段晨瑩，李 欣，趙俊金，李茹意，趙羚均，郭冠華,4，楊利國(guó)，滑國(guó)華*，王 棟*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118； 3.全國(guó)畜牧總站，北京 100125； 4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801；5.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使奶牛冷凍精液普及率已達(dá)95%以上，重點(diǎn)奶源區(qū)更是高達(dá)100%[1]，大大提升了優(yōu)良種公畜繁殖效率，提高了奶牛場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益。然而，隨著人工授精技術(shù)的普及，對(duì)優(yōu)良種公畜精液品質(zhì)和數(shù)量的要求也越來(lái)越高。研究表明，生產(chǎn)中每管凍精中活精子數(shù)約為1 500～2 000萬(wàn)個(gè)，可獲得約53%的產(chǎn)犢率[2]，即約有47%的凍精產(chǎn)品不能產(chǎn)生后代，除了母牛和輸精技術(shù)原因外，精子發(fā)生與變形不充分等精液質(zhì)量問(wèn)題也嚴(yán)重制約了種公畜繁殖力。另外，不孕不育已成為人類關(guān)注的焦點(diǎn)，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，大約10%～15%的育齡夫婦不孕不育[3]，其中，因男性因素導(dǎo)致的不育約占40%～50%[4-6]。由此可見(jiàn)，精子形成過(guò)程中導(dǎo)致的精液質(zhì)量問(wèn)題已成為雄性繁殖障礙的主要因素。

精子發(fā)生和精子變形是精子形成中的兩個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程，是影響雄性(或男性)生育力的關(guān)鍵。精原細(xì)胞經(jīng)歷了有絲分裂產(chǎn)生精母細(xì)胞、精母細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生精細(xì)胞以及圓形精子細(xì)胞變形3個(gè)重要階段，最終形成有頭有尾的蝌蚪狀精子[7-9]。這個(gè)漫長(zhǎng)而有序的過(guò)程受到多種因素的嚴(yán)格調(diào)控[9]，任何細(xì)微錯(cuò)誤均會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，并產(chǎn)生畸形精子，造成不孕不育，影響家畜繁殖率。研究表明，幾乎90%的男性不育患者都具有不同程度的精子發(fā)生障礙[6,10]，如無(wú)精癥、少精癥等?；尉映^(guò)20%會(huì)影響公畜的繁殖力[11]；當(dāng)正常精子百分率低于4%時(shí)，男性不育[12]。即便對(duì)于形態(tài)正常的精子，也檢測(cè)到了一定比例的不孕不育[5, 13]。深入探索精子形成的分子調(diào)控機(jī)制，將促進(jìn)精子發(fā)生和精子變形調(diào)控技術(shù)的研發(fā)，為提高種公畜精液品質(zhì)及產(chǎn)量提供新思路，并為男性不育的診斷和治療提供重要參考。

ADP-核糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications，PTMs)的一個(gè)重要類型，在ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(ADP-ribosyl transferases，ARTs)催化下，使蛋白質(zhì)氨基酸殘基發(fā)生可逆性聚/單-ADP-核糖基化，調(diào)控蛋白質(zhì)功能[14]。多項(xiàng)研究表明，ADP-核糖基化可通過(guò)調(diào)節(jié)生精細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)，促進(jìn)斷裂DNA修復(fù)、維持基因組穩(wěn)定和染色質(zhì)重塑，調(diào)控細(xì)胞增殖與分化和細(xì)胞周期等多個(gè)生物學(xué)事件[15-17]。然而，ADP-核糖基化直到五十多年前才被發(fā)現(xiàn)，Collier團(tuán)隊(duì)和Mandel團(tuán)隊(duì)在細(xì)菌毒素中先后鑒定出單-ADP-核糖基(mono-ADP-ribose，MAR)和聚-ADP-核糖基(poly-ADP-ribose，PAR)[18-19]。近年來(lái)，ADP-核糖基化對(duì)精子形成的作用逐漸被重視，并發(fā)現(xiàn)了聚-ADP-核糖基化和單-ADP-核糖基化兩種修飾類型[14]，本團(tuán)隊(duì)前期研究也發(fā)現(xiàn)其在精子變形中發(fā)揮了重要作用[20]。進(jìn)一步探索ADP-核糖基化修飾對(duì)精子形成的作用，將促進(jìn)精子形成分子調(diào)控機(jī)制的深入研究。

