賈海江，馮俊喜，吳 濤，張 鑫，孫 瞳，胡希好，王 鵬，李 振，程亞?wèn)|，程昌新，李貴忠，曾祥難*，周肇峰*

生物炭菌劑對(duì)煙草黑脛病及土壤微生物的影響

賈海江1，馮俊喜2，吳 濤3，張 鑫4，孫 瞳2，胡希好5，王 鵬5，李 振4，程亞?wèn)|4，程昌新3，李貴忠3，曾祥難1*，周肇峰1*

（1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，南寧 530001；2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，濟(jì)南 250014；3.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，昆明 650231；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；5.山東青島煙草有限公司，青島 266000）

為研究生物炭菌劑對(duì)煙草黑脛病的防控效果并揭示其聯(lián)合生防機(jī)制，以生物炭為載體負(fù)載解淀粉芽孢桿菌CAS02制備生物炭菌劑，并對(duì)其負(fù)載效果進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，以易感品種“小黃金1025”為試驗(yàn)材料，研究不同處理生物炭菌劑對(duì)煙草黑脛病的防控效果，并從土壤化學(xué)性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)組成的角度解析相關(guān)作用機(jī)理。結(jié)果表明：（1）生物炭可以有效負(fù)載生防菌CAS02，負(fù)載量為25.31×108CFU/g；（2）單獨(dú)施用生防菌CAS02對(duì)煙草黑脛病的防控效果，在施藥25 d后下降至2.08%，而生物炭菌劑對(duì)煙草黑脛病防控高效且持久，在第25天時(shí)仍可維持43.75%的相對(duì)防效；（3）施用生物炭菌劑顯著改變了根際土壤化學(xué)性質(zhì)，BC-CAS02處理的根際土壤速效磷含量較CK提高了49.58%，而速效鉀含量降低了17.39%；（4）通過(guò)對(duì)比各處理16 S V3-V4區(qū)域擴(kuò)增子序列可知，生物炭菌劑顯著改變了土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，屬水平上WCHB1-32、和等抑制植物病害的有益細(xì)菌相對(duì)豐度顯著增加。綜上所述，生物炭菌劑可通過(guò)改善根際土壤化學(xué)性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)組成，有效提高煙草黑脛病的防控效果。

生物炭；生防菌；煙草黑脛病；土壤微生物

煙草黑脛?。═obacco Black Shank）又稱(chēng)煙草疫病，是由煙草疫霉（）引起的一種毀滅性土傳病害[1-2]。目前生產(chǎn)上防治煙草黑脛病主要以甲霜靈等化學(xué)藥劑為主，但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性、煙葉農(nóng)藥殘留量過(guò)高和環(huán)境污染等一系列問(wèn)題[3-4]。生防菌的開(kāi)發(fā)應(yīng)用為防控?zé)煵萃羵鞑『μ峁┝诵碌氖侄?，一些生防菌在控制植物病害方面的有效性得到了認(rèn)可[5-6]。然而生產(chǎn)上推廣的生防菌產(chǎn)品存在菌種單一，生防菌施入土壤后定殖和存活能力不高，生防效率低和抗病譜狹窄等問(wèn)題，極大地限制了生防菌的實(shí)際推廣和應(yīng)用[7]。生物炭是生物質(zhì)在有限的氧氣下高溫?zé)峤狻⑻炕傻囊环N穩(wěn)定、高芳香的固體材料[8]，由于其獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，不僅可以改善土壤結(jié)構(gòu)，還可以為生防菌提供養(yǎng)分和生存環(huán)境，增強(qiáng)生防菌在土壤環(huán)境中的存活能力，是一種很有開(kāi)發(fā)前景的載體材料[9]。CHUAPHASUK等[10]研究發(fā)現(xiàn)，將生防菌負(fù)載到生物炭中可以提高生防菌對(duì)環(huán)境脅迫的抗性，并保護(hù)生防菌免受其他土壤微生物的侵害；ELHADIDY等[11]證實(shí)了以生物炭為接種載體制備的固定化菌劑，可顯著提高番茄枯萎病的防治效果。由此可見(jiàn)，開(kāi)發(fā)利用生物炭作為接種載體，對(duì)防治煙草土傳病害具有重要意義，但目前相關(guān)研究甚少。

