李 瑞, 李萬明, 陳小麗

(1. 北京航天總醫(yī)院 眼科, 北京, 100076; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 眼科, 北京, 100076)

增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)是2型糖尿病患者常見的一種微血管病變，主要是由于長(zhǎng)期慢性高血糖引發(fā)視網(wǎng)膜缺血，誘發(fā)新生血管異常生長(zhǎng)及繼發(fā)性纖維組織增殖，進(jìn)而促使視網(wǎng)膜前膜的異常增殖及纖維化，最終導(dǎo)致血管源性病變[1]。PDR的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，且患者發(fā)病初期癥狀不明顯，故尋求PDR發(fā)生過程中的關(guān)鍵靶標(biāo)基因具有重要意義。微小RNA(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸的高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，可參與細(xì)胞增殖分化、免疫反應(yīng)等多種生理及病理過程并發(fā)揮重要作用[2-4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)具有誘導(dǎo)血管生成的作用，其高表達(dá)與PDR形成有關(guān)[5]。相關(guān)研究[6]表明，微小RNA-126(miR-126)可通過調(diào)控靶基因VEGF的表達(dá)而發(fā)揮調(diào)節(jié)血管生成的功能，且可促進(jìn)新生血管的形成。本研究主要探討miR-126、VEGF在PDR患者視網(wǎng)膜前膜組織中的表達(dá)變化并分析其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月—2020年2月于北京航天總醫(yī)院眼科擇期行玻璃體切割手術(shù)的PDR患者65例納入研究組，另選取同期行玻璃體切割手術(shù)的特發(fā)性黃斑裂孔患者62例納入對(duì)照組。研究組中，男41例，女24例，年齡41～71歲，平均(56.12±9.33)歲，糖尿病病程為5～15年，平均(10.12±1.65)年。對(duì)照組男34例，女28例，年齡42～70歲，平均(57.03±9.52)歲。研究組納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合PDR相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]者; ② 反復(fù)出現(xiàn)玻璃體積血者; ③ 檢查出眼底出現(xiàn)增生膜或牽拉性視網(wǎng)膜脫離者; ④ 既往無眼部手術(shù)史者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn): 符合特發(fā)性黃斑裂孔的診斷標(biāo)準(zhǔn)且未合并其他眼部疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 患有其他眼部疾病者; ② 患有血液系統(tǒng)疾病或代謝性疾病者; ③ 合并嚴(yán)重高血壓者; ④ 近期接受抗新生血管藥物治療者; ⑤ 合并惡性腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病者。2組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集[8]: 2組患者均接受常規(guī)玻璃體切割術(shù)治療。灌注前使用玻璃體切割頭抽取玻璃體液0.6 mL置于微量離心管中，手術(shù)中留取視網(wǎng)膜前膜組織，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，術(shù)中使用0.06%臺(tái)盼藍(lán)溶液幫助視網(wǎng)膜前膜組織的完整剝除。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)視網(wǎng)膜前膜組織中miR-126、VEGFmRNA表達(dá)水平: 取出凍存的視網(wǎng)膜前膜組織，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，按照Trizol試劑盒(北京天根生化科技有限公司)操作步驟提取總RNA。采用miRNAs反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(美國Invitmgen公司)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)并檢測(cè)miR-126、VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)體系為20 μL(2×SYBR Mix 10 μL, 10×cDNA模板1 μL, 上下游引物各1 μL, H20 8 μL), 反應(yīng)程序設(shè)定為94 ℃預(yù)變性1 min, 92 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 75 ℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。在PCR儀上(Bio-Red公司)進(jìn)行反應(yīng)，其中引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中miR-126以U6作為內(nèi)參，按照2-△△Ct算法進(jìn)行基因相對(duì)定量表達(dá)分析,VEGFmRNA以β-actin為內(nèi)參，按照2-△△Ct算法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 Western blotting法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)水平: 取2組視網(wǎng)膜前膜組織在冰上剪成碎片并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，簡(jiǎn)單離心后棄去PBS并加入蛋白裂解液，采用玻璃勻漿器勻漿至組織破碎，并在冰上裂解30 min, 簡(jiǎn)單離心5 min后將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中即組織總蛋白產(chǎn)物，采用二辛可寧酸法檢測(cè)蛋白純度并取20 μg蛋白樣品于沸水中煮5 min, 之后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳并電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。封閉液封閉并加入一抗兔抗鼠VEGF多克隆抗體(1∶2 000), 室溫下靜置120 min, 清洗后加入二抗室溫孵育60 min, 再次清洗。采用電化學(xué)發(fā)光法試劑盒發(fā)光顯影并運(yùn)用Quantity One(美國BIO-RAD公司)分析軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參對(duì)顯影條帶進(jìn)行VEG蛋白相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

