王亞月，賈方方，李俊營，許躍奇，閻海濤，何曉冰，劉冬梅，常 棟*

煙草黑脛病拮抗菌的篩選鑒定與防病促生作用研究

王亞月1，賈方方1，李俊營2，許躍奇2，閻海濤2，何曉冰2，劉冬梅1，常 棟2*

（1.商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院，植物與微生物互作河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘 476000；2.河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467000）

為獲取優(yōu)良黑脛病生防菌株，從大連海域生長(zhǎng)的海綿中分離到一株具有高拮抗活性的放線菌DL157，根據(jù)培養(yǎng)和顯微形態(tài)、生理生化數(shù)據(jù)及16S rRNA序列分析，鑒定DL157菌株為淺紫鏈霉菌（）。菌株DL157在平板對(duì)峙、盆栽試驗(yàn)與大田試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較高的抑菌活性，抑制率分別為60.28%、69.2%和83.5%。DL157菌株可以通過分泌蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶破壞煙草疫霉菌菌絲細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，致使其細(xì)胞壁受損，原生質(zhì)滲漏，進(jìn)而表現(xiàn)出抑制作用。DL157菌株可以促進(jìn)煙草種子萌發(fā)和幼根伸長(zhǎng)，提高萌發(fā)煙草種子可溶性蛋白含量與淀粉酶活性。此外，DL157菌株具有遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)過50次傳代培養(yǎng)，依然保持較高抑菌活性。綜上，淺紫鏈霉菌DL157具有開發(fā)為煙草黑脛病生防制劑的潛力。

煙草黑脛??；淺紫鏈霉菌；生防；促生

煙草黑脛?。═obacco black shack）是威脅煙草產(chǎn)量與質(zhì)量的一種嚴(yán)重的土傳性真菌病害，其病原菌為煙草疫霉菌（var.），該病極易在高溫、高濕環(huán)境下流行爆發(fā)，典型癥狀為植株矮化，葉片自下而上凋萎發(fā)黃，根部和莖部萎縮、壞死，莖髓部呈碟片狀[1]。在某些病害嚴(yán)重的地塊，其發(fā)病率高達(dá)75%以上，造成生產(chǎn)上大量減產(chǎn)，甚至絕收，給我國煙草產(chǎn)業(yè)帶來重大威脅[1-2]。

生產(chǎn)上，煙草黑脛病的防治包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治與生物防治措施。農(nóng)業(yè)防治通常采取間套作、輪作方式或者使用抗病品種。然而，其他種類植物的引入可能會(huì)降低煙葉品質(zhì)[3-5]，如大豆與茼蒿的引入雖然可提高煙葉中總氮和煙堿的含量，卻降低了總糖含量[3]?？篃煵莺诿劜》N質(zhì)性狀是由多基因控制，其轉(zhuǎn)育難度極大，且多為中抗或耐病品種，高抗品種甚少?；瘜W(xué)防治通常使用化學(xué)藥劑如甲霜靈、氟吡菌胺、霜霉威鹽酸鹽、烯酰嗎啉以及丁吡嗎啉等[6-9]，然而長(zhǎng)時(shí)間大面積重復(fù)施用同一種藥劑，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，防治效果逐漸降低，同時(shí)也會(huì)造成環(huán)境污染及農(nóng)藥在煙葉中的殘留。生物防治通過微生物產(chǎn)生抗生素等抗菌物質(zhì)來抑制病原菌的生長(zhǎng)，無毒害、無殘留、對(duì)環(huán)境友好，有利于維護(hù)生態(tài)平衡，保護(hù)物種多樣性，促進(jìn)綠色生態(tài)煙草農(nóng)業(yè)發(fā)展，在煙草病害防治中備受關(guān)注[1,10-11]。

煙草黑脛病的發(fā)生與根際土壤微生物有著緊密聯(lián)系，土壤中有益菌群數(shù)量的降低以及有害菌群數(shù)量的增加都會(huì)增加病害發(fā)生率。微生物菌劑可以提高土壤酶活性、改變土壤微生物菌群、改良土壤養(yǎng)分環(huán)境，從而調(diào)控土壤微生物群，改變其功能多樣性，進(jìn)而抑制作物病蟲害[12-13]。目前已開發(fā)的微生物菌劑生防菌多分離自陸生環(huán)境，因此導(dǎo)致其在鹽含量高的土壤中較難存活和發(fā)揮生物防治功能。海洋環(huán)境由于其壓強(qiáng)高、含鹽量高、營養(yǎng)成分少、溫度低等特點(diǎn)，使得生活在其中的放線菌的生理生化特征和代謝途徑與陸生放線菌有所差異，是新型農(nóng)用抗生素的重要來源，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中開發(fā)前景廣闊[14-15]。

