在 9 周后評估時呈現(xiàn)腫瘤體積減小，后續(xù)跟蹤數(shù)據(jù)顯示，疾病控制率約為 62.5%，應用聯(lián)合免疫治療方案的新患者較之前未接受過免疫治療的患者的中位無進展生存期提高了 5.7 個月。研究人員進而得出結(jié)論，epacadostat 可以安全地與伊匹單抗聯(lián)合使用，并可能增強晚期或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的伊匹單抗臨床活性[33]。

圖4 Epacadostat 化學結(jié)構(gòu)及與 IDO1 結(jié)合模式圖（PDB ID:5WN8）

4.3 4-苯基咪唑類及其衍生物

Navoximod（NLG919，GDC-0919）是一種由 NewLink Genetics 公司研發(fā)的苯基咪唑類 IDO1 抑制劑（圖5），該化合物通過與 IDO1 活性位點的血紅素結(jié)構(gòu)中亞鐵分子結(jié)合從而抑制 IDO1 的酶活性，進而抑制色氨酸異常代謝和恢復 T 細胞的功能。體內(nèi)研究顯示，口服 NLG919 可使血漿和組織中的犬尿氨酸濃度降低約 50%，且 NLG919治療顯示效應性 T 細胞的劑量依賴性激活和增殖，并導致腫瘤大小的急劇消退[34]。在同系小鼠 B16-F10 黑色素瘤模型中，navoximod 增強了紫杉醇的抗腫瘤療效而不增加副作用。Navoximod、抗 PD1/PD-L1/PD-L2 抗體、indoximod與化療和糖蛋白 100 （gp100）肽疫苗的聯(lián)合使用獲得了顯著的協(xié)同抗腫瘤效果[32]。目前 navoximod 單獨使用及與阿特珠單抗聯(lián)用治療實體瘤的 1 期臨床試驗均已完成，但暫時無公開的數(shù)據(jù)。

4.4 喹啉類及其衍生物

BMS-986205 是由 Bristol-Myers Squibb 公司研發(fā)的一種新型 IDO1 抑制劑（圖6）。臨床前研究表明其存在劑量依賴性療效，即使在低濃度下，BMS-986205 也能成功抑制 IDO1 并降低 KYN 血清水平，相較于 epacadostat 具有更好療效和藥代動力學[8]。該藥物已成功完成多組 I 期臨床試驗，目前正在進行多個 II 期和兩個 III 期臨床試驗，已在黑色素瘤或肌肉浸潤性膀胱癌患者中與納武單抗聯(lián)合試驗。其中，BMS-986205 與納武單抗用于治療晚期膀胱癌的臨床數(shù)據(jù)顯示，兩者聯(lián)用后對晚期膀胱癌具有初步療效，且可改善 100 mg 劑量下 BMS-986205 的副作用耐受性[35]。

圖6 BMS-986205 化學結(jié)構(gòu)及與 IDO1 結(jié)合模式圖（PDB ID:6DPR）

4.5 其他類

PF-06840003 是一種色氨酸非競爭性、非血紅素結(jié)合IDO1 抑制劑，由 iTeos SA 授權(quán)輝瑞進行臨床開發(fā)（圖7）。該化合物具有良好的人體藥代動力學特性，具有較長的半衰期，可每日單劑量給藥，且具有神經(jīng)系統(tǒng)穿透特性，因而有望用于腦轉(zhuǎn)移瘤的治療[36]。在幾項臨床前小鼠腫瘤模型中，PF-06840003 顯著降低了腫瘤內(nèi) KYN 水平，并抑制了腫瘤生長，無論是在單一療法中，還是在與 PD-L1 或 CTLA4阻斷劑的組合方案中，療效均有所提高。PF-06840003 單獨應用于復發(fā)惡性膠質(zhì)瘤的臨床 I 期數(shù)據(jù)顯示，此抑制劑應用劑量至 500 mg BID（一日兩次）時耐受性普遍良好，具有臨床藥效學效應[37]。

圖7 PF-06840003 化學結(jié)構(gòu)及與 IDO1 結(jié)合模式圖（PDB ID:5WHR）

BGB5777 也是一種有效的穿透中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 IDO1抑制劑，聯(lián)合納武單抗進行放療，在晚期膠質(zhì)母細胞瘤患者中實現(xiàn)了持久的生存獲益[38]。

5 展望

腫瘤免疫治療是一種很有前景的癌癥治療方法，得益于對腫瘤免疫及色氨酸代謝機制的日益深入的理解，多項研究發(fā)現(xiàn) IDO1 參與并介導了多種免疫逃逸機制，因而其小分子抑制劑的開發(fā)是解除腫瘤微環(huán)境免疫抑制的研發(fā)熱點。雖然當前仍未有成功上市的藥物，但多種抑制劑的臨床前及初步臨床數(shù)據(jù)表明，IDO1 抑制劑的單獨用藥及與其他免疫檢查點抑制劑、疫苗等的聯(lián)合使用均呈現(xiàn)出較好的抗腫瘤療效。當然，某些抑制劑的臨床試驗失敗也提醒我們，需要對基礎機制進行更為深入的研究，合理制訂聯(lián)合應用免疫調(diào)節(jié)策略，進行更為科學、全面的免疫監(jiān)測臨床試驗。相信隨著檢測技術(shù)及科研方法的不斷創(chuàng)新，療效好、毒副作用小的IDO1 抑制劑及與其他抗腫瘤療法聯(lián)用的成功上市將指日可待，為攻破腫瘤免疫帶來新希望！