李姣

摘 要：目的：評(píng)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用油脂中合成辣椒素含量的不確定度，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度，找出對(duì)不確定度影響最大的關(guān)鍵性因素。方法：依據(jù) CNAS-GL 006：2019 化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南和《測量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012），采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用油脂中合成辣椒素含量，建立不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型，通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制、樣品溶液的配制、測量重復(fù)性以及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合這4個(gè)方面引入的不確定度進(jìn)行分析，確定各個(gè)不確定度分量，得到擴(kuò)展不確定度。結(jié)果：按置信區(qū)間為95%，合成辣椒素含量為（0.374±0.044） ?g/kg，k=2。結(jié)論：測量結(jié)果的不確定度的主要來源是樣品測量重復(fù)性引入的，其次是標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的配制，其他分量引入的不確定度相對(duì)較小。

關(guān)鍵詞：食用油脂;合成辣椒素;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;不確定度

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of synthetic capsaicin content in edible oil by HPLC-tandem MS， improve the accuracy and credibility of the measurement results， and find out the key factors that have the greatest impact on the uncertainty.Methods： Synthetic capsaicin content in edible oils was determined by HPLC-tandem mass spectrometry according to CNAS-GL 006：2019 Guidelines for Evaluation of Uncertainty in Chemical Analysis and Evaluation and presentation of Measurement Uncertainty by JJF 1059.1—2012，establish a mathematical model of uncertainty evaluation， analyze the uncertainty introduced in standard solution preparation， sample solution preparation， measurement repeatability， and standard curve fitting， and determine each uncertainty component，get the extended uncertainty.Results： According to the 95% confidence interval， the synthetic capsaicin content is （0.374±0.044） ?g/kg， k=2. Conclusion： The main source of uncertainty in measurement results is the introduction of sample measurement repeatability， followed by the preparation of standard solution and sample solution， and the uncertainty introduced by other components is relatively small.

Keywords： edible oil and fats; synthetic capsaicin; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; uncertainty

辣椒作為常用的烹飪調(diào)料，在烹飪過程中被廣泛使用。因此，辣椒也成為我國人民飲食中最喜歡添加的調(diào)味料之一。調(diào)味料中合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素物質(zhì)因其結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，在烹飪過程中不容易被破壞并溶于油中，因而在廢棄食用油脂中通常會(huì)殘留這些成分，而正常食用油中幾乎不含辣椒素類的物質(zhì)。目前辣椒素以其使用范圍廣、熱穩(wěn)定性良好、脂溶性較好等特點(diǎn)成為食用油脂分辨研究檢測中的熱點(diǎn)[1-4]，也是檢測食用油質(zhì)量的重要方法。

我國是食用油消費(fèi)大國，食用油的安全問題已成為消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。國家市場監(jiān)督管理總局于2018年發(fā)布了《食用油脂中辣椒素的測定BJS 201801》。該方法可適用于食用油脂中辣椒素（天然辣椒素、合成辣椒素、二氫辣椒素）含量的測定，方法指出當(dāng)測定的樣品中辣椒素（合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素）總含量大于或等于1.0 ?g/kg時(shí)，該油脂樣品可能存在異常。

本文采用上述補(bǔ)充檢驗(yàn)方法測定食用油脂中合成辣椒素含量，并進(jìn)行不確定度評(píng)定。提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB Triple Quad 5500）;超聲清洗機(jī)（Elma Elmasonic P）;天平（梅特勒xp205，d=0.01 mg）;天平（梅特勒AE200，d=0.1 mg），渦旋混合儀（IKA MS3）;乙腈、甲醇（Fisher Chemical LC/MS）;甲酸（Fisher Chemical色譜純）;二氯甲烷（諾爾施公司色譜純）;氫氧化鈉、濃硫酸（成都科隆化學(xué)品公司優(yōu)級(jí)純）;一級(jí)水（美國密理博公司）。

固相萃取柱： Cleanert S C18-SPE ，1 000 mg/6 mL（天津博納艾杰爾科技有限公司）;合成辣椒素對(duì)照品（純度98%;編號(hào)：BWB52508;CAS號(hào)：2444-46-4;來源：北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院）;食用油脂（拉薩市某糧油加工店自制菜籽油）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 儀器條件

（1）色譜方法。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100 mm，1.7 ?m（Waters公司）;流速：0.3 mL/min;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：2 ?L;流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液（梯度洗脫）。

