關(guān)艷，蒙建州，劉憶霜，肖春玲，楊延輝

近年來，耐藥結(jié)核病的發(fā)病率與死亡率明顯回升，使其再次成為嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病之一。但在過去的 60 多年，僅開發(fā)出了兩種能用于臨床的抗結(jié)核藥物——貝達(dá)喹啉[1]和德拉馬尼，因此開發(fā)新型抗結(jié)核藥物任重道遠(yuǎn)。恥垢分枝桿菌作為模式菌進(jìn)行抗結(jié)核藥物的前期篩選評(píng)價(jià)，具有生長速度快，可在普通實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，與結(jié)核分枝桿菌的同源性高等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)的諸多抗結(jié)核活性化合物也會(huì)對(duì)恥垢分枝桿菌體現(xiàn)出敏感性，例如苯并噻酮類化合物對(duì)結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌都體現(xiàn)出較好的抗菌活性，并且具有較高的抗耐藥菌株的能力和極低的毒性[1-3]。因此，可用于抗結(jié)核先導(dǎo)化合物的初步快速評(píng)價(jià)。

微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物是開發(fā)新型抗生素的重要來源。利用海洋微生物資源，聯(lián)合使用恥垢分枝桿菌替代模型篩選并發(fā)現(xiàn)具有抗結(jié)核分枝桿菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，將為抗生素的開發(fā)提供新骨架來源。新菌株的分離鑒定是獲得新功能微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的前提。由于核糖體 16S rDNA 基因幾乎存在于所有原核生物的細(xì)胞中，并且在結(jié)構(gòu)上，同時(shí)具有相嵌的高度保守區(qū)域和可變異或高度變異的區(qū)域，在生物進(jìn)化的漫長歷程中相對(duì)恒定，可作為生物演化的分子鐘。根據(jù) 16S rDNA 基因序列的比對(duì)來確定原核生物物種之間的親緣關(guān)系，尤其是較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系分析是可靠的[4]。早在 1987年，已有研究者分析了微生物的 16S rDNA 序列間的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系，并提出生物分類的三界論：真細(xì)菌生物界、古菌生物界和真核生物界[5]。更有學(xué)者提出可以應(yīng)用 16S rDNA 序列對(duì)海洋細(xì)菌進(jìn)行種屬的鑒定[6]。因此，原核生物的核糖體 16S rDNA基因可被應(yīng)用于微生物菌株初步鑒定。

本文從深海底土樣中分離得到一株細(xì)菌——IMBGY10-46，經(jīng)抗菌活性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物具有顯著抑制恥垢分枝桿菌的特征。對(duì)細(xì)菌的形態(tài)、菌落、16S rDNA 序列同源性、基因組Tm值等進(jìn)行了研究。再通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，初步鑒定了其分類進(jìn)化地位，為進(jìn)一步從海洋微生物中尋找并開發(fā)新型的抗結(jié)核藥物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從印度洋靠近赤道地區(qū)（經(jīng)度85°02'，緯度 11°03'，水深 4888 m）的樣品中分離得到；新生霉素敏感型恥垢分枝桿菌 MC2155 由本科室誘變保存。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 pico21R 高速低溫離心機(jī)為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；HH-ZK2 電熱恒溫水浴槽為上海平軒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PCR 儀和Gel Doc XR+ 凝膠成像系統(tǒng)為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；DYCP-31BN 瓊脂糖凝膠電泳儀為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)定量分析儀為澳大利亞 Corbett 公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑和培養(yǎng)基 16S rDNA 通用引物：27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和 1492R-GG TTACCTTGTTACGACTT 由上海生工生物工程有限公司合成；蛋白酶 K、dNTP-mix、Platinum DNA聚合酶購自美國 Invitrogen 公司；AxyPrep 凝膠回收試劑盒購自美國 Axygen 公司；熒光染料購自美國 Roch 公司；瓊脂糖購自美國 Amresco 公司；2216E 瓊脂和液體培養(yǎng)基、單糖發(fā)酵管、吲哚試劑和觸酶試劑均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的富集 海底沉積物按取樣的深度不同，分成 3 份（0 ～ 10 cm、10 ～ 19 cm和 19 ～34 cm），4 ℃ 保存。每份取 1 g 置于 10 ml 的2216E 液體培養(yǎng)基中，于 16 ℃、200 r/min 振蕩1 h 后，以 1000 r/min 離心 10 min，取上清，再用無菌棉花過濾，濾液稀釋為 10-1、10-2和 10-33 個(gè)濃度。