本研究以煙草黑脛病的生物防治為主要目標(biāo)，從大連海域生長(zhǎng)的海綿中分離篩選獲得1株對(duì)煙草黑脛病防治效果較高的拮抗菌，通過微觀形態(tài)、生理生化特性、16S rRNA基因序列分析對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，研究該菌株對(duì)煙草黑脛病的防治效果，以期為煙草黑脛病的生物防治提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 拮抗菌種與病原菌的獲得 拮抗菌DL157菌株從大連海域新鮮海綿中分離獲得，純化后菌株于20%甘油中保存，?80 ℃保藏備用。煙草黑脛病病原菌分離于河南省平頂山市煙田的黑脛病患病煙株，保存于河南省植物與微生物互作平臺(tái)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[16]。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑 ISP2培養(yǎng)基：麥芽浸粉10 g，酵母粉4 g，葡萄糖4 g，加去離子水至1 L，調(diào)pH至7.2。胡蘿卜固體培養(yǎng)基：胡蘿卜200 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，自然pH。PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，調(diào)pH至7.2。無機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，(NH4)2SO42 g，CaCO33 g，MgSO4?7H2O 1 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，調(diào)pH至7.2。燕麥瓊脂培養(yǎng)基：燕麥片20 g，微鹽溶液1 mL，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，調(diào)pH至7.2。查氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，F(xiàn)eSO4?7H2O0.01 g，NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4?7H2O 0.05 g，KCl 0.5 g，瓊脂20 g, 加去離子水至1 L，調(diào)pH至7.2。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，調(diào)pH至7.2。全脂牛奶培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，瓊脂 2 g，加去離子水95 mL，滅菌后降至60 ℃時(shí)，加入5 mL無菌全脂牛奶，混合并調(diào)節(jié)pH至5.6。

1.2 拮抗活性測(cè)定

1.2.1 室內(nèi)平板對(duì)峙試驗(yàn) 采用平板對(duì)峙法測(cè)定DL157菌株對(duì)煙草黑脛病的抑菌活性。將煙草黑脛病病原菌在胡蘿卜培養(yǎng)基平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊（半徑5 mm），接種到胡蘿卜培養(yǎng)基平板中央，在菌塊4周離中心25 mm處對(duì)稱接種3 μL拮抗菌液（約1.0×108cfu/mL），倒置，每個(gè)處理重復(fù)3次，5 d后觀察抑菌結(jié)果，并測(cè)量其抑菌半徑，計(jì)算抑菌率[17]。

1.2.2 盆栽防效試驗(yàn) 將DL157菌株接種于ISP2液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，稀釋制成拮抗菌液（孢子濃度約1.0×108cfu/mL），采用灌根法每盆接種200 mL拮抗菌液，7 d后接種煙草黑脛病病原菌200 mL（孢子濃度約為1.0×108cfu/mL），此后每7 d接種拮抗菌液1次，共接種3次；對(duì)照組CK用清水處理，對(duì)照組CK1使用58%甲霜·代錳鋅可濕性粉劑600倍每株200 mL處理；對(duì)照組CK2以旺泰寶微生物菌劑（有效成分為哈茨木霉菌與棘孢木霉菌，菌含量≥2億/g）可濕性粉劑600倍每株200 mL處理；對(duì)照組CK3以碧苗復(fù)合微生物菌肥（有效成分為高活性微生物菌、次生代謝物及腐植酸）進(jìn)行處理。每處理8株，各處理重復(fù)3次，接種14 d后開始調(diào)查發(fā)病情況。煙草黑脛病分級(jí)參照中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 23222—2008）進(jìn)行[17]。

1.2.3 大田防效試驗(yàn) 大田防效試驗(yàn)在平頂山市白龍廟村進(jìn)行，該煙區(qū)自2018年來黑脛病頻繁發(fā)生，且為主要病害。煙株于2021年5月1日移栽，20 d后接種拮抗菌液孢子濃度約1.0×108cfu/mL，每株灌根200 mL，對(duì)照組CK、CK1、CK2與CK3設(shè)置同1.2.2。由于大田煙株生育期比盆栽煙株長(zhǎng)，故將大田接種時(shí)間間隔定為15 d，共灌根3次。每處理50株，共重復(fù)3次。接種14 d后開始調(diào)查發(fā)病情況。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 生理生化特征 參照《放線菌系統(tǒng)分類技術(shù)》[18]進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 16S rRNA鑒定 使用takara基因組提取試劑盒提取DL157基因組DNA，以16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和R1492（5'-CGGC-TACCTTGTT ACGAC-3'）進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系50 μL：PremixTap酶25 μL、模板1 μL、引物27f 1 μL、引物1492r 1 μL、重蒸水22 μL。PCR條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送天津金唯智測(cè)序。將測(cè)得序列在NCBI Genbank在線Blast，下載具有登錄號(hào)的相關(guān)同源序列，借助于MEGA5軟件以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 DL157菌株抑菌機(jī)理初步研究