（2）質(zhì)譜方法。電離方式：電噴霧正離子模式;檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;霧化氣壓力：30 psi;離子噴霧電壓：5 000 V;干燥氣溫度：500 ℃;干燥氣流速：8 L/min;離子對(duì)294.1/137.1*，294.1/170.1;去簇電壓120 V，碰撞能量24 eV、13 eV。其中，*指定量離子。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g左右樣品于10 mL具塞塑料試管中，加入1 mL二氯甲烷，再加入3 mL 2%氫氧化鈉溶液，渦旋提取10 min，4 000 r/min離心10 min，取上層水相;殘留有機(jī)相再用3 mL 2%氫氧化鈉溶液重復(fù)提取1次，合并水相，再用稀硫酸溶液（V∶V=1∶15）調(diào)節(jié)pH至2～3后進(jìn)行固相萃取操作。C18 SPE小柱預(yù)先用3 mL乙腈淋洗3次，再用3 mL純水淋洗2次進(jìn)行活化，然后將調(diào)節(jié)完pH值的水相提取液加入小柱，控制流速至1～2滴/s，待全部溶液通過SPE小柱后，以3 mL超純水淋洗2次，棄去流出液，最終以3 mL乙腈洗脫2次。乙腈洗脫液50 ℃氮吹近干，用1.0 mL甲醇溶解后過微孔濾膜（0.22 ?m，有機(jī)相），供上機(jī)測定。

1.3 建立數(shù)學(xué)模型

樣品中合成辣椒素的計(jì)算公式為：

X=C×V/m（1）

式中：X-樣品中合成辣椒素的含量，?g/kg;C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品中合成辣椒素質(zhì)量濃度，ng/mL;V-樣品定容體積，mL;m-樣品取樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量不確定度的來源分析

食用油脂中合成辣椒素測量不確定度的來源包括：①標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制引起的不確定度urel（d）;②樣品溶液配制引起的不確定度urel（r）;③試樣重復(fù)測定時(shí)引入的不確定度urel（s）;④標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引起的不確定度urel（p）。

2.2 各不確定度分量的評(píng)定

2.2.1 不確定度傳播律

由于數(shù)學(xué)模型是線性模型，采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成公式為：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制引起的相對(duì)不確定度urel（d）

（1）標(biāo)準(zhǔn)品純度引起的相對(duì)不確定度urel（d1）。合成辣椒素對(duì)照品純度98%，純度標(biāo)準(zhǔn)偏差為2%。按均勻分布，包含因子k=。

（2）標(biāo)準(zhǔn)品稱量引起的相對(duì)不確定度urel（d2）。按照天平檢定證書和《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008），十萬分之一天平稱量范圍為0.01～5.00 g時(shí)，最大允許誤差為±0.05 mg，按均勻分布，包含因子k=，2次稱量后獲得標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（天平清零也帶來稱量不確定度）。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為10.80 mg。則：

（3）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋定容引起的相對(duì)不確定度urel（d3）。

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋定容引起的不確定度主要來源于玻璃量器和移液器。一般來說，玻璃量器引起的不確定度來源于允許誤差和溫度變化。按照檢定證書和《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006），容量為50 mL的容量瓶（A級(jí)）容量允許誤差為±0.05 mL，容量允許誤差引入的不確定度認(rèn)為是三角分布，包含因子k=，則：

由于液體的膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，故只考慮液體的體積膨脹，配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑為甲醇，甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 20/℃，實(shí)驗(yàn)室溫度

19 ℃和校正溫度20 ℃偏差1 ℃。因此，溫度偏差產(chǎn)生的體積增量為50 mL×0.001 20/℃×1℃=0.06 mL，假設(shè)體積變化服從三角分布，包含因子k=，則：

經(jīng)查《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）可知，移液器容量允許誤差和測量重復(fù)性誤差。100～1 000 ?L移液器容量最大允許誤差為1 000 ?L×1.0%=10 ?L=0.01 mL，容量允許誤差引入的不確定度認(rèn)為是三角分布，包含因子k=，則：

按照上述方法計(jì)算所用玻璃量器和移液器引入的不確定度，結(jié)果見表1。

稱取標(biāo)準(zhǔn)品10.80 mg，于50 mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到211.68 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到52.92 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液。稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備液得到濃度為0.105 84 ng/mL、0.211 68 ng/mL、1.058 40 ng/mL、5.292 00 ng/mL、10.584 00 ng/mL和21.168 00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。在此過程中，100～1 000 ?L移液器使用2次，20～200 ?L移液器使用6次。50 mL的容量瓶（A級(jí)）使用1次，25 mL的容量瓶（A級(jí)）使用1次，10 mL的容量瓶（A級(jí)）使用1次，1 mL的容量瓶（A級(jí)）使用6次。則由玻璃量器和移液器的使用引起的相對(duì)不確定度為：

