田雅晴，崔立欣，郝海生，鄒惠影，龐云渭，趙學(xué)明，朱化彬，杜衛(wèi)華

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，卵泡的發(fā)育和排卵是影響母畜繁殖力和生產(chǎn)力的重要因素[1]。卵泡中，卵丘細(xì)胞包圍卵母細(xì)胞，通過(guò)縫隙連接與其進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞，如運(yùn)輸環(huán)狀鳥(niǎo)苷酸、環(huán)狀腺苷酸、乳酸、丙酮酸和磷酸肌酸等作用于卵母細(xì)胞[2]，而卵母細(xì)胞則通過(guò)旁分泌分化生長(zhǎng)因子9(growth differentia-tion factor 9，GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP15)來(lái)調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞的增殖和分化[3]。在牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)的體外成熟過(guò)程中，去除卵丘細(xì)胞可顯著降低卵母細(xì)胞的成熟率和胚胎的發(fā)育潛力[4]。

缺失的、小的、同源異形1(absent, small, or homeotic 1，ASH1)是組蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，最初在果蠅中被鑒定出來(lái)[5]。ASH1含SET(su [var]3-9, enhancer-of-zeste, trithorax)結(jié)構(gòu)域，具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性[6]。在哺乳動(dòng)物中，類(lèi)ASH1L(ASH1-like)可催化組蛋白H3K4和H3K36的甲基化，從而調(diào)控同源異形盒基因(homeobox gene，HOXgene)的表達(dá)[7]。Ash1L基因缺失后，小鼠發(fā)育能力降低，并伴有生殖器官的缺陷[8]。干擾ASH1L基因表達(dá)可抑制牛卵丘細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促凋亡基因BAX和CASPASE-3表達(dá)上調(diào)[9]。然而，ASH1L基因調(diào)控卵丘細(xì)胞增殖和分化的具體途徑仍不清楚。

作為高通量技術(shù)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)能從基因組水平上研究細(xì)胞中的基因表達(dá)及其調(diào)控規(guī)律[10]。采用該法鑒定出在牛卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中共同表達(dá)的499個(gè)配體編碼基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，且富集于跨帶突觸形成的功能條目；另外，大量的差異表達(dá)基因富集于卵泡形成過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄、翻譯、凋亡、轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞分化等功能，可見(jiàn)卵丘細(xì)胞的基因表達(dá)與卵母細(xì)胞中的生物過(guò)程和胚胎的發(fā)育能力息息相關(guān)[11]。COCs經(jīng)玻璃化冷凍后，卵丘細(xì)胞中存在大量的差異表達(dá)基因，推測(cè)其可能與冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的降低相關(guān)[12]。本試驗(yàn)對(duì)敲降A(chǔ)SH1L基因的牛卵丘細(xì)胞和野生型卵丘細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序，篩選兩株細(xì)胞中的差異表達(dá)基因，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析其功能和參與的信號(hào)通路，為揭示ASH1L基因在卵丘細(xì)胞增殖、卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育中的作用機(jī)制提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用試劑若無(wú)說(shuō)明均購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶、DPBS液和轉(zhuǎn)染試劑盒(Lipofectamine3000)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 卵丘細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

屠宰場(chǎng)采集牛卵巢，于含雙抗(100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)的30 ℃生理鹽水中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用真空泵連接18號(hào)針頭，抽取直徑為2～6 mm卵泡中的卵泡液。在體視顯微鏡下挑選狀態(tài)良好，且?guī)в?層及以上卵丘細(xì)胞的COCs，洗滌后放入成熟滴中，于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)22 h。用0.1%透明質(zhì)酸酶消化COCs，在顯微鏡下移除卵母細(xì)胞，將卵丘細(xì)胞用DPBS離心(1 000 r·min-1，5 min)洗滌兩次，用含10% FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種在六孔板中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3 靶向牛ASH1L基因的siRNA合成

根據(jù)Cui等[9]的研究，按照NCBI提供的牛ASH1L基因序列(登錄號(hào)：NM_001192743),由上海吉瑪基因股份有限公司合成一對(duì)siASH1L及陰性對(duì)照siRNA序列(negative control，NC)。