本試驗(yàn)以花生殼為原料，制備生物炭并表征其性質(zhì)，然后將生物炭作為生防菌CAS02的接種載體制備生物炭菌劑。研究了生物炭菌劑對(duì)煙草黑脛病的防治效果，并從土壤化學(xué)性質(zhì)及土壤微生物的角度揭示了生物炭菌劑的作用機(jī)理，為生物炭菌劑制備和煙草黑脛病綠色防治提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及制備

供試生防菌株為解淀粉芽孢桿菌CAS02（），病原菌為煙草疫霉JM01（），煙草品種為煙草黑脛病易感品種小黃金1025，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。燕麥培養(yǎng)基（OA）用于煙草疫霉培養(yǎng)，NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基用于生防菌CAS02培養(yǎng)。

生物炭的制備：根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法，以花生殼為原料，采用限氧升溫法在500 ℃下熱裂解4 h制備生物炭，并研磨過(guò)篩（2 mm）。制備的花生殼生物炭pH為9.90，呈堿性，最大持水量為72.3%，全氮、速效磷、速效鉀、全碳和全氫含量分別為0.96%、33.58 mg/kg、7.71 mg/kg、16.06%和0.84%。通過(guò)掃描電鏡觀察生物炭形貌特征[13-14]。

生物炭菌劑的制備：將2 g（稱(chēng)準(zhǔn)至0.0001 g）生物炭與25 mL CAS02重懸菌液（600值為0.4）于搖床中（28 ℃，175 r/min）混合振蕩吸附24 h；通過(guò)吸附試驗(yàn)法[14]和掃描電鏡觀察[15]評(píng)價(jià)生物炭對(duì)CAS02菌株的負(fù)載效果。

1.2 生物炭菌劑防治煙草黑脛病盆栽試驗(yàn)

根據(jù)王耀晨等[15]的方法制備菌谷，并與取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨基地大田的土壤按照菌谷∶土壤的質(zhì)量比1∶100混合；挑選株高2 cm、葉片數(shù)量為5的煙苗，移栽至裝有200 g土壤的花盆（上直徑10 cm、高11 cm）中，設(shè)置CK（添加病原菌，每株2 g菌谷根部接種）、BC（添加病原菌+2 g生物炭）、CAS02（添加病原菌+25 mL600值為0.4的生防菌CAS02懸浮液灌根處理）和BC-CAS02（添加病原菌+2 g生物炭菌劑）4個(gè)處理，每個(gè)處理種植15株煙苗，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。于移栽后第10天和第25天根據(jù)《煙草病害分級(jí)及調(diào)查方法》（GB/T 23222—2008）調(diào)查各處理煙株的黑脛病病情指數(shù)，并于第25天測(cè)量煙株的株高、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、最大葉面積、節(jié)距和葉片數(shù)。

1.3 土壤樣品采集及測(cè)定

移栽后第25天采集不同處理煙株根際土[16]。其中一部分根際土置于?80 ℃超低溫冰箱，用于測(cè)定土壤微生物；一部分自然風(fēng)干后過(guò)0.25 mm篩，用于測(cè)定土壤樣品化學(xué)性質(zhì)[17]。

1.4 高通量測(cè)序分析微生物群落

采用DNeasy? PowerSoil? Kit（100）試劑盒提取土壤DNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)[15]。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)并完成基于Illumina MiSeq平臺(tái)的測(cè)序[17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用FLASH軟件對(duì)Reads進(jìn)行拼接，使用Uparse軟件在相似性為97%的水平下對(duì)優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)。對(duì)比silva數(shù)據(jù)庫(kù)（細(xì)菌）并對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋及豐度分析。采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Duncans新復(fù)極差法，=0.05），并采用Adobe illustrator軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 生物炭及菌劑的表征分析

由圖1A可見(jiàn)，花生殼炭化過(guò)程完好地保留了原生物質(zhì)的細(xì)微孔隙結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了生物炭的吸附能力；掃描電子顯微鏡對(duì)生物炭負(fù)載CAS02的定性評(píng)價(jià)結(jié)果如圖1B，可以清晰地看出CAS02負(fù)載于生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)中，且生物炭菌劑的負(fù)載量為25.31×108CFU/g，生物炭較好地發(fā)揮了載體的作用。