1 ADP-核糖基化概述

ADP-核糖基化是以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)為底物，在ARTs催化下，將ADP-核糖基轉(zhuǎn)移至目標(biāo)蛋白的ADP-核糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。目前，已發(fā)現(xiàn)800多種蛋白含有該結(jié)構(gòu)域，證明了ADP-核糖基化對(duì)生命的廣泛意義[21]。ADP-核糖基化可分別由ARTs亞家族聚-ADP-核糖基聚合酶(poly-ADP-ribose polymerases，PARPs)和ecto-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(ecto-ADP-ribosyl transferases，ecto-ARTs)催化，生成高負(fù)電荷的PAR或MAR，并將其轉(zhuǎn)移至靶蛋白氨基酸殘基上，完成對(duì)目標(biāo)蛋白的聚/單-ADP-核糖基化修飾，調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白質(zhì)功能。然而，最新酶學(xué)證據(jù)表明，PARPs中只有PARP1、PARP2和PARP5a、PARP5b能催化生成PAR[22]，而大多數(shù)成員催化生成MAR，其他PARPs酶活性尚未得到證實(shí)[21,23-24]。為此，基于ARTs催化反應(yīng)產(chǎn)物的不同及其與細(xì)菌毒素催化結(jié)構(gòu)域的同源性，Hottiger等[14, 25]對(duì)其重新進(jìn)行命名，PARPs均與白喉毒素同源，所以命名為白喉毒素樣-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(Diphtheria toxin-like ADP-ribosyl transferases，ARTDs)；ecto-ARTs均與霍亂毒素C2和C3同源，所以命名為霍亂毒素樣-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(Cholera toxin-like ADP-ribosyl transferases，ARTCs)。

目前，已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的17個(gè)ARTDs亞家族成員，其中，PARP1是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)且發(fā)揮ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性(約90%)最主要的亞型[22,26]。ARTCs亞家族是一組分子量相對(duì)較小、結(jié)構(gòu)相關(guān)的細(xì)胞外單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，表達(dá)于細(xì)胞表面或分泌于細(xì)胞外[17]。目前，發(fā)現(xiàn)了6種哺乳動(dòng)物ARTCs(ARTC1、ARTC2.1和ARTC2.2、ARTC3、ARTC4和ARTC5)，其中4種在人上被檢測(cè)到，在人ARTC2基因序列中檢測(cè)到3個(gè)終止密碼子，終止密碼子的過(guò)早出現(xiàn)，使其成為無(wú)功能的假基因[24,27]。ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶具有DNA損傷修復(fù)、染色體分離調(diào)控作用，其在精子發(fā)生中作用的發(fā)現(xiàn)，凸顯了對(duì)ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶研究的重要性，也為深入揭示精子發(fā)生機(jī)制，提高雄性生殖能力，提供了新思路。

2 ARTDs在精子形成中的作用

2.1 調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂過(guò)程

有絲分裂和減數(shù)分裂是精子形成的兩個(gè)重要階段，受到了紡錘體、著絲粒和端粒等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精細(xì)調(diào)節(jié)。紡錘體產(chǎn)生于細(xì)胞分裂前初期到末期，主要由微管(通常稱為紡錘絲)構(gòu)成。紡錘絲通過(guò)著絲點(diǎn)(動(dòng)粒)附著在著絲粒上，在細(xì)胞分裂過(guò)程中調(diào)控染色體的排列，并協(xié)助將同源染色體或姐妹染色單體分開，均等地分配到子細(xì)胞中。這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的任何缺陷，都可能導(dǎo)致染色體分離異常，影響精子質(zhì)量，甚至引起雄性不育[28]。Bub3(budding uninhibited by benzimidazoles 3)是一種紡錘體組裝檢查點(diǎn)(spindle assembly checkpoint，SAC)蛋白，分裂后期開始前在著絲粒短暫積累[29-30]，與BUB1(budding uninhibited by benzimidazoles 1)、BubR1(budding uninhibited by benzimidazole-related 1)形成復(fù)合體，行使有絲分裂紡錘體檢查點(diǎn)功能，確保所有染色體都能與紡錘體正確連接，在正常情況下牽引染色體在赤道板正確對(duì)齊和準(zhǔn)確分離[30]。CENPA、CENPB則是著絲粒的組成性蛋白，對(duì)于著絲點(diǎn)的正確組裝和功能十分重要[31-32]。研究表明，PARP1主要在有絲分裂中期和前中期定位于著絲粒，使CENPA、CENPB和Bub3發(fā)生聚-ADP-核糖基化[32-33]，PARP1/PARP2基因缺失小鼠，減數(shù)分裂Ⅰ期染色體分離異常，紡錘體與著絲點(diǎn)的連接也異常[34]。由此推測(cè)，ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶PARP1/PARP2直接促進(jìn)了紡錘體和著絲點(diǎn)的連接，或通過(guò)影響CENPA、CENPB功能和Bub3與BUB1、BubR1的相互作用，調(diào)控紡錘體組裝檢查點(diǎn)的功能，確保將紡錘絲組裝到著絲點(diǎn)上，進(jìn)而影響減數(shù)分裂(圖1)。

