馬 會，高 梅，李 雪，趙文靜，英 永

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點實驗室，山東 濟南 250101）

近年，中藥及其復(fù)方的安全性越來越受到重視，特別是復(fù)方中藥毒性復(fù)雜，一些不合理的配伍還會產(chǎn)生增毒作用或新的毒性物質(zhì)[1]。三七紅曲復(fù)方制劑是以三七和紅曲粉為主要原料，經(jīng)科學(xué)配方制成的一種調(diào)節(jié)血脂的保健食品。三七中含有活性成分三七總皂苷，被廣泛用于心腦血管系統(tǒng)疾病[2-3]。紅曲粉含有活性成分洛伐他汀，具有降血脂的藥理作用[4-8]。由于紅曲霉在發(fā)酵過程中可能產(chǎn)生桔霉素，而桔霉素被證實具有致畸性，因而使紅曲的安全性受到關(guān)注[9]。目前三七和紅曲的毒理學(xué)研究資料相對較少，更未見有紅曲與三七配伍后復(fù)方的遺傳毒性研究。因此，本研究參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15193系列標(biāo)準(zhǔn)[10-12]及《保健食品及其原料安全性毒理學(xué)檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（2020年版）[13]對三七紅曲復(fù)方制劑進(jìn)行了Ames試驗、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗、小鼠睪丸染色體畸變試驗，以評價其安全性，為臨床使用提供重要參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物、菌株

動物：SPF級KM小鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，體重28～33 g，6～7周齡，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0011；動物飼養(yǎng)于SPF級飼養(yǎng)室，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2018 0031，飼養(yǎng)室溫度20～26 ℃，濕度40 %～70 %，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。

菌株：鼠傷寒沙門菌TA97a、TA 98、TA100、TA102和TA1535，購自美國Moltox公司。

1.2 樣品與試劑

三七紅曲復(fù)方制劑（山東省藥學(xué)科學(xué)院提供，批號為180901）；疊氮鈉（山東西亞化學(xué)試劑有限公司，批號為S7470）；4-硝基喹啉-N-氧化物（Sigma-Aldrich公司，批號為WXBC7389V）；2-氨基芴（Sigma-Aldrich公司，批號為STBF2332V）；1,8-二羥基蒽醌（Sigma-Aldrich公司，批號為WXBB7902V）；環(huán)磷酰胺（Sigma-Aldrich公司，批號為C0768）；絲裂霉素C（Roche公司，批號為10107409001）。

1.3 儀器

HFsafe-1500TE生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SSW-600-2S電熱恒溫水槽（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；LMQ.C立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；XK97-A菌落計數(shù)器（金壇市榮華儀器制造有限公司）；Nexcope生物顯微鏡（耐可視中國營業(yè)總部）；AUW120D電子分析天平（日本島津有限公司）。

2 方法

2.1 Ames試驗

在有和無代謝活化系統(tǒng)系統(tǒng)（±S9）條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法進(jìn)行試驗。正式試驗前，對所用菌株進(jìn)行了組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷鑒定、uvrB修復(fù)缺陷型鑒定、R因子（抗氨芐青霉素）鑒定、四環(huán)素抗性鑒定、自發(fā)回變菌落數(shù)鑒定和陽性誘變劑敏感性鑒定，經(jīng)鑒定合格。三七紅曲復(fù)方制劑設(shè)5個劑量組，第一次試驗劑量為5000，2500，1250，625，312.5 μg/皿，第二次試驗劑量為5000，1000，200，40，8 μg/皿，兩次均設(shè)置溶媒對照組和陽性對照組。在2 ml頂層培養(yǎng)基中，分別加入測試菌液0.1 ml、樣品溶液0.1 ml（活化時再加S9混合液0.5 ml），混勻后迅速倒入底層培養(yǎng)基平皿內(nèi)，轉(zhuǎn)動平皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層培養(yǎng)基上，平放固化。將培養(yǎng)皿倒置于37±1 ℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗

