秦 洋, 倪錦萍, 康 利, 仲志棟, 王立仁, 尹述洲

(上海交通大學醫(yī)學院附屬蘇州九龍醫(yī)院 麻醉科, 江蘇 蘇州, 215021)

脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)是脊髓的第2大常見損傷，具有神經(jīng)功能障礙和癱瘓的風險，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。缺血預處理對諸多器官的缺血再灌注(I/R)損傷具有保護作用，近年來引起了廣泛關注。缺血預處理的保護作用不局限于局部組織，可以轉(zhuǎn)遞到遠隔組織，該現(xiàn)象被稱為遠程缺血預處理(RIPC)[2]。報道[3]顯示, RIPC可誘導脊髓缺血耐受，減輕SCIRI, 但其相關分子機制尚不明確。

蛋白激酶Cε(PKCε)是PKC家族成員，在脊髓組織中表達豐富，參與多種疼痛調(diào)節(jié)[4]。目前已證實RIPC可激活心臟組織中PKCε蛋白，從而激活PKC信號通路，進而發(fā)揮心臟I/R損傷的保護作用[5]; 并且在SCIRI中, RIPC可能通過激活PKCε蛋白，增加脊髓組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達，從而保護脊髓免受I/R損傷。但RIPC后, PKCε蛋白激活的具體機制尚未闡明。微小RNAs(miRNAs)在SCIRI的發(fā)病機制中起著至關重要的作用[6]。研究[7]顯示，微小RNA-31-5p(miR-31-5p)的下調(diào)與PKC通路的激活有關, miR-31-5p是PKCε的上游調(diào)控因子。本研究通過對兔右下肢進行RIPC后，再阻斷腹主動脈建立SCIRI模型，以觀察miR-31-5p在RIPC防治SCIRI中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

日本大耳白兔60只，雄性, 3～4月齡，體質(zhì)量2.2～2.5 kg, 購自青島康大生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證為SCXK(魯)2017-0005。白兔于普通環(huán)境飼養(yǎng)，維持在12 h的明暗循環(huán)中，健康狀況良好。

1.2 試劑及儀器

miR-31-5p mimic及其陰性對照(miR-NC)(上海吉瑪制藥技術有限公司); 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液和BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(碧云天生物科技公司，貨號: C0105、C1088、P0013B、P0012S); 伊文思藍(EB)染色液(0.5%, solarbio公司，貨號: DK0001); 鼠源一抗PKCε、BDNF、GAPDH和抗小鼠IgG二抗(美國Santa Cruz公司，貨號: sc-1681、sc-65514、sc-365062、sc-3697)。NanoDrop 2000分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司); iMark680多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司); ABI Prism? 7300型熒光定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司); BX61電動顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及SCIRI模型的制備: 采用隨機數(shù)字表法將實驗動物分為假手術(sham)組、I/R組、RIPC組、RIPC+miR-NC組、RIPC+miR-31-5p mimic組，每組12只。各組動物經(jīng)耳緣靜脈注入3%戊巴比妥鈉1.0 mL/kg麻醉，間斷靜脈注射3%戊巴比妥鈉(0.5 mL/kg)和維庫溴銨(0.5 mg/kg)維持麻醉。肝素化(3 mg/kg肝素)后經(jīng)左側(cè)頸動脈、右側(cè)股動脈分別插管接生理儀連續(xù)監(jiān)測動脈壓和心電圖，保持血流動力學穩(wěn)定。并用加熱毯保持直腸溫度為38 ℃。除sham組外，其余各組動物構(gòu)建SCIRI模型[8]: 沿左豎脊肌旁縱行切開皮膚，分離裸露腹主動脈; 在左腎動脈下0.5 cm處用無損傷動脈夾阻斷腹主動脈血流30 min, 阻斷時以股動脈壓力波形消失，遠端平均動脈壓0 mmHg為準，之后開放腹主動脈，逐層縫合皮膚; 阻斷腹主動脈血流前5 min, 經(jīng)耳緣靜脈注入肝素150 U/kg預防血栓形成。所有動物術畢肌內(nèi)注射青霉素40萬U, 預防切口感染。sham組不阻斷血流30 min, 其余操作同上。