而ARTDs家族的PARP5a(tankyrase-1)和PARP5b(tankyrase-2)可能是通過(guò)將紡錘絲連接到中心體，并維持其穩(wěn)定性。William團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，PARP5a/PARP5b與紡錘極蛋白NuMA(nuclear mitotic apparatus)共定位于紡錘極，并使NuMA發(fā)生聚-ADP-核糖基化[35-36]。小分子RNA干擾PARP5a后不影響NuMA定位，但未檢測(cè)到NuMA的ADP-核糖基化，很遺憾該試驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行NuMA功能檢測(cè)[35]。聚-ADP-核糖水解酶(poly-ADP-ribose glycohydrolase，PARG)的功能與PARP5a正好相反，可降解NuMA的PAR，研究表明，紡錘體組裝后添加PARG，可使紡錘體極從中心體脫落，并與染色體結(jié)合，而組裝前添加PARG則可使紡錘極直接與染色體結(jié)合[33,36]，紡錘體組裝異常。據(jù)此推測(cè)，PARP5a/PARP5b的聚-ADP-核糖基化與NuMA定位于紡錘極無(wú)關(guān)，但卻關(guān)系到其行使功能(圖1)。產(chǎn)生PAR的ARTDs家族成員對(duì)細(xì)胞分裂過(guò)程中紡錘體功能的調(diào)控至關(guān)重要，深入揭示紡錘體結(jié)構(gòu)的ADP-核糖基化調(diào)控機(jī)制，將促進(jìn)對(duì)精子發(fā)生機(jī)制的探索。

哺乳動(dòng)物端粒長(zhǎng)度具有物種特異性，并能穩(wěn)定遺傳給后代[37]，在生命過(guò)程中，染色體端粒會(huì)逐漸變短，其對(duì)染色體末端的保護(hù)能力也將逐漸減弱，縮短到一定程度后將導(dǎo)致染色體降解。端粒DNA結(jié)合蛋白TRF1(telomeric repeat binding factor1，TRF1)可抑制端粒酶使端粒變長(zhǎng)的作用，從而使其維持在正常長(zhǎng)度[38]。PARP1和PARP5a/PARP5b使TRF1發(fā)生聚-ADP-核糖基化[39-40]，過(guò)多負(fù)電荷的引入使TRF1與端粒DNA靜電互斥增強(qiáng)，減弱了對(duì)端粒酶活性的抑制，使端粒長(zhǎng)度變長(zhǎng)[35]。PARP5a過(guò)表達(dá)使端粒DNA釋放TRF1，端粒與端粒酶的緊密結(jié)合，促進(jìn)了端粒延長(zhǎng)[41]。PARP1和PARP5a/PARP5b通過(guò)聚-ADP-核糖基化調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度，維持了染色體穩(wěn)定性。但PARP5a/PARP5b缺乏PARP1所具有的可被DNA損傷激活的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[39]，其是否能對(duì)斷裂DNA鏈進(jìn)行修復(fù)還需進(jìn)行深入研究。由此推測(cè)，聚-ADP-核糖基化的端粒長(zhǎng)度調(diào)控作用，可能影響精子發(fā)生，從而影響精液品質(zhì)(圖1)。因此，深入分析精細(xì)胞中端粒結(jié)構(gòu)的ADP-核糖基化作用，將為揭示精子發(fā)生機(jī)制提供新思路。