2.2 生物炭菌劑對(duì)煙草黑脛病的防治效果

由表1可知，處理后第10天BC-CAS02處理對(duì)煙草黑脛病的相對(duì)防效為37.84%，顯著高于BC處理，但與CAS02處理無(wú)顯著差異；而處理后第25天CAS02處理對(duì)煙草黑脛病的相對(duì)防效下降至2.08%，BC-CAS02處理對(duì)煙草黑脛病的相對(duì)防效為43.75%，顯著高于其他處理。由此可見(jiàn)，生物炭菌劑對(duì)煙草黑脛病的防治效果，比單獨(dú)施用CAS02更為長(zhǎng)效。

2.3 生物炭菌劑對(duì)煙草生長(zhǎng)的調(diào)控作用

生物炭菌劑對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育的影響如表2所示，處理后第25天，BC-CAS02處理最大葉長(zhǎng)及最大葉面積顯著高于其他處理，分別較CK提高22.27%和25.20%，最大葉寬顯著高于CAS02及BC處理，但與CK無(wú)顯著差異，這表明生物炭菌劑對(duì)煙株具有一定促進(jìn)生長(zhǎng)作用。

注：圖A（a）、(b)、（c）為生物炭負(fù)載CAS02前掃描電鏡形貌；圖B（a）、(b)、（c）為生物炭負(fù)載CAS02后掃描電鏡形貌。

表1 盆栽防病試驗(yàn)結(jié)果

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示處理間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≤0.05），下同。

Note: the different lowercase letters of the same column represent statistically significance (≤0.05). The same as below.

2.4 生物炭菌劑對(duì)煙株根際土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

生物炭菌劑對(duì)煙株根際土壤的化學(xué)性質(zhì)造成了一定的影響（表3）。BC-CAS02處理的土壤pH顯著高于CK，銨態(tài)氮含量顯著低于CK和CAS02處理而高于BC處理，速效磷含量顯著高于其他處理且較CK、BC和CAS02處理分別提高49.58%、39.27%和36.61%，而速效鉀含量顯著低于其他處理，較CK降低了17.39%。各處理硝態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)含量均無(wú)顯著差異。

2.5 生物炭菌劑對(duì)根際土壤微生物的影響

2.5.1 生物炭菌劑對(duì)根際土壤微生物結(jié)構(gòu)的影響本研究采用Bray-Curtis距離矩陣主坐標(biāo)分析（PCoA）比較了不同處理?xiàng)l件下根際土壤細(xì)菌群落屬水平的變化（圖2a），BC、CAS02和BC-CAS02處理的聚類(lèi)結(jié)果明顯遠(yuǎn)離CK，且BC和BC-CAS02處理的土壤細(xì)菌群落組成較CK差別更大。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）解釋度分別為35.01%和17.33%，兩個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率累計(jì)為52.34%。Venn圖顯示，4個(gè)處理共有903個(gè)共同屬，CAS02、BC和BC-CAS02處理中分別有35、17和43個(gè)特有屬（圖2b）。

2.5.2 生物炭菌劑對(duì)根際土壤微生物組成的影響屬水平上，不同處理根際土壤細(xì)菌前十位組成及相對(duì)豐度如圖3所示，鞘氨醇單胞菌屬（）、灰桿菌屬（）和WCHB1-32為各處理根際土壤優(yōu)勢(shì)菌群。與CK相比，相對(duì)豐度在CAS02、BC和BC-CAS02處理中均顯著升高（＜0.05，下同），且在BC-CAS02處理中相對(duì)豐度最高；WCHB1-32相對(duì)豐度在BC-CAS02和CAS02處理中較高。

如圖4所示，不同試驗(yàn)處理間根際土壤細(xì)菌群落組成有所差異。CAS02處理，3個(gè)細(xì)菌屬顯著高于CK（＜0.05，下同），BC處理，7個(gè)細(xì)菌屬顯著高于CK，而B(niǎo)C-CAS02處理，包括炭疽菌屬（）、馬賽菌屬（）和諾維赫巴羅菌屬（）等在內(nèi)的11個(gè)細(xì)菌屬顯著高于CK，高麗菌屬（）等9個(gè)細(xì)菌屬與CAS02差異顯著。