1.4.1 DL157菌株對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影晌 分別挑取在正常培養(yǎng)基上和平板對(duì)峙試驗(yàn)中培養(yǎng)3 d的煙草疫霉菌邊緣菌絲于無菌離心管中，PBS緩沖液（pH 7.2，0.1 mol/L）沖洗，離心收集菌絲，用2.5%丙二醛固定2 h，PBS緩沖液洗滌3次后，依次用10%、30%、50%、75%、85%、90%與100%的乙醇分別脫水15 min，鋨酸熏3 ｈ，置于銅網(wǎng)噴金，于掃描電鏡下觀察[19]。

1.4.2 DL157菌株拮抗活性因子檢測(cè) 將DL157菌株接種于ISP2液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，12000 r/min，4 ℃離心10 min，獲得發(fā)酵液上清；離心沉淀用50 mmol/L KH2PO4- K2HPO4緩沖液（pH 7.5）重懸，置于冰浴中超聲，條件為300 W，工作5 s，間隙5 s，120個(gè)循環(huán)。12000 r/min離心30 min，收集上清，獲得細(xì)胞粗提物。

參照寧爽[20]蛋白酶活性測(cè)定方法，運(yùn)用全脂牛奶平板法檢測(cè)DL157菌株發(fā)酵液上清與細(xì)胞粗提物蛋白酶活性：在全脂牛奶平板中央打孔，每孔分別各自加入20 μL發(fā)酵液上清與細(xì)胞粗提物，密封，25 ℃靜置7 d，加入10%三氯乙酸固定2 h后，運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)G-250染色過夜，乙醇-冰乙酸脫色，通過計(jì)算菌落直徑與透明圈直徑的比值，定性比較發(fā)酵液上清與細(xì)胞破碎液蛋白酶活性高低，比值越低，蛋白酶活性越高。幾丁質(zhì)酶與纖維素酶活性分別運(yùn)用試維素酶活性檢測(cè)試劑盒（上海原鑫生物，YX-SH-TQ22025）與幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)試劑盒（上海原鑫生物，YX-W-B917）進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 DL157菌株對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響

1.5.1 DL157菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)的影響 分別用DL157菌株培養(yǎng)液原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸泡煙草種子24 h，于無菌培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第3天開始每隔12 h記錄一次發(fā)芽數(shù)（以根長(zhǎng)等于種子的長(zhǎng)或者芽長(zhǎng)等于種子長(zhǎng)的1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))），記錄到第6天結(jié)束。芽發(fā)齊后，轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d后測(cè)量根長(zhǎng)，根長(zhǎng)為從根基部到最長(zhǎng)根尖端的長(zhǎng)度。以無菌水處理為對(duì)照，每處理50粒種子，3個(gè)重復(fù)。

1.5.2 DL157菌株對(duì)種子萌發(fā)時(shí)可溶性蛋白含量和總淀粉酶活性的影響 分別用DL157菌株培養(yǎng)液原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸泡煙草種子24 h后，將種子置于無菌培養(yǎng)皿中，對(duì)照煙草種子采用無菌水處理，3個(gè)重復(fù)。25 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置，于發(fā)芽后第9天取0.5 g發(fā)芽種子，加入5 mL磷酸緩沖液（pH 6.9），充分磨勻，靜止30 min后，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃、12000 r/min離心10 min，收集所有上清，備用?？扇苄缘鞍缀窟\(yùn)用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，磷酸緩沖液作為空白處理[22]。淀粉酶活性運(yùn)用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定，磷酸緩沖液作為空白處理[21]。

1.6 DL157菌株傳代的抑菌穩(wěn)定性研究

拮抗菌株于ISP2培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，每48 h轉(zhuǎn)接１次，連續(xù)傳代50次，每個(gè)處理3個(gè)平行。平板對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)定初代菌株與傳代菌株對(duì)煙草疫霉菌的抑菌效果，根據(jù)抑菌帶寬度變化分析傳代對(duì)拮抗菌抑菌效果的影響。