2.2 ARTDs對(duì) DNA損傷修復(fù)的兩面性

近年來(lái)，精子DNA損傷與雄性不育的關(guān)系逐漸受到關(guān)注，也開拓了通過(guò)探索損傷修復(fù)機(jī)制進(jìn)行育性恢復(fù)的研究思路。研究表明，當(dāng)DNA片段損傷指數(shù)超過(guò)15%時(shí)，精液質(zhì)量顯著降低，且DNA損傷指數(shù)越高，精液質(zhì)量越低[42]，甚至造成雄性不育。

圖1 PARPs調(diào)控細(xì)胞分裂機(jī)制的模式圖Fig.1 Pattern diagram of the mechanism by which PARPs regulate cell division

DNA損傷包括DNA單鏈斷裂(single-stranded break，SSB)和DNA雙鏈斷裂(double-stranded break，DSB)兩種形式。已經(jīng)證明，精子形成過(guò)程中可借助PARP途徑通過(guò)聚-ADP-核糖基化修復(fù)DNA損傷，并且以SSB修復(fù)為主[43]。其中，PARP1參與了該途徑80%～90%的DNA損傷修復(fù)[43-44]。PARP1是由1 014個(gè)氨基酸殘基組成的有催化活性和自修飾活性的蛋白質(zhì)，包含3個(gè)重要的結(jié)構(gòu)功能域：N端為含核定位信號(hào)(nuclear localisation sequence，NLS)和兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合域(DNA-binding domain，DBD)，C端為自動(dòng)化修飾結(jié)構(gòu)域(auto-modification domain，AMD)和催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domains，CD)[26,45]。正常生理?xiàng)l件下，PARP1的活性較低，DNA損傷時(shí)，PARP1借助于NLS靶向細(xì)胞核，通過(guò)本身的鋅指結(jié)構(gòu)識(shí)別斷裂的DNA結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合[23]，激活C端CD使其與底物NAD+結(jié)合，依次將多個(gè)NAD+的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移至受體蛋白及PARP1本身的氨基酸殘基，然后PARP1與DNA修復(fù)蛋白XRCC1和其他互作蛋白在DNA 斷裂處積累，完成對(duì)SSB修復(fù)[44-48]。ARTDs中PARP2的催化結(jié)構(gòu)域與PARP1最為相似(相似性69%)，也可被DNA鏈斷裂激活，兩者在DNA損傷修復(fù)中的作用也可能相似[45]。然而，PARP1/PARP2對(duì)DSB損傷的修復(fù)仍不清晰。目前，有兩種關(guān)于PARP1/PARP2修復(fù)DSB損傷機(jī)制的猜測(cè)：一種是PARP1/PARP2通過(guò)C-NHEJ通路或A-NHEJ通路，調(diào)節(jié)NHEJ因子(non-homologous end joining)參與DSB修復(fù)[40]；另一種是PARP1/PARP2通過(guò)調(diào)節(jié)SSB修復(fù)途徑間接影響DSB修復(fù)[15]。這些發(fā)現(xiàn)表明，ARTDs通過(guò)調(diào)控DNA損傷修復(fù)維持了基因組穩(wěn)定性(圖2)。

適當(dāng)?shù)腜AR核積累可促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，而PAR過(guò)度累積則不利于細(xì)胞存活。因?yàn)镈NA大量損傷將使PARP過(guò)度激活，造成細(xì)胞內(nèi)NAD+過(guò)度消耗，ATP的耗竭導(dǎo)致了細(xì)胞死亡[49-51]。然而，Andrabi等[52]在檢測(cè)過(guò)度DNA損傷細(xì)胞的PAR水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞死亡不僅僅是因?yàn)镻ARPs過(guò)度激活導(dǎo)致ATP耗竭，很大程度上還取決于PAR的大小和濃度，因?yàn)檫^(guò)量的PAR可能造成細(xì)胞毒性，而PARG預(yù)處理則可大大減少細(xì)胞死亡。鑒于PARP產(chǎn)物PAR的兩面性，深入研究過(guò)度DNA損傷引起的PAR積累調(diào)控機(jī)制，將為促進(jìn)DNA損傷修復(fù)及提高細(xì)胞生存能力提供理論指導(dǎo)。