2.5.3 根際土壤環(huán)境因子與微生物群落的相關(guān)性分析 通過(guò)冗余分析（RDA，圖5），進(jìn)一步分析根際土壤化學(xué)性質(zhì)與根際土壤細(xì)菌群落之間的關(guān)系。結(jié)果表明，RDA1和RDA2上的解釋量分別為23.48%和14.19%，根際土壤速效磷和速效鉀是影響根際土壤細(xì)菌群落的主要環(huán)境因子（表4），速效磷與優(yōu)勢(shì)菌群正相關(guān)，速效鉀與優(yōu)勢(shì)菌群WCHB1-32負(fù)相關(guān)（圖5）。由表3可知生物炭菌劑顯著增加了根際土壤速效磷含量，但顯著降低了速效鉀含量，即生物炭菌劑通過(guò)改善土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)而改變了優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度。

表2 不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下第25天煙株農(nóng)藝性狀

表3 不同試驗(yàn)處理土壤化學(xué)性質(zhì)

圖2 不同處理根際土壤細(xì)菌群落屬水平的主坐標(biāo)分析（PCoA）（a）和物種Venn圖分析（b）

圖3 不同處理根際土壤微生物屬水平的群落組成及相對(duì)豐度

圖4 不同處理根際土壤微生物屬水平組間差異物種

注：OM，有機(jī)質(zhì)；AN，銨態(tài)氮；NN，硝態(tài)氮；AP，速效磷；AK，速效鉀。

表4 土壤化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌冗余分析的相關(guān)系數(shù)

3 討 論

生物炭作為一種營(yíng)養(yǎng)元素豐富、孔隙發(fā)達(dá)、比表面積大且廉價(jià)易得的功能材料，可較好地負(fù)載生防菌，對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境具有積極的影響[18]。陶思遠(yuǎn)等[19]、QI[20]等研究發(fā)現(xiàn)，生物炭負(fù)載枯草芽孢桿菌SL-13能夠提高菌體的性能，促進(jìn)作物株高和葉片的生長(zhǎng)，顯著改善根際土壤微生態(tài)，對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生積極的影響。

本研究中，花生殼生物炭呈弱堿性，營(yíng)養(yǎng)較為豐富，具有較好的保水能力和多孔結(jié)構(gòu)，可較好地發(fā)揮生物炭菌劑的載體作用；生物炭菌劑掃描電鏡表征發(fā)現(xiàn)，生防菌CAS02可有效負(fù)載于生物炭孔隙中，且生物炭菌劑的負(fù)載量為25.31×108CFU/g。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，單一施用CAS02雖在前期具有一定防控效果，但由于生防菌在土壤中定殖能力不穩(wěn)定[7]等原因，后期防控效果嚴(yán)重降低，但生物炭負(fù)載菌劑可顯著提高煙草黑脛病的防控效果且更為長(zhǎng)效；生物炭菌劑的促生效果優(yōu)于單施生物炭或CAS02生防菌，這表明以生物炭為CAS02的接種載體，既可提高生防菌的生防能力，也對(duì)植物的生長(zhǎng)具有積極影響。

土壤理化性質(zhì)與土壤微生物以及植物的健康生長(zhǎng)有著密切關(guān)系[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，生物炭菌劑可顯著提高根際土壤速效磷含量，降低速效鉀含量，生物炭菌劑通過(guò)改善根際土壤速效磷和速效鉀含量，改變了優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度。UNG等[22]研究表明，增加土壤速效磷含量可以調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分有效性及土壤微生物組成，促進(jìn)植物發(fā)育和對(duì)病害的抑制；而降低土壤速效鉀含量影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化并提高了作物的抗病性[23]。