RIPC干預方式: 在SCIRI模型建立前1 h, 暴露分離右側(cè)股動脈, RIPC組、RIPC+miR-NC組、RIPC+miR-31-5p mimic組動物于右側(cè)股動脈近心端皮膚處，用動脈壓迫止血器逐步加壓，阻斷股動脈血流至遠心端平均動脈壓為0 mmHg, 動脈搏動消失(股動脈波形成一直線)，停止加壓持續(xù)5 min; 然后松開股動脈壓迫，恢復股動脈血流，正常波形呈現(xiàn)，持續(xù)5 min。重復以上操作(缺血5 min, 再灌注5 min)4次，累計40 min。RIPC+miR-NC組和RIPC+miR-31-5p mimic組動物在SCIRI前3 d, 每24 h分別經(jīng)鞘內(nèi)注射miR-NC、miR-31-5p mimic。

1.3.2 后肢運動功能評分: 再灌注48 h后，根據(jù)Tarlov標準[9]對動物后肢運動功能進行評分。評分標準: 0分，無下肢運動，癱瘓; 1分，下肢運動較弱，但不能抵抗重力; 2分，活動良好但不能站立; 3分，能站立和行走但不能正常跳躍; 4分，下肢運動功能正常。實驗室人員以不知情的方式給出行為評分，然后比較結(jié)果。

1.3.3 血-脊髓屏障(BSCB)通透性檢測: 通過定量和定位分析脊髓組織中EB外滲量，可評價BSCB破壞程度和部位。再灌注48 h后，每組取6只兔子，將EB(2%, 10 mL/kg)經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢勻速注入, 1 h后再次麻醉，經(jīng)升主動脈灌注生理鹽水(500 mL/kg), 取出脊髓(L4～6節(jié)段)，分為2部分。一部分，稱重后浸泡于4 mL甲酰胺溶液中, 60 ℃避光水浴24 h, 離心取上清液，用酶標儀在632 nm波長處檢測OD值，并采用梯度EB和甲酰胺混合溶液的OD值繪制標準曲線，計算出每克脊髓組織中EB含量(μg/g)。另一部分置于4%多聚甲醛中固定, 1周內(nèi)沉糖，于-20 ℃連續(xù)切片(10 μm), 在熒光顯微鏡下觀察切片。

1.3.4 脊髓組織形態(tài)學觀察: 再灌注48 h后，每組剩余6只兔子麻醉后，進行心內(nèi)灌注。灌注后立即取出脊髓(L4～6節(jié)段)，將部分脊髓組織浸入10%甲醛中, 4 ℃保存48 h。梯度乙醇中脫水后，包埋在石蠟中。冠狀切片切成5 μm厚度并用HE染色以評估結(jié)構(gòu)變化。損傷的神經(jīng)元通過強烈的嗜酸性細胞質(zhì)、Nissl顆粒的丟失和核固縮來鑒定。每只動物缺血腹側(cè)脊髓中剩余的正常神經(jīng)元，根據(jù)其形態(tài)學外觀判斷，計數(shù)各組中每個切片的正常神經(jīng)元數(shù)量，每個切片隨機選擇3個切面計數(shù)，然后取平均值。

1.3.5 TUNEL檢測脊髓組織神經(jīng)元凋亡情況: 取HE染色制備的切片，經(jīng)脫蠟和水化后，用蛋白酶K室溫下處理15 min, 在3% H2O2中封閉10 min, 并用TUNEL反應混合物處理，在光學顯微鏡下觀察，計算凋亡率。每個切片中隨機選擇3個神經(jīng)元豐富的切面，由同一位觀察者計數(shù)。凋亡率=TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄-實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測脊髓組織miR-31-5p、PKCε和BDNF mRNA表達: 取部分脊髓組織，使用TRIzol試劑分離總RNA, NanoDrop分光光度計測量RNA的濃度和純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以cDNA為模板在熒光定量PCR儀上進行擴增。循環(huán)條件: 95 ℃預變性10 min, 95 ℃變性15 s, 60 ℃退火20 s, 72 ℃延伸20 s, 總共40個循環(huán)。以U6或GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法對結(jié)果進行分析。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.7 Western Blot檢測脊髓組織PKCε、BDNF蛋白表達: 取部分脊髓組織，加入RIPA裂解液，勻漿，然后使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜在室溫下于5%脫脂牛奶中封閉1 h, 然后與一抗(PKCε、BDNF, 1∶1 000; GAPDH, 1∶2 000)在4 ℃下孵育過夜。第2天，蛋白質(zhì)條帶在室溫下用HRP偶聯(lián)的二抗(1∶5 000)孵育1 h, 然后ECL顯色，以GAPDH為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 各組后肢運動功能評分

sham組動物的后肢運動功能均正常，評分為4分; 與sham組相比, I/R組動物的后肢運動功能出現(xiàn)嚴重損傷，評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與I/R組相比, RIPC組后肢運動功能評分增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與RIPC組和RIPC+miR-NC組相比, RIPC+miR-31-5p mimic組后肢運動功能評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組動物后肢運動功能評分 只