1.3 觀察指標(biāo)

檢測(cè)并比較2組患者的空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)水平。2組患者檢查前1 d晚8時(shí)后禁食且不可劇烈運(yùn)動(dòng)，次日抽取空腹靜脈血檢測(cè)。首先檢測(cè)FBG水平，之后進(jìn)行抗凝實(shí)驗(yàn)，采用高壓液相法以Sysmex全自動(dòng)生化分析儀(日本希森美康公司)及其配套試劑檢測(cè)HbA1c水平，將采集的血樣離心20 min取上清，檢測(cè)TG水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜前膜組織中miR-126、VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

研究組患者視網(wǎng)膜前膜組織中miR-126表達(dá)水平低于對(duì)照組,VEGFmRNA及其蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 2組視網(wǎng)膜前膜組織中miR-126、VEGF mRNA和VEGF蛋白表達(dá)水平比較

圖1 VEGF蛋白條帶圖

2.2 FGB、TG及HbA1c水平比較

研究組患者FGB、TG、HbA1c水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3 研究組患者miR-126與VEGF mRNA的相關(guān)性及兩者與FGB、HbA1c、TG的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析法結(jié)果顯示，研究組患者視網(wǎng)膜前膜組織中miR-126表達(dá)水平與VEGFmRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05), 見圖2; miR-126與FGB、HbA1c、TG呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05), 而VEGFmRNA與FGB、HbA1c、TG呈顯著正相關(guān)(P<0.05), 見表4。

表3 2組FGB、TG及HbA1c水平比較

圖2 miR-126與VEGF mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.4 PDR的單因素與多因素Logistic回歸分析

單因素Logistic分析顯示, FGB、HbA1c、TG、miR-126、VEGFmRNA表達(dá)水平為PDR發(fā)生的影響因素; 多因素Logistic分析顯示, miR-126、VEGFmRNA表達(dá)水平為PDR發(fā)生的獨(dú)立影響因素。見表5、表6。

表4 miR-126、VEGF mRNA與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

表5 PDR影響因素的Logistic單因素分析

表6 PDR影響因素的Logistic多因素分析

3 討 論

PDR發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，可能與體內(nèi)炎癥反應(yīng)、慢性缺血缺氧、自由基生成、蛋白質(zhì)的非酶糖基化、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種病理過程有關(guān)[9]。持續(xù)高血糖會(huì)引起血管障礙并促使視網(wǎng)膜血管阻塞，造成基底膜增厚而導(dǎo)致視網(wǎng)膜無灌注區(qū)缺血缺氧狀態(tài)，這一病理過程會(huì)破壞血管生成抑制因子與刺激因子的平衡并刺激新生血管生成[10]。研究[11]表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清VEGF水平升高，且VEGF水平與病變嚴(yán)重程度有關(guān)。miR-126與腫瘤組織中微血管生成相關(guān)，且可通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A表達(dá)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖及遷移[12]。miR-126、VEGF表達(dá)與PDR發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系目前尚未完全明確，本研究檢測(cè)患者視網(wǎng)膜前膜組織中miR-126、VEGF表達(dá)水平，旨在分析其與視網(wǎng)膜病變的關(guān)系及臨床意義。

