劉 磊，張美霞，廉少杰，康傳利，湯麗偉，劉 薔，張夢(mèng)益，李 慶

（山東焦點(diǎn)福瑞達(dá)生物股份有限公司，山東 曲阜 273100）

胃病的發(fā)生與胃黏膜損傷密切相關(guān)，胃黏膜受損將加快病情進(jìn)展。導(dǎo)致胃黏膜損傷的主要因素包括物理因素和化學(xué)因素[1]。其中，長(zhǎng)期進(jìn)食過熱或過冷的食物、烈酒、濃茶或刺激性藥物如消炎痛（吲哚美辛腸溶片）等，均使胃內(nèi)黏液減少，引起黏膜微循環(huán)障礙，削弱脂蛋白膜對(duì)胃的保護(hù)作用[2]。臨床治療中，西藥治療雖有一定療效，但停藥后易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期使用毒副作用大。天然活性物質(zhì)因其長(zhǎng)效、溫和、低毒副作用等諸多優(yōu)勢(shì)越來越得到重視。

透明質(zhì)酸（HA）又稱玻璃酸、玻尿酸，廣泛存在于生物體內(nèi)[3]，常見形式是透明質(zhì)酸鈉（SH）。研究表明，HA有調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附、分化，促進(jìn)細(xì)胞的增生與移動(dòng)等活性，并參與保濕潤(rùn)滑、傷口愈合、組織修復(fù)和再生、胚胎發(fā)育等生物進(jìn)程[4]。因此，HA被認(rèn)為是最具有生物發(fā)展前景的生物活性物質(zhì)之一[5]。為考察HA對(duì)胃黏膜損傷的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)酒精性急性胃黏膜損傷模型、消炎痛性胃黏膜損傷模型和冰醋酸注射法胃黏膜損傷模型實(shí)驗(yàn)并予以實(shí)施，為HA的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 動(dòng)物和試劑 SPF級(jí)SD健康大鼠，雄性，5～7周齡，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003，使用許可證編號(hào)：SYXK（魯）2018 0031，飼養(yǎng)條件符合飼養(yǎng)環(huán)境條件標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010要求。

SH由山東焦點(diǎn)福瑞達(dá)生物股份有限公司提供，平均相對(duì)分子質(zhì)量為1.05×106，硫酸-咔唑法測(cè)定SH含量為98.6 %。無水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），冰醋酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫糖鋁口服混懸液（批號(hào)201225，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司）、吲哚美辛腸溶片（批號(hào)210101，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司）。

1.1.2 儀器和設(shè)備 LE203E/02電子天平、ACS-JJTiger電子秤（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；電子數(shù)顯卡尺（哈爾濱量具刃具集團(tuán)有限公司）；微量進(jìn)樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）；Honeywell EBI環(huán)境監(jiān)控系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及分組處理 實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)在山東省藥學(xué)科學(xué)院新藥評(píng)價(jià)中心，溫度為22±2 ℃，晝、夜明暗交替時(shí)間為12 h/12 h。動(dòng)物實(shí)行分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲水、進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后分組，每組10只動(dòng)物，劑量設(shè)計(jì)見表1。

表1 劑量設(shè)計(jì)表

根據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委2020年第9號(hào)公告要求，SH正式納入新食品原料目錄，公告中SH推薦食用量≤200 mg/d（約合3.33 mg/kg），根據(jù)《對(duì)胃黏膜損傷有輔助保護(hù)功能檢驗(yàn)方法》規(guī)定，受試物應(yīng)有一個(gè)人體推薦劑量的5倍劑量組，故設(shè)SH低、中、高劑量組為16.7，33.3，100 mg/kg，分別是人體推薦劑量的5倍、10倍和30倍。陽(yáng)性對(duì)照組采取硫糖鋁口服混懸液，硫糖鋁口服混懸液臨床使用最大日劑量為8 g/d，折算大鼠等效劑量約為833 mg/kg?？紤]操作的可行性，將大鼠灌胃劑量設(shè)為1000 mg/kg。

1.2.2 胃黏膜損傷模型建立

1.2.2.1 酒精性急性大鼠胃黏膜損傷模型：各劑量組動(dòng)物給予受試物30 d后，全部動(dòng)物嚴(yán)格禁食24 h（不禁水），此期間禁止給予受試物。除正常對(duì)照組外，所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物給予無水乙醇1.0 ml/只，1 h后麻醉處死全部動(dòng)物。剖開腹部，暴露完整胃，結(jié)扎幽門，灌注適量10 %甲醛溶液，固定20 min，然后沿胃大彎剪開，洗凈胃內(nèi)容物，展開胃黏膜，肉眼下用游標(biāo)卡尺測(cè)量出血點(diǎn)或出血帶的長(zhǎng)度和寬度，并對(duì)胃黏膜損傷進(jìn)行評(píng)分。大體檢查完畢，將每只動(dòng)物胃黏膜損傷最嚴(yán)重的部位切下，固定于10 %甲醛溶液，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[6]。