1.4 卵丘細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

觀察細(xì)胞密度達(dá)到80%，且狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將5 μL轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000與50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基混勻后室溫靜置5 min；將5 μL siRNA或NC序列與50 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基混勻；然后將上述兩種Opti-MEM培養(yǎng)基混勻，室溫靜置20 min。移除細(xì)胞孔中的培養(yǎng)基，DPBS清洗兩次，加入600 μL Opti-MEM培養(yǎng)液；將含轉(zhuǎn)染試劑和siRNA的混合物加入細(xì)胞孔，混勻后于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4～6 h后更換為含10% FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 卵丘細(xì)胞RNA文庫(kù)構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

siRNA或siNC序列轉(zhuǎn)染牛卵丘細(xì)胞48 h后，分別收集干擾組和對(duì)照組細(xì)胞提取RNA，每組3個(gè)重復(fù)，共6個(gè)樣品RNA送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，使用Illumian HiSeqTM2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。使用Trimmomatic軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估后，利用Hisat2將所得clean reads比對(duì)到牛參考基因組(版本號(hào):UMD3.1.1)上。利用DESeq軟件對(duì)各個(gè)樣本基因的counts數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理(采用basemean值來(lái)估算表達(dá)量)，計(jì)算差異倍數(shù)，以差異倍數(shù)>1.5及P<0.05來(lái)篩選差異表達(dá)基因。然后利用GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，并用超幾何分布檢驗(yàn)方法計(jì)算代表GO功能集在差異表達(dá)蛋白編碼基因/轉(zhuǎn)錄本列表中富集的顯著性，及每個(gè)Pathway條目中差異表達(dá)基因富集的顯著性。

1.6 基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)

利用GSEA軟件，選用Hallmark(H)、Curated(C2)、Ontology(C5)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)RNA-seq測(cè)得的全部表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)q值<0.25為標(biāo)準(zhǔn)篩選富集的基因集。

1.7 可變剪切分析和SNP位點(diǎn)分析

使用StringTie軟件對(duì)reads進(jìn)行組裝，采用ASprofile軟件檢測(cè)樣本中存在的可變剪切事件。

利用Samtools軟件進(jìn)行染色體坐標(biāo)排序、去重等處理，再用Samtools、Bedtools等軟件預(yù)測(cè)樣本中的SNP位點(diǎn)，然后采用SnpEff等軟件進(jìn)行功能注釋。使用QUAL(a quality score associated with the inference of the given allele)≥20，且DP(combined depth across samples)≥4對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾。

1.8 實(shí)時(shí)定量RT-PCR(RT-qPCR)檢測(cè)卵丘細(xì)胞中的基因表達(dá)水平

將siASH1L(干擾組)和siNC(對(duì)照組)分別轉(zhuǎn)染牛卵丘細(xì)胞，每組3個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。參照動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒(華越洋生物北京科技有限公司)說(shuō)明書(shū)提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))進(jìn)行定量檢測(cè)。牛GAPDH、ASH1L、緊密連接蛋白6(claudin-6，CLDN6)、冠蛋白1A(coronin 1A，CORO1A)和肌鈣蛋白C1(troponin C 1，TNNC1)基因的引物參考崔立欣[13]的研究設(shè)計(jì)，并由華大基因公司合成；BMP4基因(登錄號(hào)：NM_001045877.1)引物序列為F:TGGCCCAAGAGAACCCTAAG，R:ATCCGGGTGTTCCTTCATGT；SMAD蛋白6(SMAD family member 6，SMAD6)基因(登錄號(hào)：NM_001206145.2)引物序列為F:GCCAACTCCCTCATCACAGC，R:AGGTAGGTCGTAGAAGATGC；頭蛋白(Noggin，NOG)基因(登錄號(hào)：XM_002695554.6)引物序列為F:CCAGCACTATCTCCACATCC，R:GGGGTCAAAGATAGGGTCCG。RT-qPCR的反應(yīng)體系為15 μL：上、下游引物各0.5 μL， cDNA模板2 μL，TB Green Premix Ex Taq II(2×)7.5 μL，RNase free ddH2O 4.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個(gè) 循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次， 以牛GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 蛋白免疫印跡(Western blotting)檢測(cè)卵丘細(xì)胞中的ASH1L蛋白表達(dá)水平

將siASH1L(干擾組)和siNC(對(duì)照組)分別轉(zhuǎn)染卵丘細(xì)胞48 h后，用0.25%胰酶分別消化、收集干擾組和對(duì)照組細(xì)胞，加入200 μL含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，充分裂解后12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清。將上清、β-巰基乙醇和Buffer混和，100 ℃蛋白變性10 min，取20 μL樣品經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離；再用200 mA電流、300 V電壓將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，37 ℃搖床、5%脫脂奶粉中封閉1.5 h。膜于一抗(1∶500)中4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次后，于二抗(1∶5 000)中37 ℃孵育1 h，洗膜后顯影。凝膠成像儀中曝光采集數(shù)據(jù)，采用圖像分析軟件(Image-J)進(jìn)行蛋白定量分析。以β-tubulin作為內(nèi)參，每個(gè)樣品至少重復(fù)3次。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯檢驗(yàn)(Duncan test)，結(jié)果以“平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)”形式表示，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。本研究中的柱狀圖均使用GraphPad Prism 7.0軟件制作。