2 結(jié) 果

2.1 煙草疫霉病拮抗菌株的篩選與抑菌作用

2.1.1 平板對(duì)峙試驗(yàn)抑菌效果 從大連海域海綿中分離獲得的6株拮抗菌，對(duì)煙草疫霉菌病原菌的抑制率達(dá)20%～60%。其中，菌株DL157拮抗效果最高，該菌株對(duì)煙草黑脛病的抑菌直徑達(dá)（48.22± 0.83）mm，抑制率達(dá)（60.28±1.04）%（圖1）。

2.1.2 盆栽與大田防效 在盆栽試驗(yàn)中，與對(duì)照CK相比，化學(xué)藥劑甲霜錳鋅、生防菌肥碧苗和生防菌劑旺泰寶與DL157菌液處理的煙株發(fā)病率分別降低28.2、27.4、10.4、48.4百分點(diǎn)，病情指數(shù)分別降低24、2.5、4.1、39.6；且經(jīng)DL157處理后的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)均低于甲霜錳鋅、碧苗和旺泰寶。DL157防效分別是甲霜錳鋅、碧苗與旺泰寶的1.6、15.7與9.6倍（表1）。

在大田中，與CK相比，甲霜錳鋅、碧苗、旺泰寶與DL157菌液處理的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)均降低，發(fā)病率分別降低4.7、4.8、5.4、8.6百分點(diǎn)，病情指數(shù)分別降低2.2、3.2、3.3、5.6；且經(jīng)DL157處理后的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)均低于甲霜錳鋅、碧苗和旺泰寶。DL157防效分別是甲霜錳鋅、碧苗與旺泰寶的2.5、1.8和1.7倍（表1）。

2.2 菌株DL157的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 菌株DL157菌落為圓形，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺，白色粗糙不透明，菌落中央凹狀突起，氣生菌絲發(fā)達(dá)（圖2）。顯微鏡下觀察，菌絲長(zhǎng)直，孢子呈卵圓與橢圓形（圖3）。

圖1 DL157菌株對(duì)煙草疫霉菌的拮抗效果

表1 DL157菌株盆栽和大田防效

注：表中每列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異顯著（≤0.05），下同。

Note: value within each column of the same cultivar not marked by the same lowercase letters signifies significant difference (≤0.05), the following tables are the same.

圖2 DL157菌株菌落形態(tài)

圖3 DL157菌株顯微鏡觀察圖

2.2.2 培養(yǎng)特征 表2為菌株DL157在查氏瓊脂培養(yǎng)基、無機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基、酵母膏麥芽汁培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征。在不同培養(yǎng)基中，氣生菌絲與基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)不同，產(chǎn)生的可溶性色素亦不同。

表2 菌株DL157在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

2.2.3 生理生化特征 如表3所示，菌株DL157能夠利用葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖等碳源，但不能利用羧甲基纖維素鈉。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》與《放線菌的分類和鑒定》，結(jié)合DL157在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)與顯微鏡下觀察的結(jié)果，初步確定DL157菌株為鏈霉菌（）。

2.2.4 分子鑒定 將測(cè)得的序列經(jīng)blast比對(duì)，下載具有登錄號(hào)的相關(guān)同源序列，借助于MEGA5軟件以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果表明該菌株與EGI125菌株同聚一支，且同源性達(dá)99%，進(jìn)一步確定DL157菌株為淺紫鏈霉菌（）。

表3 菌株DL157生理生化特征

注：“+”陽性；“–”陰性。

Note: “+”, positive; “–“, negative.

圖4 DL157菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 DL157菌株抑菌機(jī)理

2.3.1 DL157菌株對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響 如圖5所示，經(jīng)掃描電鏡觀察，正常生長(zhǎng)的煙草疫霉菌絲形態(tài)飽滿，細(xì)胞壁光滑，胞質(zhì)均勻透明，分枝正常（圖5A和5B），而平板對(duì)峙培養(yǎng)中受抑制菌落邊緣的菌絲形態(tài)與對(duì)照相比發(fā)生很大的變化，菌絲出現(xiàn)纏繞，扭曲集結(jié)，不正常分枝增多，皺縮（圖5C和5D），部分菌絲細(xì)胞壁不完整（圖5E），原生質(zhì)滲漏，菌絲細(xì)胞畸形生長(zhǎng)（圖5F），說明DL157菌株或其分泌物對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響。

注：A（×1000）與B（×5000）為正常菌絲；C（×2000）與D（×10000）為受抑制菌絲扭曲集結(jié)形態(tài)；E為受抑制菌絲細(xì)胞壁裂解狀態(tài)（×5000）；F為受抑制菌絲畸形生長(zhǎng)（×10000）。