miR-126位于表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域7的內(nèi)含子6與7區(qū)域內(nèi)，定位于人9號(hào)染色體，可通過誘導(dǎo)靶基因表達(dá)而調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮其生物學(xué)功能[13]。施鳳漣等[14]報(bào)道，妊娠期糖尿病患者血清miR-126表達(dá)水平較血糖正常的妊娠者低，且其低表達(dá)與胰島素抵抗有關(guān)。相關(guān)研究[15]發(fā)現(xiàn)，缺氧性視網(wǎng)膜病變模型動(dòng)物的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-126過表達(dá)可抑制新生血管形成，且miR-126可維持血管完整性并參與視網(wǎng)膜病變過程。由此推測(cè), miR-126可能參與PDR過程。本研究結(jié)果顯示，研究組患者視網(wǎng)膜前膜組織中miR-126表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，說明PDR患者視網(wǎng)膜前膜組織中miR-126呈低表達(dá)，且參與PDR的發(fā)生發(fā)展過程。相關(guān)研究[16]發(fā)現(xiàn), FGB、HbA1c等指標(biāo)與糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理過程緊密相關(guān)，且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，即病情越嚴(yán)重其水平越高。本研究結(jié)果顯示，研究組患者HbA1c、TG水平顯著高于對(duì)照組，與相關(guān)研究[17]結(jié)論一致。本研究還分析了PDR患者FGB、HbA1c、TG水平與miR-126表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-126分別與FGB、HbA1c、TG呈顯著負(fù)相關(guān)，說明miR-126不僅參與PDR病理過程，還與疾病嚴(yán)重程度緊密相關(guān)。

VEGF位于人染色體6p21.3, 可通過其特異性受體活化磷脂酶C并增加鈣離子內(nèi)流而提高磷酸肌醇水平，進(jìn)而促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖，有利于血管生成[18]。研究[19]表明, VEGF在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要功能，不僅可產(chǎn)生促血管生長(zhǎng)細(xì)胞因子，還能誘導(dǎo)腫瘤血管生長(zhǎng)或加快病變血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移。相關(guān)研究[20]發(fā)現(xiàn)，血清VEGF水平升高參與老年糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生，且VEGF水平升高可作為評(píng)價(jià)患者微血管損傷的依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，研究組患者視網(wǎng)膜前膜組織中VEGFmRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，說明VEGF與PDR發(fā)展及新生血管形成關(guān)系密切。由此推測(cè), VEGF可通過增加血管的通透性與視網(wǎng)膜局部新生血管的形成而參與糖尿病患者發(fā)生PDR的過程。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示,VEGFmRNA與FGB、HbA1c、TG均呈顯著正相關(guān)，說明VEGF除可引起糖尿病患者發(fā)生PDR外，還與病變嚴(yán)重程度緊密相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示, miR-126與VEGFmRNA呈顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)PDR患者持續(xù)高血糖不僅可直接損害視網(wǎng)膜血管，還可引起視網(wǎng)膜組織慢性缺血缺氧導(dǎo)致miR-126表達(dá)下調(diào)并上調(diào)VEGF，進(jìn)而參與病變過程。本研究多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示, miR-126、VEGFmRNA表達(dá)水平均是糖尿病患者發(fā)生PDR的影響因素。由此提示, miR-126低表達(dá)可誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)而改變PDR患者眼部正常組織結(jié)構(gòu)及功能，并進(jìn)一步促進(jìn)病情惡化, miR-126、VEGF均可參與PDR的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述, PDR患者視網(wǎng)膜前膜組織中miR-126表達(dá)下調(diào),VEGFmRNA表達(dá)上調(diào)，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)且共同參與疾病的發(fā)生發(fā)展。檢測(cè)患者miR-126、VEGFmRNA和其蛋白表達(dá)水平，有助于及時(shí)診治，進(jìn)而防止病情惡化。本研究存在不足之處，如未檢測(cè)血清和玻璃體中miR-126、VEGF表達(dá)水平，也未探討miR-126與VEGF在PDR發(fā)生過程中的具體調(diào)控機(jī)制，有待未來進(jìn)一步深入研究加以探討。