綜合以上3個(gè)不確定度分量，標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制引起的相對(duì)合成不確定度為：

2.2.3 樣品溶液配制引起的相對(duì)不確定度urel（r）

（1）樣品稱量引起的不確定度。萬分之一天平稱量范圍為0.1～50 g時(shí)，最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布，包含因子k=，2次稱量后獲得樣品質(zhì)量（天平清零也帶來稱量不確定度）。樣品稱樣量為1 g（1 000 mg）。則樣品稱量引入的相對(duì)不確定度計(jì)算過程為：

（2）樣品定容引起的相對(duì)不確定度。移液器urel（V1）=0.004 590 6。綜合2個(gè)不確定度分量，樣品溶液配制引入的相對(duì)合成不確定度為：

2.2.4 試樣重復(fù)測定時(shí)引入的相對(duì)不確定度urel（s）

對(duì)本樣品中合成辣椒素進(jìn)行6次獨(dú)立測試，每個(gè)樣品重復(fù)測量2次。樣品中合成辣椒素含量重復(fù)性測定結(jié)果見表2。

因此，重復(fù)性測定引起的相對(duì)合成不確定度為：

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel（p）

采用6個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液測2次，按照外標(biāo)法擬合，得到線性方程

y=257 10.674 74x-2 700.849 23，其相關(guān)系數(shù)r=0.999 74。

標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。

因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度為：

式中：P-樣品溶液測量次數(shù);n-標(biāo)準(zhǔn)溶液的測量次數(shù);C-標(biāo)準(zhǔn)溶液平均濃度，ng/mL;C0-由曲線計(jì)算的樣品溶液濃度，ng/mL;B0-線性方程截距;B1-線性方程斜率;SR-擬合標(biāo)準(zhǔn)偏差;Cj-第j次測量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，ng/mL;Aj-第j次測量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。

故u（p）=0.001 493 6;

2.3 測量不確定度評(píng)定結(jié)果

合成辣椒素測定的各不確定度分量見表4。

食用油脂中合成辣椒素相對(duì)合成不確定度為：

樣品中合成辣椒素平均含量為0.374 ?g/kg，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u（X）= 0.058 73×0.374 =0.021 97 μg/kg

根據(jù)測量不確定度評(píng)估指南對(duì)一般檢測實(shí)驗(yàn)室要求[5]，在置信概率P=95%時(shí)，取k=2，因此擴(kuò)展不確定度為：U=k×u（X）=2×0.021 97=0.044 ?g/kg。

合成辣椒素含量X=（0.374±0.044） ?g/kg，k=2。

3 結(jié)論

由評(píng)定結(jié)果可知，測量結(jié)果的不確定度的主要來源是樣品測量重復(fù)性，其次是標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的配制，其他分量引入的不確定度相對(duì)較小。因此，在實(shí)際操作過程中，增加樣品測定次數(shù)，減少人為誤差是優(yōu)化不確定度的有效途徑。這要求檢驗(yàn)人員具備與檢驗(yàn)工作相適應(yīng)的操作水平，適當(dāng)增加對(duì)照品的稱樣量，盡量減少稀釋步驟，轉(zhuǎn)移、稀釋時(shí)使用檢定級(jí)別較高的玻璃量器，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)

[1]羅輝泰，黃曉蘭，吳慧勤，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速測定食用油中9種外源性雜質(zhì)成分[J].分析測試學(xué)報(bào)，2019，38（5）：532-538.

[2]劉詩瑤，吳文林，肖全偉，等.超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜快速篩查和定量檢測食用油脂中的天然辣椒素、合成辣椒素和二氫辣椒素[J].食品工業(yè)科技，2020，41（13）：256-263.

[3]呂曉涵，蔣錦琳，楊靜，等.基于特征波長建模的近紅外光譜技術(shù)檢測辣椒素含量[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，45（6）：760-766.

[4]吳娟，湯見平，薛元強(qiáng)，等.高效液相色譜-熒光檢測法快速檢測植物油中的辣椒素和二氫辣椒素[J].中國油脂，2020，45（12）：118-121.

[5]國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì).檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì) 認(rèn)定能力評(píng)價(jià) 檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)通用要求：RB/T 214—2017[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.