植物病害與土壤微生物群落有著極其密切的關(guān)系[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，生物炭菌劑顯著改變了根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和屬水平群落組成及相對(duì)豐度，這與魏萌萌等[26]研究結(jié)果中炭基Rs198菌劑的應(yīng)用可以改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增大相關(guān)土壤微生物群落的豐度，改善根際條件，最終促進(jìn)作物生長(zhǎng)的結(jié)果類(lèi)似。其中生物炭菌劑顯著提高了根際土壤優(yōu)勢(shì)菌群和WCHB1-32的相對(duì)豐度。ULLAH等[27]研究發(fā)現(xiàn)可通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化酶活性，顯著促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和提高植物的抗病性。孫月等[28]發(fā)現(xiàn)，WCHB1-32能夠參與難降解組分如木質(zhì)素的分解，對(duì)根際條件進(jìn)行有效改善，間接抑制植物病害發(fā)生。不同試驗(yàn)處理根際土壤差異細(xì)菌物種屬水平研究發(fā)現(xiàn)，生物炭菌劑顯著增加了根際土壤中、、和等菌群的相對(duì)豐度，這與抑制煙草黑脛病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。前人研究表明，可有效抑制煙草黑脛病病原菌的生長(zhǎng)[29]；對(duì)油菜菌核病有較強(qiáng)的防治作用[30]；和均具有抑制植物病害的潛在特性[31-32]。綜上所述，生物炭菌劑通過(guò)根際土壤微生物區(qū)系的變化，提高了對(duì)煙草黑脛病的生防效應(yīng)，但本研究?jī)H采用了盆栽試驗(yàn)初步探究了施用生物炭菌劑對(duì)煙草黑脛病的防效及對(duì)根際土壤細(xì)菌群落的影響，關(guān)于生物炭菌劑在田間防治效果和對(duì)根際土壤真菌群落的影響還需深入研究。

4 結(jié) 論

結(jié)果表明，生物炭負(fù)載生防菌顯著提升了對(duì)煙草黑脛病的防效且持效期延長(zhǎng)。生物炭菌劑可提高煙株根際土壤速效磷含量、降低速效鉀含量，改變根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及組成，增大、WCHB1-32和等有益菌相對(duì)豐度，增強(qiáng)了對(duì)煙草黑脛病的防治效果。本研究為生物炭為載體制備生物炭菌劑，開(kāi)發(fā)防治煙草土傳病害產(chǎn)品和根莖病害綠色防控提供了新思路。

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Effects of Carbon-Based Biocontrol Agents on the Occurrence of Tobacco Black Shank and Soil Microflora

JIA Haijiang1, FENG Junxi2, WU Tao3, ZHANG Xin4, SUN Tong2, HU Xihao5, WANG Peng5, LI Zhen4, CHENG Yadong4, CHENG Changxin3, LI Guizhong3, ZENG Xiangnan1*, ZHOU Zhaofeng1*

(1. Guangxi China Tobacco Industry Co., Ltd., Nanning 530001, China; 2. China Tobacco Shandong Industry Co., Ltd., Jinan 250014, China; 3. China Tobacco Yunnan Industry Co., Ltd., Kunming 650202, China; 4. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 5. Shandong Qingdao Tobacco Co., Ltd., Qingdao 266000, China)

The purpose of this study is to evaluate the control effect of a biochar bioagent on tobacco black shank disease and reveal its combined biocontrol mechanism. Biochar bioagent was prepared by loadingCAS02 on biochar carrier, and its loading effect was evaluated. Using the susceptible variety “Xiaohuangjin1025” as the test material, the prevention and control effects of different treatments of biochar bacteria on tobacco black shank disease were studied in an indoor pot experiment, and the relevant mechanism were analyzed from the perspective of soil chemical properties and microbial community structure. The results showed that: (1) Biochar could effectively support biocontrol bacteria CAS02 with a load of 25.31×108CFU/g, giving full play to the role of carrier. (2) The control effect of CAS02 on tobacco black shank disease decreased to 2.08% after 25 days of application, while the biochar bioagent was highly effective and sustained, and still maintained 43.75% relative control effect on the 25th day. (3) The application of biochar agent significantly changed the rhizosphere soil chemistry. Compared with CK, the content of available phosphorus in the rhizosphere soil under the BC-CAS02 treatment increased by 49.58%, while the content of available potassium decreased by 17.39%. (4) By comparing the amplicon sequencing in the 16 S V3-V4 region of each treatment, the biochar bioagent significantly changed the soil microflora structure, and the relative abundance of disease-inhibiting beneficial bacteria such as WCHB1-32,andsignificantly increased at the genus level. In conclusion, biochar bioagent can effectively improve the control effect of tobacco black shank disease by improving rhizosphere soil chemistry and microbial community composition.

biochar; biocontrol bacteria; tobacco black shank; soil microorganisms

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.010

S435.72

A

1007-5119（2022）06-0068-08

廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項(xiàng)目（GXZYCX2020B003、2022450000340066）

賈海江（1978-），男，碩士，主要從事煙葉基地管理與煙草生產(chǎn)工作。E-mail：jia053@163.com

，E-mail：曾祥難，zengxn000@163.com；周肇峰，574787000@qq.com

2022-06-23

2022-12-22