2.2 各組BSCB通透性

sham組脊髓組織內(nèi)幾乎未見紅色熒光，與sham組相比, I/R組脊髓組織中可見大量紅色熒光，且EB含量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與I/R組相比, RIPC組脊髓組織中紅色熒光減弱, EB含量減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與RIPC組和RIPC+miR-NC組相比, RIPC+miR-31-5p mimic組脊髓組織中紅色熒光增強, EB含量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表3。

A: sham組; B: I/R組; C: RIPC組; D: RIPC+miR-NC組; E: RIPC+miR-31-5p mimic組。圖1 各組脊髓組織中EB外滲的熒光圖像

表3 各組脊髓組織中EB含量 μg/g

2.3 各組脊髓組織病理學變化

sham組沒有明顯的組織病理學異常跡象，脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，核仁大而明顯，胞漿中存在較多Nissl顆粒; 相比之下, I/R組脊髓神經(jīng)元數(shù)量減少，表現(xiàn)出壞死性改變，空泡化明顯，細胞質(zhì)嗜酸性強烈, Nissl顆粒丟失，胞核固縮。RIPC組和RIPC+miR-NC組脊髓神經(jīng)元表現(xiàn)出輕度破壞，正常神經(jīng)元明顯增多，少數(shù)細胞空泡變性，核仁明顯。與RIPC組和RIPC+miR-NC組相比, RIPC+miR-31-5p mimic組脊髓神經(jīng)元破壞加重，正常神經(jīng)元數(shù)量減少，細胞空泡變性增多，部分胞核固縮。見圖2。

2.4 各組脊髓組織神經(jīng)元凋亡率

在sham組脊髓組織中可見少量TUNEL染色陽性細胞; 與sham組相比, I/R組脊髓中TUNEL染色呈強陽性的細胞數(shù)量眾多，神經(jīng)元凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與I/R組相比, RIPC組脊髓中部分細胞TUNEL染色呈陽性，神經(jīng)元凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與RIPC組和RIPC+miR-NC組相比, RIPC+miR-31-5p mimic組脊髓中TUNEL染色陽性細胞數(shù)增多，神經(jīng)元凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、表4。

A: sham組; B: I/R組; C: RIPC組; D: RIPC+miR-NC組; E: RIPC+miR-31-5p mimic組。圖2 各組脊髓組織病理學變化(HE染色,放大200倍)

A: sham組; B: I/R組; C: RIPC組; D: RIPC+miR-NC組; E: RIPC+miR-31-5p mimic組。圖3 各組脊髓組織神經(jīng)元凋亡情況(TUNEL, 放大200倍)

表4 各組脊髓組織中神經(jīng)元凋亡率 %

2.5 各組脊髓組織miR-31-5p、PKCε和BDNF的mRNA表達

與sham組相比, I/R組脊髓組織中miR-31-5p的表達降低,PKCε和BDNF的mRNA表達有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 與I/R組相比, RIPC組脊髓組織中miR-31-5p的表達降低,PKCε和BDNF的mRNA表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與RIPC組和RIPC+miR-NC組相比, RIPC+miR-31-5p mimic組脊髓組織中miR-31-5p的表達升高,PKCε和BDNF的mRNA表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

2.6 各組脊髓組織PKCε和BDNF的蛋白表達

與sham組相比, I/R組脊髓組織PKCε和BDNF的蛋白表達有輕微升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 與I/R組相比, RIPC組脊髓組織中PKCε和BDNF的蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與RIPC組和RIPC+miR-NC組相比, RIPC+miR-31-5p mimic組脊髓組織中PKCε和BDNF的蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、表6。