2.3.2 DL157菌株拮抗活性因子 在DL157菌株發(fā)酵液上清與細(xì)胞粗提物中均檢測(cè)出蛋白酶、幾丁質(zhì)酶與纖維素酶活性，且發(fā)酵液上清酶活性均高于細(xì)胞粗提物，分別是其8、1.7和1.1倍（表4）。

2.4 DL157菌株對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響

2.4.1 DL157菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)的影響 煙草種子經(jīng)水和DL157菌株發(fā)酵原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸種處理后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)芽率均呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，其中第3天發(fā)芽率最高（圖6）。與水浸種處理（CK）相比，煙草種子經(jīng)DL157菌液浸種處理后發(fā)芽率均有所提高，其中經(jīng)原液處理的煙草種子發(fā)芽率最高，第1、2、3天發(fā)芽率分別為66.7%、74.7%與85.3%，與CK相比分別提高1.3、1.3和1.4倍。如圖7所示，煙草種子經(jīng)DL157菌株發(fā)酵原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸種處理后，根長(zhǎng)分別為0.80、0.77和0.65 cm，與對(duì)照組相比分別提高2.1、2.0和1.7倍。綜上可知，DL157不同濃度培養(yǎng)液浸種處理對(duì)煙草種子萌發(fā)和幼根的伸長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

表4 拮抗因子活性

注：37 ℃條件下，每小時(shí)催化底物產(chǎn)生1 mg產(chǎn)物所需要的酶量定義為為1個(gè)活力單位U。

Note: At 37 ℃, the amount of enzyme required to produce 1 mg of product from the catalytic substrate per hour is defined as 1 U.

注：圖中不同字母代表不同處理間差異顯著（p≤0.05），下同。

圖7 DL157菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)根長(zhǎng)的影響

2.4.2 DL157菌株對(duì)種子萌發(fā)時(shí)可溶性蛋白含量和總淀粉酶活性的影響 如圖8所示，煙草種子經(jīng)DL157菌株發(fā)酵原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸種處理后，其幼苗可溶性蛋白含量分別為18.3、10.0和7.6 mg/g，與CK相比，原液與10倍稀釋液分別提高2.5與1.4倍，而100倍稀釋液處理與對(duì)照相當(dāng)。表明DL157發(fā)酵液濃度較高時(shí)可以提高萌發(fā)煙草種子可溶性蛋白含量，濃度較低時(shí)不能提高。

圖8 DL157菌株萌發(fā)煙草種子可溶性蛋白含量的影響

煙草種子經(jīng)DL157培養(yǎng)液浸種處理后，其淀粉酶活性變化不一。與對(duì)照組水浸種處理相比，原液處理后淀粉酶活性降低10%，10倍稀釋液與100倍稀釋液處理后淀粉酶活性分別提高1.1倍與1.4倍（圖9）。

注：25 ℃條件下，每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μmol產(chǎn)物所需要的酶量定義為1個(gè)活力單位U。

2.5 DL157菌株傳代穩(wěn)定性

拮抗菌株DL157經(jīng)過50次傳代，抑菌率與第1代抑菌率相當(dāng)（表5），表明經(jīng)過多次傳代，菌種依然沒有退化，傳代次數(shù)并不影響拮抗菌株的抑菌穩(wěn)定性。