2 結(jié) 果

2.1 牛ASH1L基因在卵丘細(xì)胞中的表達(dá)及siASH1L的干擾效果

分別采用RT-qPCR和Western blotting方法檢測(cè)牛卵丘細(xì)胞中ASH1L mRNA和蛋白的表達(dá)水平(圖1A和1B)，結(jié)果顯示:ASH1L mRNA和蛋白在卵丘細(xì)胞中均有表達(dá)，且均顯著低于內(nèi)參基因的表達(dá)水平(P<0.05)。

將前期試驗(yàn)篩選的靶向ASH1L基因的siRNA序列(干擾組)和siNC序列(對(duì)照組)分別轉(zhuǎn)染牛卵丘細(xì)胞，檢測(cè)ASH1L基因和蛋白表達(dá)水平(圖1C和1D)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：干擾組細(xì)胞中該基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)，siRNA干擾效率達(dá)60%～70%。

A.卵丘細(xì)胞中ASH1L基因的mRNA表達(dá)水平；B.卵丘細(xì)胞中ASH1L蛋白的表達(dá)水平；C.siRNA干擾后，卵丘細(xì)胞中ASH1L基因的mRNA表達(dá)水平；D.siRNA干擾后，卵丘細(xì)胞中ASH1L蛋白的表達(dá)水平。不同字母代表差異顯著(P<0.05)A. Expression level of ASH1L gene in bovine cumulus cells; B. Protein level of ASH1L in bovine cumulus cells; C. Expression level of ASH1L gene in bovine cumulus cells with siRNA interference; D. Protein level of ASH1L in bovine cumulus cells with siRNA interference. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖1 ASH1L在牛卵丘細(xì)胞中的表達(dá)及siASH1L干擾效果Fig.1 Expression levels of ASH1L in bovine cumulus cells with or without siRNA interference and interference effect of siASH1L

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

干擾組與對(duì)照組細(xì)胞的RNA-seq原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾后，獲得有效數(shù)據(jù)量44 G，Q30堿基分布在93%以上，數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。兩組細(xì)胞共篩選出2 046個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1 078個(gè)，下調(diào)基因968個(gè)(圖2)。上調(diào)倍數(shù)較大的基因有鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白2(hemojuvelin 2，HFE2)、肌球蛋白輕鏈7(myosin light chain 7，MYL7)和水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)，分別上調(diào)了6.72、5.29和4.31倍；下調(diào)倍數(shù)較大的基因有肌肉骨骼受體酪氨酸激酶(muscle, skeletal, receptor tyrosine kinase，MUSK)、血管非炎性分子1(vanin 1，VNN1)和代謝型谷氨酸受體8(metabotropic glutamate receptor 8，GRM8)，分別下調(diào)了6.32、6.01和3.74倍。

為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性，選取6個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證(圖3)。與對(duì)照組相比，干擾組細(xì)胞中CLDN6、CORO1A和TNNC1基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，而B(niǎo)MP4、SMAD6和NOG基因的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；可見(jiàn)，以上基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與RNA-seq結(jié)果一致。

圖2 ASH1L干擾組和對(duì)照組卵丘細(xì)胞中差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcano map of differentially expressed genes in bovine cumulus cells with or without interference of ASH1L

A.RNA-seq中差異表達(dá)基因的log2(fold change)；B.差異表達(dá)基因的RT-qPCR分析A. log2(fold change) of differentially expressed genes; B. RT-qPCR analysis of differentially expressed genes圖3 ASH1L干擾組和對(duì)照組卵丘細(xì)胞中差異表達(dá)基因RT-qPCR驗(yàn)證Fig.3 RT-qPCR verification of differentially expressed genes in bovine cumulus cells with or without interference of ASH1L

2.3 差異表達(dá)基因的GO富集和KEGG通路分析

對(duì)2 046個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋分析，結(jié)果其主要富集到2 802個(gè)GO條目。其中，生物學(xué)過(guò)程類(lèi)條目包括血小板活化的正調(diào)控、紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、細(xì)胞分裂等；細(xì)胞組分類(lèi)條目包括白介素6受體復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞外空隙、細(xì)胞連接等；分子功能類(lèi)條目包括微衛(wèi)星結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合、胰島素樣生長(zhǎng)因子I結(jié)合、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性、H3K36二甲基化等(圖4A)。