3 討 論

胸腹主動脈和脊柱手術可能導致SCIRI, 進而截癱。雖然隨著新技術的應用，術后截癱的風險降低，但預防脊髓缺血性損傷仍然是胸主動脈手術中的重點。在RIPC中，組織或器官的短時間非致死性I/R可保護遠程組織或器官免受更嚴重的I/R損傷。研究證據(jù)[8, 10]表明, RIPC可誘導脊髓缺血耐受，但其確切機制尚不清楚。BSCB在維持脊髓的穩(wěn)態(tài)方面起著至關重要的作用[11]。在I/R損傷的情況下, BSCB的功能和結(jié)構(gòu)都被破壞，進一步導致神經(jīng)功能缺損[12-13]。相關報道[14]稱, RIPC可在SCIRI后保持BSCB的完整性，并上調(diào)脊髓組織中BDNF表達，加強對神經(jīng)的修復能力。本研究結(jié)果與之前的研究一致, RIPC減弱了兔SCIRI后BSCB的破壞，減少了正常運動神經(jīng)元損傷，并顯著上調(diào)了BDNF的表達，改善了SCIRI后的肢體運動功能，說明RIPC對兔SCIRI具有顯著的防治作用。

表5 各組脊髓組織中miR-31-5p、PKCε和BDNF的mRNA表達

A: sham組; B: I/R組; C: RIPC組; D: RIPC+miR-NC組; E: RIPC+miR-31-5p mimic組。圖4 各組脊髓組織中PKCε和BDNF的蛋白表達

表6 各組脊髓組織中PKCε和BDNF的蛋白表達

BDNF是一種促生存信號分子，具有抗炎、抗凋亡和促進神經(jīng)元再生的神經(jīng)保護作用，在脊髓損傷的病理生理過程和治療中起關鍵作用，與SCIRI后神經(jīng)功能改善和神經(jīng)元活力增加有關[15]。已有報道[16]顯示，促進BDNF的合成和釋放可減輕SCIRI。PKCε屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是誘導缺血預處理神經(jīng)保護的關鍵參與者[17-18], 已被證明在心血管疾病的I/R損傷過程中發(fā)揮重要作用，其激活與BDNF的上調(diào)有關[19]。研究[20]顯示，四肢RIPC可增加PKCε蛋白表達，保護大鼠心臟免受I/R損傷; 且RIPC可增加I/R后脊髓組織中PKCε表達水平，表明RIPC很可能通過激活PKCε蛋白，上調(diào)脊髓組織中BDNF的表達。本研究結(jié)果顯示, I/R后，兔脊髓組織中PKCε和BDNF的表達有輕微上調(diào)，這與以往的研究結(jié)果一致，推測其原因可能是機體在應激條件下的一種代償性的保護機制，但是這種上調(diào)并不會持續(xù)，隨著BSCB的破壞，一些分泌BDNF的細胞(如星形膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元)的損傷加重，會影響B(tài)DNF的表達。而RIPC可通過增加PKCε表達水平和減輕BSCB損傷，上調(diào)BDNF的表達水平。

miR-31-5p是眾所周知的腫瘤相關miRNA, 參與多種腫瘤的進展[21-22]。研究[22]表明, miR-31-5p在維持非癌組織的病理生理穩(wěn)態(tài)方面起著不可或缺的作用。如miR-31-5p是哮喘和慢性阻塞性肺疾病慢性黏液分泌過多的共同調(diào)節(jié)劑[23]; 在心肌細胞肥大中, miR-31-5p可以特異性結(jié)合PKCε并以劑量依賴性方式抑制PKCε表達; miR-31-5p的抑制或PKCε的過表達可顯著逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大，并可能為心肌細胞肥大提供潛在的治療方法。本研究發(fā)現(xiàn), I/R后，兔脊髓組織中PKCε的增加伴隨著miR-31-5p表達水平的降低，而RIPC可顯著降低脊髓組織中miR-31-5p的表達，并上調(diào)PKCε的表達。分析原因為RIPC可能通過下調(diào)miR-31-5p的表達，上調(diào)PKCε, 進而增加BDNF表達。為了驗證此猜想，本研究在RIPC的基礎上，使用miR-31-5p mimic進行干預以上調(diào)miR-31-5p, 結(jié)果顯示, PKCε和BDNF的表達較RIPC組顯著降低, RIPC對兔SCIRI的保護作用被顯著減弱，這證實了本研究的猜想。

綜上所述，在RIPC后, miR-31-5p的表達降低，可激活PKCε蛋白，上調(diào)脊髓組織中BDNF的表達，減輕SCIRI。本研究僅初步探究了miR-31-5p在RIPC保護SCIRI中的作用，其是否能調(diào)控其他基因或通路參與RIPC，還需進一步研究。