表5 DL157菌株傳代穩(wěn)定性

3 討 論

生物防治中，放線菌是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值的微生物，是抗生素的重要來源，由于其對(duì)生態(tài)環(huán)境影響小、污染少等特點(diǎn)，在植物病害防控中，應(yīng)用較普遍，尤其是鏈霉菌屬。如從煙草根際土壤分離的魯薩鏈霉菌（）YY75菌株、高貴鏈霉菌（）YY124菌株、婁徹鏈霉菌（）LN204菌株、珊瑚鏈霉菌（）SX92菌株、金黃垂直鏈霉菌（）SX59菌株、波卓鏈霉菌（）F-7菌株、金黃垂直鏈霉菌（）SA74菌株與黃麻鏈霉菌（）AUH-1菌株在平板對(duì)峙試驗(yàn)中對(duì)煙草疫霉菌的抑菌率都高于70%[22-25]；不產(chǎn)色鏈霉菌（）F8菌株對(duì)煙草黑脛病的盆栽防效達(dá)70.3%[26]，郝氏鏈霉菌（）MT35菌株的田間試驗(yàn)防治效果高達(dá)75.3%[27]。放線菌種類多樣，分布于土壤、污水、海洋等生態(tài)環(huán)境中，不同生境來源的放線菌代謝功能各異。目前分離的用于煙草黑脛病防治的放線菌多從土壤中分離，且很多放線菌僅限于室內(nèi)平板研究，僅有少數(shù)利用盆栽與大田試驗(yàn)驗(yàn)證。相比于陸生微生物，海洋惡劣的化學(xué)和物理?xiàng)l件更有利于生活在其中的微生物產(chǎn)生大量新分子，這些分子在多樣性、結(jié)構(gòu)和功能特征方面表現(xiàn)出優(yōu)良特性，是農(nóng)用新型先導(dǎo)化合物的重要來源[28-29]。本文中DL157菌株分離自海洋環(huán)境，在田間試驗(yàn)中防效高達(dá)83.5%，高于目前陸生來源放線菌的防治效果。DL157菌株可以通過分泌蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶破壞煙草疫霉菌菌絲細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，致使細(xì)胞壁受損，原生質(zhì)滲漏，進(jìn)而表現(xiàn)出抑制作用，這與在不產(chǎn)色鏈霉菌（）F8菌株中觀察到的現(xiàn)象一致[26]，然而DL157菌株是否產(chǎn)生其他抑菌活性物質(zhì)仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究中分離的淺紫鏈霉菌DL157菌株對(duì)煙草黑脛病表現(xiàn)出較高防效，該菌株可以分泌蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶而影響煙草疫霉菌菌絲的生長(zhǎng)。此外，DL157菌株可以促進(jìn)煙草種子的萌發(fā)和幼根的伸長(zhǎng)，提高萌發(fā)煙草種子中可溶性蛋白含量與淀粉酶活性，具有遺傳穩(wěn)定性，為煙草黑脛病的生物防治提供優(yōu)良的菌種資源。

[1] GUO D S, YUAN C H, LUO Y Y, et al. Biocontrol of tobacco black shank disease () byBa168[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2020, 165(104523): 1-10.

[2] 易龍，邱妙文，陳永明，等. 煙草黑脛病的生物防治研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，33（25）：146-151.

YI L, QIU M W, CHEN Y M, et al. Advances in biological control of tobacco black shank[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2017, 33(25): 146-151.

[3] 張得智. 輪作和間作對(duì)烤煙KRK26生長(zhǎng)狀況及產(chǎn)質(zhì)量的影響研究[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

ZHANG D Z. Studies on the effects of rotation and intercropping to growth yield and characteristics of cured tobacco variety KRK26[D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2012.

[4] 徐銳，陳明，王曉麗，等. 我國烤煙間套作種植效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（1）：24-26.

XU R, CHEN M, WANG X L, et al. Progress of research on intercropping effect of flue-cured tobacco in China[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2020, 48(1): 24-26

[5] 劉冰冰，郭書賢，陳興，等. 烤煙K326與香料植物間作模式下根際土可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及功能[J]. 微生物學(xué)通，2020，47（8）：2436-2449.

LIU B B, GUO S X, CHEN X, et al. Diversity and function of culturable rhizospheric bacteria of flue-cured tobacco K326 intercropped with five spice plants[J]. Microbiology China, 2020, 47(8): 2436-2449.

[6] 李文志，龍友華，莫飛旭，等. 噁唑菌酮·霜脲氰對(duì)煙草黑脛病病菌的室內(nèi)毒力及田間防效[J]. 中國植保導(dǎo)刊，2020，40（7）：78-81.

LI W Z, LONG Y H, MO F X, et al. Control effects of famoxadone 22.5%+cymoxanil 30% WG on tobacco black shank[J]. China Plant Protection, 2020, 40(7): 78-81.

[7] 王忠宇，張承，張崇德，等. 18.7%烯?！み吝蝓ニ稚⒘?duì)煙草黑脛病的防治效果[J]. 農(nóng)藥，2020，59（1）：65-67.

WANG Z Y, ZHANG C, ZHANG C D, et al. Control effects of dimethomorph pyraclostrobin 18.7% WG on tobacco black shank[J]. Agrochemicals, 2020, 59(1): 65-67.

[8] 任曉芬，亓文哲，程星凱，等. 氟菌·霜霉威對(duì)煙草黑脛病的防效及其對(duì)煙株生長(zhǎng)的影[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2018，24（4）：129-134.

REN X F, QI W Z, CHENG X K, et al. The control efficacy of fluopicolide · propamocarb hydrochloride to tobacco black shank and its effects on tobacco growth[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2018, 24(4): 129-134.

[9] 李慧，姜濱，黃擇祥，等. 3種農(nóng)藥在土壤-煙株系統(tǒng)中的遷移降解特征[J]. 中國煙草科學(xué)，2021，42（5）：63-68.