2.3 參與精子細(xì)胞核染色質(zhì)重塑

為確保精子順利通過(guò)漫長(zhǎng)的雌性生殖道到達(dá)受精部位，將父本基因組遺傳信息成功傳遞給下一代[53]，DNA結(jié)構(gòu)在TOP2B (DNA topoisomerase II beta，TOP2B)作用下，從超螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)榉浅菪沙趹B(tài)[54]。TOP2B引起短暫的DNA鏈斷裂，瞬間激活PARP1，產(chǎn)生的PAR可幫助修復(fù)受損DNA，并因其攜帶負(fù)電荷與DNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合核心組蛋白和組蛋白H1，使組蛋白從染色體中釋放出來(lái)，促使過(guò)渡蛋白和魚精蛋白依次取代組蛋白，完成染色質(zhì)重塑，并修復(fù)斷裂DNA，然后啟動(dòng)PARG降解機(jī)制，降解PAR[16,54-58]。與PARP1一樣，PARP2也可作用于組蛋白H2，參與染色質(zhì)重塑[45,57](圖3)。如果染色體重塑異常引發(fā)了較高比例的DNA損傷、魚精蛋白交換不足，將會(huì)導(dǎo)致雄性生育能力降低[59]。研究表明，哺乳動(dòng)物精子染色體核蛋白以魚精蛋白為主，組蛋白不足5%[16]。而人類精子組蛋白可達(dá)10%～15%，但組蛋白超過(guò)25%則會(huì)導(dǎo)致不育[60]。通過(guò)ADP-核糖基化的嚴(yán)格調(diào)控，確保了精子染色質(zhì)重塑準(zhǔn)確有序。深入揭示精子染色質(zhì)重塑調(diào)控機(jī)理，將有助于改善精液質(zhì)量，提升家畜繁殖效率。

A. PARP1蛋白結(jié)構(gòu)圖；B. 生理及病理?xiàng)l件下PARPs調(diào)控DNA損傷修復(fù)機(jī)制模式圖A. The protein structure of PARP1; B. Pattern diagram of the PARPs regulating DNA damage repair under physiological and pathological conditions圖2 PARP1蛋白結(jié)構(gòu)及其調(diào)控DNA損傷修復(fù)兩面性機(jī)制的模式圖Fig.2 Pattern diagram of the PARP1 protein structure and its dual mechanism of regulating DNA damage repair

3 ARTCs在精子形成中的作用

除了ARTD亞家族外，ARTC亞家族也逐漸被發(fā)現(xiàn)，其中，研究較為廣泛的是具有單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的ARTC1和ARTC2，可使α7β1、αLβ2、CD8、CD44等許多細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞外靶蛋白發(fā)生單-ADP-核糖基化[61]。ARTC1主要在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，參與骨骼肌分化和中性粒細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)[17]，ARTC2主要表達(dá)于T細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)[62]。ARTC3和ARTC4則因缺乏精氨酸特異性催化結(jié)構(gòu)域R-S-EXE，可能不具有單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性[63]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，ARTC3在小鼠圓形精細(xì)胞和長(zhǎng)形精細(xì)胞表達(dá)，還在牛的初級(jí)精母細(xì)胞表達(dá)，可能在精子形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20]。ARTC3在人睪丸中表達(dá)[61]，與人非梗塞性無(wú)精癥[64]和精子減少[65]相關(guān)，該基因缺失，可能導(dǎo)致雄性不育[66]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ARTC3在人精母細(xì)胞中表達(dá)，可能與精母細(xì)胞分裂過(guò)程和精子發(fā)生有關(guān)[66-67]。相對(duì)于ARTDs在精子形成過(guò)程中的廣泛研究，對(duì)ARTCs家族成員功能的研究只是冰山一角，但其在精子形成中的作用不可忽視。對(duì)ARTCs在精子發(fā)生中生物學(xué)功能的研究任重而道遠(yuǎn)，將為解決家畜繁殖障礙和人類雄性不育問(wèn)題提供新思路。

4 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，ARTs家族成員，尤其是ARTDs參與了精子形成多個(gè)生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，可作為治療雄性不育的重要靶點(diǎn)。同時(shí)，因?yàn)樗c雄性生育力的較強(qiáng)相關(guān)關(guān)系，ARTs有望成為評(píng)估雄性生育力的重要指標(biāo)。但目前關(guān)于ARTs參與精子形成的調(diào)控機(jī)制只是局部性的、階段性的、碎片化的，對(duì)該家族在精子形成過(guò)程中調(diào)控機(jī)制的深入研究，將有助于提升精子質(zhì)量和生產(chǎn)效率，并為治療雄性不育提供新思路。