KEGG分析發(fā)現(xiàn)，兩組細(xì)胞的差異表達(dá)基因共富集到53條通路，顯著富集的通路主要包括白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、細(xì)胞凋亡、Hippo、細(xì)胞黏附分子、PI3K-Akt、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等(圖4B)。參與白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路的基因中，表達(dá)量變化較大的有α-輔肌動(dòng)蛋白3(α-actinin 3，ACTN3)、CLDN6和VAV鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子3(vav guanine nucleotide exchange factor 3，VAV3)，分別上調(diào)了1.65、4.86和2.59倍；參與細(xì)胞黏附分子通路的基因中，表達(dá)量變化較大的有整合素β7亞基(integrin β7 subunit，ITGB7)、CLDN6和選擇素P(selectin P，SELP)，分別上調(diào)了2.51、4.86倍和下調(diào)了2.75倍。其中，CLDN6是一種緊密連接蛋白基因，同時(shí)參與細(xì)胞黏附分子和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移兩個(gè)通路。

2.4 全部表達(dá)基因的基因集富集分析

利用GSEA分析干擾組和對(duì)照組卵丘細(xì)胞的全部表達(dá)基因在GO gene sets和curated gene sets基因集中的富集情況(表1)。結(jié)果，ASH1L基因可能與發(fā)育誘導(dǎo)、細(xì)胞周期、胚胎干細(xì)胞、H3K4特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性、組蛋白去甲基化等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。

2.5 差異可變剪切分析

6個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共鑒定出12種可變剪切方式，共117 994個(gè)可變剪切事件(表2)。絕大多數(shù)的基因發(fā)生外顯子跳躍類(lèi)型的可變剪切，其中單外顯子跳躍、可變第一外顯子和模糊邊界單外顯子跳躍3種剪切方式分別占可變剪切事件的37%、32%和11%。

2.6 轉(zhuǎn)錄組SNP位點(diǎn)篩選與分析

測(cè)序數(shù)據(jù)中共檢測(cè)到522 205個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中絕大多數(shù)SNP分布在內(nèi)含子、外顯子和基因下游(表3)；堿基轉(zhuǎn)換的發(fā)生頻率顯著高于顛換，其中A-G和T-C轉(zhuǎn)換頻率較高，G-C和C-G顛換頻率較高。

3 討 論

哺乳動(dòng)物中，卵丘細(xì)胞的增殖和凋亡對(duì)卵泡的生長(zhǎng)、卵母細(xì)胞的成熟和早期胚胎的發(fā)育潛力至關(guān)重要[14]；而組蛋白甲基化等表觀修飾參與調(diào)控卵丘細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[15]。本試驗(yàn)首先分析了組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L在牛卵丘細(xì)胞中的表達(dá)水平，然后通過(guò)RNA干擾技術(shù)敲降A(chǔ)SH1L基因，研究其低表達(dá)對(duì)牛卵丘細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。

本研究采用GO富集和GSEA基因集富集兩種方法對(duì)敲降A(chǔ)SH1L基因的卵丘細(xì)胞和野生型卵丘細(xì)胞中的表達(dá)基因進(jìn)行分析，前者是對(duì)兩組細(xì)胞中的差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，而后者是利用所有基因的表達(dá)信息進(jìn)行基因集富集分析[16]。GO分析表明，兩組細(xì)胞的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞分裂、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性、H3K36二甲基化、細(xì)胞連接等GO條目；而GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)，兩組細(xì)胞中表達(dá)的基因顯著富集到發(fā)育誘導(dǎo)、H3K4特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性、H3K27me3和組蛋白去甲基化等基因集。可見(jiàn)，ASH1L基因與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的催化功能和卵丘細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控等密切相關(guān)；崔立欣等[17]對(duì)卵丘細(xì)胞中H3K36me1/2/3的熒光免疫染色結(jié)果也說(shuō)明，干擾ASH1L基因可顯著降低H3K36me1/2/3甲基化水平，以上結(jié)果與ASH1L可特異性甲基化H3K4和H3K36的前期研究一致[12,18]。另外，GSEA富集分析表明，敲降A(chǔ)SH1L基因能夠?qū)е翲3K27me3水平上調(diào)，其核心基因包括HOXA3、HOXD8和HOXD4等。H3K4、H3K36、H3K79甲基化與基因激活有關(guān)，H3K9、H3K27、H3K20甲基化與基因沉默或異染色質(zhì)形成有關(guān)[19]；ASH1L可特異性催化H3K36甲基化，并通過(guò)干擾核小體上多梳抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的活性而抑制H3K27甲基化，從而調(diào)控HOX基因的表達(dá)[20]。