LI H, JIANG B, HUANG Z X, et al. The migration and degradation characteristics of three pesticides in the soil-tobacco plant system[J]. Chinese Tobacco Science, 2021, 42(5): 63-68.

[10] 李苗苗，張家韜，崔傳斌，等. 三株芽孢桿菌的生防特性研究[J]. 中國煙草科學(xué)，2020，41（4）：80-89.

LI M M, ZHANG J T, CUI C B, et al. Study on biocontrol characteristics of threestrains[J]. Chinese Tobacco Science, 2020, 41(4): 80-89.

[11] 李小杰，李成軍，姚晨虓，等. 拮抗煙草疫霉菌的木霉菌株篩選鑒定及防病促生作用研究[J]. 中國煙草科學(xué)，2020，41（3）：65-70.

LI X J, LI C J, YAO C X, et al. Screening, identification of antagonisticspp. against tobacco black shank and its growth promotion effect on tobacco[J]. Chinese Tobacco Science, 2020, 41(3): 65-70.

[12] 李苗苗，王曉強(qiáng)，王東坤，等. 生防菌復(fù)配對(duì)煙草黑脛病的防治效果研究[J]. 中國煙草科學(xué)，2020，41（2）：32-38.

LI M M, WANG X Q, WANG D K, et al. Effect of biocontrol agents mixture on control of tobacco black shank[J]. Chinese Tobacco Science, 2020, 41(2): 32-38.

[13] 張維，刁朝強(qiáng)，李斌，等. 復(fù)配拮抗菌FP246對(duì)煙草黑脛病和根際土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 煙草科技，2019，52（7）：10-17.

ZHANG W, DIAO C Q, LI B, et al. Effects of combinatory antagonistic bacteria FP246 on tobacco black shank and functional diversity of rhizosphere soil microbial communities[J]. Tobacco Science and Technology, 2019, 52(7): 10-17.

[14] JAGANNATHAN S V, MANEMANN E, ROWE S, et al. Marine actinomycetes, new sources of biotechnological products[J]. Marine Drugs, 2021, 19(7): 365-394.

[15] KONG Q. Marine microorganisms as biocontrol agents against fungal phytopathogens and mycotoxins[J]. Biocontrol Science and Technology, 2017, 28(1): 1-17.

[16] 常棟，顧建國，賈方方，等. 煙草黑脛病不同植物源生防菌的篩選及防效測(cè)定[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2020，26（3）：84-90.

CHANG D, GU J G, JIA F F, et al. Screening and control efficacy of different plant-derived biocontrol bacteria against tobacco black shank disease[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2020, 26(3): 84-90.

[17] 國家煙草專賣局. 煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法：GB/T 23222—2008[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

State Tobacco Monopoly Administration. Grade and investigation methods of tobacco diseases and insect pests: GB/T 23222—2008 [S]. Beijing: Standards Press of China, 2008.

[18] 關(guān)統(tǒng)偉，張小平，高貝樂，等. 放線菌系統(tǒng)分類技術(shù)[M]. 1版，北京：化學(xué)化工出版社，2016.

GUAN T W, ZHANG X P, GAO B L, et al. Classification technology of actinomycetes[M]. 1st Edition. Beijing: Chemical Industry Press, 2016.

[19] 陳娟妮，魯梅，丁偉，等. 納米氧化鋅對(duì)煙草疫霉菌的抑菌作用研究[J]. 植物醫(yī)生，2021，34（2）：34-40.

CHEN J N, LU M, DING W, et al. Study on the antifungal effect of zinc oxide nanoparticles on[J]. Plant Doctor, 2021, 34(2): 34-40.

[20] 寧爽. 內(nèi)生假單胞菌BTa14、Bar25促生抗病作用及機(jī)理的研究[D]. 煙臺(tái)：煙臺(tái)大學(xué)，2016.

NING S. Study on the growth-promoting, disease-resistance effects and mechanisms of endophyticBTa14 and Bar25[D]. Yantai: Yantai University, 2016.

[21] 董國菊. 熒光假單胞菌P-72-10菌株對(duì)煙草黑脛病的生防機(jī)理研究[D]. 北碚：西南大學(xué)，2012.

DONG G J. Study on the biocontrol mechanism ofP-72-10 against tobacco black shank disease[D]. Beibei: Southwest University, 2012.

[22] 陳奇園，丁鑰琪，趙世民，等. 洛陽煙區(qū)煙株根圍抗煙草疫霉放線菌的篩選與鑒[J]. 煙草科技，2019，52（1）：22-28.