將檢疫合格的50只KM小鼠隨機分為溶媒對照組（純水）、三七紅曲復(fù)方制劑低、中、高劑量組和陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40 mg/kg），每組10只，雌雄各半。試驗采用最大劑量法進(jìn)行，低、中、高劑量分別設(shè)計為2，4，8 g/(kg·d)-1。各組均按照20 ml/kg體積灌胃給予相應(yīng)溶液，每日1次，連續(xù)灌胃2 d，末次給藥后6 h取胸骨制備骨髓涂片，甲醇固定、Gimesa染色后鏡檢，每只動物計數(shù)200個紅細(xì)胞以確定嗜多染紅細(xì)胞（PCE）占總紅細(xì)胞（PCE+NCE）的比例，計數(shù)2000個嗜多染紅細(xì)胞以測定有微核率嗜多染紅細(xì)胞頻率。

2.3 小鼠睪丸染色體畸變試驗

將檢疫合格的25只雄性KM小鼠隨機分為溶媒對照組（純水）、三七紅曲復(fù)方制劑低、中、高劑量組和陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40 mg/kg），每組5只。試驗采用最大劑量法進(jìn)行，低、中、高劑量分別為2，4，8 g/(kg·d)-1，給藥容積為20 ml/kg，每日灌胃給藥1次，連續(xù)5 d，各組動物在第14天腹腔注射秋水仙素（劑量為6 mg/kg）溶液，3～5 h后取兩側(cè)睪丸，經(jīng)低滲、固定、離心、滴片制備標(biāo)本。Gimesa染色后鏡檢，每個動物計數(shù)100個中期分裂相細(xì)胞，計算細(xì)胞畸變率。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 結(jié)果

3.1 Ames試驗結(jié)果

在有和無代謝活化系統(tǒng)的條件下，5種菌株陽性對照組的回復(fù)突變菌落數(shù)均高于相應(yīng)溶媒對照菌落數(shù)的兩倍以上，有顯著性差異（P≤0.05），表現(xiàn)出預(yù)期陽性結(jié)果。洪齊之康膠囊在5000，2500，1250，625，312.5 μg/皿劑量下和在5000，1000，200，40，8 μg/皿劑量下的回變菌落數(shù)與溶媒對照組比較均無顯著性增加（P＞0.05），且無劑量反應(yīng)關(guān)系，其中2500，5000 μg/皿劑量組的平皿有沉淀產(chǎn)生，但不影響計數(shù)。兩次試驗結(jié)果均表明該樣品無誘導(dǎo)組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌基因突變作用。結(jié)果見表1、表2。

表1 Ames試驗結(jié)果（第1次，±s，n=3）

表1 Ames試驗結(jié)果（第1次，±s，n=3）

注：*P≤0.05 vs 溶媒對照組；①4-硝基喹啉-N-氧化物（0.5 μg/皿）；②疊氮鈉（1.5 μg/皿）；③絲裂霉素C（0.5 μg/皿）；④2-氨基芴（10 μg/皿）；⑤1,8-二羥基蒽醌（50 μg/皿）；⑥環(huán)磷酰胺（200 μg/皿）

TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535(-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9溶媒對照組 153.7±11.7 174.3±178.0 25.0±2.6 28.3±7.6 148.3±22.5 166.7±22.3 213.3±9.3 280.3±27.0 15.7±3.1 13.3±7.6陽性對照組 370.3±43.1*①組別/μg·皿-1 283.7±19.8*⑥312.5 167.7±10.6 162.3±18.1 20.7±4.9 28.3±7.6 148.7±9.3 160.0±25.5 218.7±14.7 271.3±16.6 13.3±3.8 15.0±9.0 625 174.0±9.2 165.7±11.6 25.3±0.6 21.3±2.1 129.7±12.5 164.3±17.7 215.3±3.2 277.0±31.8 13.0±5.3 19.7±5.5 1250 153.3±13.9 167.7±9.0 22.0±3.5 22.0±1.0 141.3±30.9 152.7±27.1 209.3±11.0 275.3±14.3 10.7±1.2 12.3±4.2 2500 143.0±8.9 152.0±3.6 21.3±5.5 25.7±3.1 121.7±5.0 126.7±6.1 206.3±7.8 242.3±18.0 8.7±2.3 15.3±4.9 5000 150.3±11.0 154.67±8.0 20.0±4.4 21.0±2.0 135.0±12.8 148.7±14.7 209.3±5.9 260.0±16.5 9.0±2.0 14.0±3.6 2149.3±221.9*④386.7±32.3*①3248.0±304.0*④866.7±157.2*②1594.7±201.3*④1117.3±44.1*③1253.3±232.0*⑤816.0±213.3*②

表2 Ames試驗結(jié)果（第2次，±s，n=3）

表2 Ames試驗結(jié)果（第2次，±s，n=3）

注：同上

TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535(-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9溶媒對照組 160.3±9.8 153.7±9.2 20.3±1.2 22.3±2.1 137.0±19.5 160.7±20.3 229.7±4.0 247.0±17.1 13.7±2.1 17.3±1.5陽性對照組 397.3±99.9*①組別/μg·皿-1 285.0±24.8*⑥8 162.7±8.6 152.7±4.5 21.0±1.0 23.0±2.0 143.0±18.5 157.7±16.2 223.7±8.5 243.7±12.9 12.0±2.6 15.0±1.0 40 146.3±10.2 157.0±7.5 21.0±3.0 21.7±0.6 131.7±21.0 160.7±17.6 216.7±16.0 253.3±8.0 12.3±1.5 13.0±3.0 200 160.3±7.6 163.0±7.9 25.0±2.6 22.7±3.8 131.7±7.1 160.0±19.5 213.7±12.9 247.3±10.2 13.0±1.7 16.0±4.4 1000 137.7±20.2 156.3±16.6 23.7±3.2 25.0±3.6 161.0±4.6 154.0±17.0 222.0±5.2 233.7±15.4 11.7±1.5 14.7±5.7 5000 135.7±10.4 142.3±10.6 22.0±3.6 23.0±4.4 147.7±6.1 154.0±11.3 222.7±20.6 240.7±11.5 11.7±3.1 13.3±4.2 504.0±25.0*④284.3±37.2*①3355.3±522.3*④1496.0±81.2*②1869.3±473.6*④1045.3±128.3*③1333.3±124.3*⑤973.3±275.1*②

3.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗結(jié)果

陽性對照組的PCE/（PCE+NCE）比值與溶媒對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），微核率有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P≤0.05），說明試驗系統(tǒng)可靠。三七紅曲復(fù)方制劑各劑量組的PCE/（PCE+NCE）比值和微核率與溶媒對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），未見骨髓細(xì)胞抑制毒性誘導(dǎo)微核升高的作用，試驗結(jié)果為陰性。結(jié)果見表3。

表3 小鼠骨髓微核試驗結(jié)果（±s，n=5）

注：*P≤0.05 vs 溶媒對照組；PCE：嗜多染紅細(xì)胞；NCE：正染紅細(xì)胞。

組別 劑量/g·kg-1 微核率/ ‰ PCE/（PCE+NCE）雌性 雄性 雌性 雄性溶媒對照組 / 2.19±0.84 1.99±0.71 0.64±0.05 0.69±0.06低劑量組 2 2.08±0.42 1.88±0.70 0.68±0.03 0.63±0.02中劑量組 4 2.16±0.87 2.58±0.94 0.67±0.05 0.64±0.05高劑量組 8 1.99±0.61 1.89±0.42 0.66±0.04 0.70±0.07陽性對照組 0.04 18.08±4.13* 19.14±1.70* 0.62±0.04 0.64±0.13