敲降A(chǔ)SH1L基因的卵母細(xì)胞和野生型卵丘細(xì)胞中的差異表達(dá)基因富集到53條通路，而下調(diào)基因顯著富集的通路中包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)。TGF-β是機(jī)體內(nèi)重要的信號(hào)通路之一，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化、胚胎發(fā)育、器官形成和免疫功能等[21]；該通路包含大量不同的多肽類(lèi)形態(tài)發(fā)生因子，如肌肉生長(zhǎng)分化因子GDF8、GDF9和骨形態(tài)生成蛋白4(BMP4)。GDF8也稱(chēng)肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)，是大多數(shù)哺乳動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)因子，在顆粒細(xì)胞中以旁分泌因子的形式表達(dá)[22]。GDF8通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK磷酸化和細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基水平來(lái)調(diào)節(jié)豬卵母細(xì)胞的體外成熟和胚胎發(fā)育[23]；GDF8還可下調(diào)正五聚蛋白3(pentraxin 3，PTX3)的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散、排卵和體內(nèi)受精[24]，PTX3缺乏會(huì)嚴(yán)重影響卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散[25]。牛卵丘細(xì)胞中GDF9的表達(dá)量隨卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程而呈動(dòng)態(tài)變化，在成熟培養(yǎng)12 h表達(dá)水平達(dá)到峰值，啟動(dòng)細(xì)胞的擴(kuò)展；培養(yǎng)24 h成熟完成時(shí)，其又下調(diào)表達(dá)，可見(jiàn)其對(duì)卵母細(xì)胞的成熟具有重要的調(diào)控作用[26]。根據(jù)差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果，BMP4參與轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、生長(zhǎng)因子活性、BMP信號(hào)通路等GO條目，以及細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、TGF-β信號(hào)通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性等通路。而且，BMP4在胚胎發(fā)育[27]、細(xì)胞生長(zhǎng)[28]、遷移和分化等方面發(fā)揮著重要作用，其不僅通過(guò)抑制卵母細(xì)胞凋亡、參與BMPs/SMADS經(jīng)典信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)卵泡生長(zhǎng)的調(diào)控，降低原始卵泡閉鎖[29]；還通過(guò)PI3K/PDK-1/AKT信號(hào)通路抑制牛顆粒細(xì)胞的凋亡[28]。SMAD1、SMAD5和SMAD8是BMP受體下游激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的主要組成部分[30]，干擾siASH1L下調(diào)了卵丘細(xì)胞中SMAD6基因的mRNA表達(dá)水平，可見(jiàn)ASH1L對(duì)TGF-β信號(hào)通路的重要調(diào)控作用。

差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析表明，ASH1L蛋白可能通過(guò)細(xì)胞黏附分子和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中CLDN6同時(shí)參與這兩個(gè)通路。CLDN6是一種緊密連接蛋白，也是早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的標(biāo)記物[31]；CLDN6異常表達(dá)會(huì)破壞緊密連接的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖、遷移和侵襲[32]。CLDN6在小鼠胎兒上皮細(xì)胞中表達(dá)，并在內(nèi)胚層組織中具有重要作用，其表達(dá)水平與上皮細(xì)胞的去分化及惡性增殖相關(guān)，同時(shí)也是囊胚形成所必需的[33]。CLDN6基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致小鼠細(xì)胞增殖/凋亡失衡，從而使小鼠發(fā)育遲緩[34]；BMP信號(hào)通路的抑制劑NOG可拮抗其表達(dá)，表明CLDN6可能通過(guò)TGF-β/BMP通路調(diào)控囊胚的形成和早期胎兒上皮細(xì)胞增殖[35]，推測(cè)CLDN6可能是ASH1L的下游靶標(biāo)。類(lèi)似地，對(duì)包裹水牛GV/MII期卵母細(xì)胞外周的卵丘細(xì)胞進(jìn)行miRNA測(cè)序，結(jié)果篩選的差異表達(dá)miRNAs也主要通過(guò)細(xì)胞連接和細(xì)胞增殖等途徑在卵丘細(xì)胞中發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟[36]。

4 結(jié) 論

本研究在牛卵丘細(xì)胞中檢測(cè)到ASH1L mRNA和蛋白的表達(dá)，敲低該基因的表達(dá)可改變卵丘細(xì)胞的表達(dá)譜，通過(guò)分析基因表達(dá)差異、可變剪切和SNP位點(diǎn)，證明ASH1L參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞連接和H3K4特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性等過(guò)程，且其對(duì)細(xì)胞黏附分子和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等通路具有調(diào)控作用，為深入研究ASH1L在卵丘細(xì)胞生長(zhǎng)和胚胎發(fā)育中的功能提供理論基礎(chǔ)。