CHEN Q Y, DING Y Q ZHAO S M, et al. Screening and identification of antagonistic actinomycetes againstfrom rhizospheric soils in Luoyang tobacco-growing areas[J]. Tobacco Science & Technology, 2019, 52(1): 22-28.

[23] 黃大躍. 煙草疫霉生防菌的篩選及鑒定[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2020（18）：104-106.

HUANG D Y. Screening and identification of biocontrol bacteria aganst[J]. Modern Agricultural Science and Technology, 2020(18): 104-106.

[24] YANG Y, ZHANG S W, LI K T. Antagonistic activity and mechanism of an isolatedstain AUH-1 against phytopathogenic fungi[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2019, 35(145): 1-9.

[25] 陳倩倩，邊傳紅，康業(yè)斌，等. 一株農(nóng)用拮抗放線菌的分離與鑒定[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2018，24（6）：134-139.

CHEN Q Q, BIAN C H, KANG Y B, et al. Isolation and identification of a strain of agricultural antagonistic actinomycete[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2018, 24(6): 134-139.

[26] 王靜，孔凡玉，張成省，等. 放線菌F8對(duì)煙草黑脛病的拮抗作用及其產(chǎn)酶活性[J]. 中國煙草科學(xué)，2013，34（2）：49-53.

WANG J, KONG F Y, ZHANG C S, et al. Antagonism effect and enzyme-producing comparison ofF8 against tobacco black shank[J]. Chinese Tobacco Science, 2013, 34(2): 49-53.

[27] 鄒朔飛，董祥立，李繼業(yè)，等. 煙草黑脛病拮抗鏈霉菌篩選及田間防效試驗(yàn)[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2021，40（2）：49-53.

ZOU S F, DONG X L, LI J Y, et al. Screening of antagonisticstrain against tobacco black shankand control effect trialin field[J]. Journal of Mountain Agriculture and Biology, 2021, 40(2): 49-53.

[28] CAPISTRAN L L, RODRIGUEZ R Z, CERVANTES T C, et al. Efficiency of marine bacteria and yeasts on the biocontrol activity ofin ancho-type pepper seedlings[J]. Agronomy, 2020, 10(408): 1-12.

[29] EL-AMRAOUI B, EL-AMRAOUI M, COHEN N, et al. Antifungal and antibacterial activity of marine microorganisms[J]. Annales Pharmaceutiques Fran?aises, 2014, 72(2): 107-111.

Screening, Identification of a Bacterial Strain against Tobacco Black Shank and Its Growth-promoting Effects

WANG Yayue1, JIA Fangfang1, LI Junying2, XU Yueqi2, YAN Haitao2, HE Xiaobing2, LIU Dongmei1, CHANG Dong2*

(1. Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions, Department of Biology and Food Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu, Henan 476000, China; 2. Pingdingshan Tobacco Company of Henan Tobacco Monopoly Bureau, Pingdingshan, Henan 467000, China)

To acquire excellent bacterial strains against tobacco black shack (TBS) disease, an actinobacteria DL157 with high antagonistic activity was isolated from marine sponge. Strain DL157 was identified asby morphologic observation, physiological and biochemical characterization and 16S rRNA sequence analysis. High relative control efficiency was observed in plate test, pot test and field test, with the inhibition rates being 60.28%, 69.2% and 83.5%, respectively. The hyphae cell wall structure ofwere destroyed by strain DL157 through secreting protease, cellulase and pectinase, causing cell wall damage and protoplasm leakage. Therefore, the growth ofwas inhibited. The seed germination and root growth of tobacco were promoted by strain DL157. And the soluble protein content and amylase activity of germinated tobacco seeds were increased. Moreover, genetic stability was observed in strain DL157 which still maintained high antagonistic activities after 50 passages. In summary,DL157 has the potential to be applied as antimicrobial agents against TBS disease.

tobacco black shack disease;; biological control; growth promoting

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.009

S435.72

A

1007-5119（2022）06-0060-08

河南省煙草公司平頂山市公司科技項(xiàng)目（PYKJ202101）；河南省青年人才托舉工程資助項(xiàng)目（2020HYTP024）；國家級(jí)青年人才托舉工程資助項(xiàng)目（2017QNRC001）

王亞月（1990-），女，講師，博士，主要從事農(nóng)作物病害的生物防治、環(huán)境中有毒污染物的生物降解以及酶構(gòu)效關(guān)系與酶分子進(jìn)化研究。E-mail：wangyayue@sqnu.edu.cn。

，E-mail：cd411@outlook.com

2022-03-20

2022-08-16