3.3 小鼠睪丸染色體畸變試驗結(jié)果

與溶媒對照組比較，陽性對照組的斷裂、缺失、相互易位、有著絲點環(huán)狀染色體、單價體、細(xì)胞畸變率均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），三七紅曲復(fù)方制劑各劑量組的斷裂、缺失、相互易位、環(huán)狀染色體、單價體、細(xì)胞畸變率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），試驗結(jié)果為陰性，結(jié)果見表4。

表4 小鼠睪丸染色體畸變試驗結(jié)果（±s，n=5）

表4 小鼠睪丸染色體畸變試驗結(jié)果（±s，n=5）

注：*P≤0.05 vs 溶媒對照組

組別 溶媒對照組 低劑量組中劑量組高劑量組 陽性對照組劑量/g·kg-1 / 2 4 8 0.04動物只數(shù) 5 5 5 5 5觀察細(xì)胞數(shù)目 500 500 500 500 500畸變率/% 1.80±0.45 1.80±0.84 2.00±0.71 2.20±1.30 12.80±3.11*畸變類型斷裂 3 2 1 6 18*缺失 1 1 1 2 7*有著絲點環(huán) 1 2 1 2 8*無著絲點環(huán) 0 0 1 0 1微小體 2 2 3 0 0非特定型變化 2 0 0 1 1相互易位 0 2 3 0 31*裂隙 2 1 6 2 8性染色體單價體 2 3 3 7 13*常染色體單價體 1 0 2 2 12*

4 討論

三七紅曲復(fù)方制劑是由三七和紅曲組成的復(fù)方中藥，其作用機制及成分間的相互作用較復(fù)雜，且紅曲中可能會伴有毒性雜質(zhì)——桔霉素，增加用藥風(fēng)險。三七作為傳統(tǒng)藥材，其遺傳毒理學(xué)資料多為活性成分的研究，結(jié)果均為無潛在的遺傳毒性[14-16]。紅曲的毒性研究多關(guān)注在桔霉素的影響，有文獻(xiàn)報道[17-18]，并不是所有的紅曲菌株均產(chǎn)生桔霉素，即使產(chǎn)生也僅在發(fā)酵晚期。此外，紅曲的毒性研究文獻(xiàn)表明未見其有遺傳毒性作用[19-20]。為充分考察三七紅曲復(fù)方制劑是否具有遺傳毒性，本研究選擇遺傳毒性組合試驗進(jìn)行，包括Ames試驗、骨髓細(xì)胞微核試驗、睪丸染色體畸變試驗。Ames試驗是應(yīng)用最廣泛的檢測基因突變的體外試驗，具有快速、方便、靈敏性好等特點[21]。骨髓細(xì)胞微核試驗可檢測染色體或有絲分裂是否受到損傷，是評價哺乳動物體細(xì)胞遺傳毒性的細(xì)胞水平手段，睪丸染色體畸變試驗是從染色體水平評價生殖細(xì)胞遺傳突變的可能性[22-23]。

參照《保健食品及其原料安全性毒理學(xué)檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（2020年版）和食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[10-13]，Ames試驗采用推薦的最高劑量5 mg/皿，在首次試驗的312.5～5000 μg/皿劑量范圍內(nèi)和重復(fù)試驗的8～5000 μg/皿劑量范圍內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)受試菌株的回復(fù)突變菌落數(shù)有劑量依賴性增加，判定結(jié)果為陰性。小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗和小鼠睪丸染色體畸變試驗均采用最大灌胃劑量法，受試樣品在2～8 g/kg劑量范圍內(nèi)對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核率和睪丸染色體的形態(tài)變化無明顯影響。以上結(jié)果表明三七紅曲復(fù)方制劑無誘發(fā)基因突變及染色體損傷的作用。

綜上，在本試驗條件下，三七紅曲復(fù)方制劑作為保健食品無潛在的遺傳毒性。