1.2.2 菌株分離 取上述 3 個(gè)濃度的樣品 100 μl分別涂布于加 50 μg/ml 新生霉素和 50 μg/ml 制霉菌素、加 50 μg/ml 氨芐青霉素、不添加任何抗生素的 3 種 2216E 固體培養(yǎng)基平板上。20 ℃ 培養(yǎng) 1 ～ 8 周挑取單個(gè)菌落用 2216E 固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行劃線后，于 20 ℃ 培養(yǎng)一周，重復(fù)這一過程，對(duì)菌株進(jìn)行純化，所得純培養(yǎng)物用無菌的 15 % 甘油水溶液保存于 -80 ℃。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將斜面保存的 IMBGY10-46接種到 2216E 和 54 號(hào)液體培養(yǎng)基中，20 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 8 ～ 20 d 后，4000 r/min 離心5 min，收集發(fā)酵液。

1.2.4 抗恥垢分枝桿菌活性測(cè)定（紙片法） 將直徑為 7 mm 無菌紙片浸入發(fā)酵液樣品中，取出后放在添加 0.1% 的OD600為 1.6 的恥垢分枝桿菌菌液的 54 號(hào)瓊脂平板上，48 h 后測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.5 電鏡觀察的樣品處理 向菌泥中加入0.2 mol/L pH 為 7.0 的磷酸緩沖液沖洗 3 遍，每次4000 ×g離心 5 min；向洗好的菌泥中加入 0.5 ml 2.5% 的戊二醛進(jìn)行預(yù)固定；再經(jīng) 3 次 0.2 mol/L pH 為 7.0 的磷酸緩沖液漂洗后，用 1% 鋨酸后固定 1 ～ 2 h；漂洗后，采用梯度乙醇脫水（30%、50%、70%、80%、90%、95% 和 100%），每個(gè)濃度處理15 min；經(jīng)臨界點(diǎn)干燥后，進(jìn)行離子濺射法鍍膜。最后樣品放入掃描電鏡樣品室中進(jìn)行觀察。

1.2.6 細(xì)菌理化特性測(cè)定 從 2216E 固體培養(yǎng)基平板上挑取單菌落，分別接種于單糖發(fā)酵管、H2S和尿素發(fā)酵管中 37 ℃ 培養(yǎng) 48 h。通過裸眼觀察同陰性對(duì)照比色的方法進(jìn)行鑒定，單糖發(fā)酵管呈現(xiàn)黃色為陽性，藍(lán)色為陰性；尿素發(fā)酵管呈現(xiàn)紅色為陽性，黃色為陰性。挑取單菌落在載玻片上與觸酶試劑混勻，有氣泡產(chǎn)生的為陽性，無氣泡的為陰性。

1.2.7 基因組 DNA 抽提 液體發(fā)酵培養(yǎng)離心得到的菌泥用無菌水清洗 3 次，4000 r/min 離心5 min，棄上清液。得到的約 50 μl 沉淀中加入 300 μl裂解液（40 mmol/L Tris-acetate pH 7.8、20 mmol/L乙酸鈉、1 mmol/L EDTA、1% SDS）后[7]，加入 10 μl蛋白酶 K，于 56 ℃ 水浴中，孵育 1 h，100 ℃ 煮沸 10 min，12 000 r/min 離心 10 min，得到的上清即為菌株的基因組 DNA 抽提液，該溶液經(jīng)紫外吸收法定量（40.2 μg/ml）后，可直接應(yīng)用于后續(xù)的PCR 反應(yīng)模板。

1.2.8 熒光法測(cè)定基因組Tm值 取 5 μl 基因組與 5 μl 稀釋過的 SYBR Green 1 染料充分混合，在實(shí)時(shí)定量 PCR 儀上測(cè)定融解曲線。測(cè)定條件設(shè)為 25 ～ 99 ℃，溫度梯度為 1 ℃，每個(gè)梯度的停留時(shí)間是 1 min。

1.2.9 16S rDNA 基因擴(kuò)增 用 16S rDNA 通用引物 16SF 和 16SR 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：10 × PCR buffer（不含Mg2+），2.5 μl；dNTP（各2.5 mmol/L），0.5 μl；引物 16SF（10 μmol/L）和16SR（10 μmol/L），分別 0.5 μl；Taq 酶（5 U/μl），0.2 μl；模板 DNA（40 ng），1 μl；ddH2O，19.8 μl；總體積 25 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s，52 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 充分延伸 10 min，4 ℃保存。

1.2.10 PCR 產(chǎn)物測(cè)序 通過 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，得到條帶清晰，且大小正確的片段，進(jìn)行切膠。用 Axygen 凝膠回收試劑盒參照說明書對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收純化?；厥盏?16S rDNA 基因片段委托上海英俊工程公司測(cè)序。

1.2.11 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將測(cè)得的序列提交NCBI 的 GeneBank 數(shù)據(jù)庫，選擇 others 進(jìn)行相似性比對(duì)檢索。比對(duì)結(jié)果顯示前 100 株菌中有75 株為假單胞菌屬，選取一致性在 96% 以上的51 個(gè)代表性序列與 IMBGY10-46 的 16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用 MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定該菌株的進(jìn)化位置。

2 結(jié)果

2.1 IMBGY10-46 的抗恥垢分枝桿菌活性

分離獲得所有菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，離心獲得發(fā)酵液上清。用紙片法測(cè)定抗恥垢分枝桿菌的活性，菌株 IMBGY10-46 在各個(gè)時(shí)間段不同培養(yǎng)基中均具有抗分枝桿菌的活性（圖1）。結(jié)果顯示在 2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12 d 的發(fā)酵液抗菌活性最強(qiáng)（圖1D）。

圖1 IMBGY10-46 發(fā)酵液的抗分枝桿菌活性測(cè)定（A：54 號(hào)液體培養(yǎng) 8 d；B：54 號(hào)液體培養(yǎng) 11 d；C：54 號(hào)液體培養(yǎng)19 d；D：2216E 液體培養(yǎng) 12 d）Figure 1 The assay of anti-mycobacterium activity by IMBGY10-46 fermentation (A: Grown for 8 d in 54 liquid culture; B:Grown for 11 d in 54 liquid culture; C: Grown for 19 d in 54 liquid culture; D: Grown for 12 d in 2216E liquid culture)

2.2 IMBGY10-46 菌落形態(tài)

經(jīng)過 2216E 固體培養(yǎng)基上 37 ℃ 培養(yǎng) 40 h得到的菌落呈白色、質(zhì)地較硬、半透明，在普通光學(xué)顯微鏡下放大 100 倍以上可觀察到圓形中間凸起、邊緣不規(guī)則如卷發(fā)狀（圖2）的菌落。革蘭氏染色呈紅色說明其為革蘭氏陰性菌。

圖2 IMBGY10-46 的菌落（A：54 號(hào)固體平板；B：放大 20 倍；C：放大 100 倍；D：放大 400 倍）Figure 2 The colony of IMBGY10-46 (A: 54 agar plate; B: The magnification is 20; C: The magnification is 100; D: The magnification is 400)

2.3 IMBGY10-46 菌體形態(tài)

經(jīng)環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果表明細(xì)菌的形態(tài)多數(shù)為微彎的桿狀，（0.5 ～ 1.0）×（1.0 ～ 1.5）μm；少部分呈現(xiàn)出圓球狀。菌體表面附有菌毛，極易黏附在一起（圖3）。

圖3 IMBGY10-46 的形態(tài)Figure 3 Morphology thallus of IMBGY10-46

2.4 溫度和培養(yǎng)基對(duì) IMBGY10-46 生長的影響

在 4 ℃ 和 42 ℃ 條件下，IMBGY10-46 均可生長，其中 35 ℃ 條件下細(xì)菌生長最好（圖4）。相同培養(yǎng)時(shí)間下，4 ℃ 和 35 ℃ 條件下，IMBGY10-46 在 54 號(hào)固體培養(yǎng)基中生長優(yōu)于2216E 固體培養(yǎng)基。在 42 ℃ 條件下，2216E 固體培養(yǎng)基中 IMBGY10-46 可生長，而 54 號(hào)固體培養(yǎng)基中不能生長。

圖4 溫度和培養(yǎng)基對(duì) IMBGY10-46 菌落的影響Figure 4 The effect of temperature and media to the colony of IMBGY10-46

2.5 IMBGY10-46 的理化特性鑒定結(jié)果

IMBGY10-46 經(jīng)單糖發(fā)酵試驗(yàn)和生化反應(yīng)鑒定，結(jié)果顯示該菌株不能夠利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖和枸櫞酸鹽；尿素和吲哚試驗(yàn)均為陰性；觸酶試驗(yàn)（又稱過氧化氫酶試驗(yàn)）結(jié)果為陰性，其中過氧化氫酶試驗(yàn)與大多數(shù)假單胞菌不同。

2.6 IMBGY10-46 的基因組和 16S rDNA

取 5 μl 提取的基因組，用 1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示基因組的完整性較好（圖5A），基因組大于 10 kb。

圖5 IMBGY10-46 的基因組（A）和 16S rDNA（B）Figure 5 The genome (A) and 16S rDNA (B) of IMBGY10-46

取 5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果見圖5B，目的片段的長度約為 1.5 kb，說明菌株 IMBGY10-46 的 16S rDNA 已經(jīng)被成功擴(kuò)增。

2.7 DNA 的堿基組成

DNA 的 G+C 含量采用熒光法測(cè)定[8]，通過熒光強(qiáng)度和時(shí)間求導(dǎo)得到菌株IMBGY10-46 的Tm值為（88.2 ± 0.8）℃（圖6）。應(yīng)用不含甲酰胺的擬合方程式：%GC = 1.98 ×Tm- 106.91 計(jì)算出菌株IMBGY10-46 DNA 的 G+C 含量約為 67.7%，這與假單胞菌屬菌株 DNA 的 G+C 含量（58% ～70%）[9]相一致。但這與Pseudomonas sabulinigriJ64的 DNA G+C 含量 58.1%[10]有顯著差異。

圖6 菌株IMBGY10-46基因組融解曲線（紅色、藍(lán)色和綠色線代表3 次生物學(xué)重復(fù)）Figure 6 The melting curve of IMBGY10-46 (The red, blue and green lines represent 3 biological repetitions)

2.8 序列測(cè)定及結(jié)果分析

菌株 IMBGY10-46 的 16S rDNA 序列經(jīng)測(cè)定為 1417 bp，具體核苷酸序列提交GenBank（Accession No. JQ362457）。并在 Pubmed 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Pseudomonas sp. ljh-16的相似性最高，其覆蓋度為 99%，一致性為 98%，可以認(rèn)為該菌株屬于假單胞菌屬。隨后將序列遞交EzTaxon 數(shù)據(jù)庫，檢索得到同源性最高的菌株是Pseudomonas sabulinigriJ64，同源性為 98.29%。按照 16S rDNA 判定標(biāo)準(zhǔn)，與模式菌株同源性小于98% 應(yīng)判定為新種，但 IMBGY10-46 培養(yǎng)后提取基因組測(cè)定 DNA 的 G+C 含量與Pseudomonas sabulinigriJ64 有顯著差異；這株菌與假單胞菌屬菌株同源性明顯大于與其他屬菌株同源性，因此初步斷定這株菌為假單胞菌屬新菌種。

選擇 51 個(gè)同源性較高的代表性菌株序列，用Clustal W 進(jìn)行多序列比對(duì)后，利用 MEGA7.0 繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖7。

3 討論

海洋微生物的種類豐富，其中也存在分枝桿菌，例如海分枝桿菌等[11]。微生物在共生的過程中會(huì)有拮抗作用，由此推斷，從海洋微生物中極有可能獲得抗分枝桿菌的新物質(zhì)。

本研究從海底沉積物中共分離到了 34 株菌。對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵后，開展藥敏試驗(yàn)，分離到一株具有抗恥垢分枝桿菌 MC2155 的菌株 IMBGY10-46。

為了闡明菌株 IMBGY10-46 的生物學(xué)特性和分類地位，對(duì)該菌株開展鑒定。經(jīng) 16S rDNA 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株同Pseudomonas sabulinigriJ64的相似性最高，達(dá) 98.29%，認(rèn)定該菌株屬于假單胞菌屬。但由于其形態(tài)和基因組 DNA 的堿基組成差異較大，理化特性鑒定證實(shí)不能發(fā)酵葡萄糖，這與銅綠假單胞菌不同。與Pseudomonas sabulinigri不同的是，菌株 IMBGY10-46 過氧化氫酶陰性，說明 IMBGY10-46 很有可能屬于一個(gè)新菌株[10]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，該菌株與北極海水細(xì)菌R7078 這一分支內(nèi)的假單胞菌之間具有最近親緣關(guān)系（圖7）。次級(jí)代謝產(chǎn)物和功能基因分析為將來從海洋來源的假單胞菌中獲得抗分枝桿菌的天然活性物質(zhì)提供了新方向。菌株 IMBGY10-46 的發(fā)酵產(chǎn)物中具有抗分枝桿菌的活性成分，后續(xù)需要對(duì)該活性物質(zhì)進(jìn)行分離、純化和鑒定，為發(fā)現(xiàn)新型抗結(jié)核藥物先導(dǎo)化合物提供了菌株基礎(chǔ)。在假單胞菌屬中，Pseudomonas aeruginosa研究最多，由于該菌易形成極端耐藥并且可導(dǎo)致感染[12]。Pseudomonas sabulinigri菌曾被從海洋沉積物中分離出來過[10]，但是該類菌的生物學(xué)應(yīng)用研究至今未見報(bào)道。本文分離并鑒定了假單胞菌屬同Pseudomonas sabulinigri親緣關(guān)系更近的細(xì)菌，并揭示了該菌在抗分枝桿菌，尤其致病性結(jié)核分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群等致病菌的新藥開發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，也為基于該菌株和海洋微生物開發(fā)抗結(jié)核藥物奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖7 菌株 IMBGY10-46 的 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Figure 7 The 16S rDNA phylogenetic tree of the strain IMBGY10-46