1.2.2.2 消炎痛致大鼠胃黏膜損傷模型：各劑量組動(dòng)物給予受試物30 d后，全部動(dòng)物嚴(yán)格禁食24 h（不禁水），此期間禁止給予受試物。除正常對(duì)照組外，所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物一次性腹腔注射消炎痛40 mg/kg（吲哚美辛腸溶片），5 h后麻醉處死全部動(dòng)物。剖開腹部，暴露完整胃，結(jié)扎幽門，灌注10 %甲醛溶液5 ml/只，固定20 min，然后沿胃大彎剪開，洗凈胃內(nèi)容物，展開胃黏膜，肉眼下用游標(biāo)卡尺測(cè)量出血點(diǎn)或出血帶的長(zhǎng)度和寬度，并對(duì)胃黏膜損傷進(jìn)行評(píng)分。大體檢查完畢，將每只動(dòng)物胃黏膜損傷最嚴(yán)重的部位切下，固定于10 %甲醛溶液，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[7]。

1.2.2.3 冰醋酸致大鼠慢性胃黏膜損傷模型：動(dòng)物禁食不禁水24 h后，麻醉后消毒腹部，于劍突下切開腹腔，將胃輕拉出腹腔外，用微量注射器于胃幽門處漿膜下注射30 μl 30 %冰醋酸，縫合切口，術(shù)后正常喂食和水。第二天選取術(shù)后狀態(tài)良好的50只動(dòng)物根據(jù)體重按普通拉丁方法分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、SH低劑量組、SH中劑量組和SH高劑量組，另隨機(jī)選取10只未造模的動(dòng)物為正常對(duì)照組。每組10只動(dòng)物。各組別動(dòng)物連續(xù)14 d灌胃給予相應(yīng)受試物后，全部動(dòng)物禁食24 h后處死，取出整個(gè)胃浸泡于10 %的甲醛內(nèi)，浸泡20 min后沿胃大彎剪開，洗凈內(nèi)容物，取腺胃區(qū)展開平鋪于玻璃板上，用紙吸干潰瘍內(nèi)的水分，測(cè)量其面積和體積[8]。

1.3 測(cè)量指標(biāo)和方法

1.3.1 胃黏膜損傷觀察和評(píng)分 將胃組織沿胃大灣剪開，洗凈內(nèi)容物，展開胃黏膜，用游標(biāo)卡尺測(cè)量出血點(diǎn)或出血帶的長(zhǎng)度和寬度，并對(duì)胃黏膜損傷進(jìn)行評(píng)分，急性胃黏膜損傷乙醇及消炎痛模型評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2、表3[9-10]。

表2 急性胃黏膜損傷乙醇模型評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表3 急性胃黏膜損傷消炎痛模型評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

按表2、表3所述內(nèi)容進(jìn)行如下指標(biāo)的計(jì)算：

（1）損傷發(fā)生率（%）=該組出現(xiàn)出血或潰瘍的大鼠數(shù)量/該組大鼠數(shù)量×100 %

（2）損傷積分=出血點(diǎn)分值+長(zhǎng)度分值+（寬度分值×2）

（3）損傷積分指數(shù) = 組損傷評(píng)分總和／組動(dòng)物數(shù)量

（4）損傷抑制率（%）=（A-B）/ A×100 %

式中：A：模型對(duì)照組的損傷積分指數(shù)；B：其他實(shí)驗(yàn)組的損傷積分指數(shù)

1.3.2 動(dòng)物組織病理學(xué)檢查 將10 %甲醛溶液固定的組織，常規(guī)制片，蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，選擇胃黏膜正橫切面，包括黏膜全層的區(qū)域觀察。評(píng)分方法以充血、出血、黏膜細(xì)胞變性壞死在整個(gè)黏膜上皮層的累計(jì)程度分為5級(jí)[11]。充血權(quán)重為1，出血權(quán)重為2，上皮細(xì)胞變性壞死權(quán)重為3，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及病變總積分公式見表4。

表4 急性胃黏膜損傷鏡下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

通過表4計(jì)算病變總積分：

病變總積分=充血積分+出血積分×2+上皮細(xì)胞變性壞死積分×3

1.3.3 潰瘍面積和體積測(cè)量方法 于帶標(biāo)尺的解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)潰瘍所占的方格數(shù)，換算成面積，然后用微量注射器將有色墨水注入潰瘍內(nèi)，將潰瘍填滿與周邊平齊，讀取微量注射器上刻度即為潰瘍的體積。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS Statistics 18軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)數(shù)據(jù)Levene’s檢驗(yàn)檢測(cè)方差齊性，如果方差齊（P＞0.05），則進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）：有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)（P＜0.05），采用Dunnett t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較；如果方差不齊（P＜0.05），則進(jìn)行Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)：差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)（P＜0.05），采用Mann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)（M-W法）比較組間差異。組間差異比較在各劑量組與對(duì)照組之間進(jìn)行，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷模型試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 SH對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 在30 d的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠外觀體征和行為活動(dòng)未見異常，無中毒體征及死亡。各受試物灌胃干預(yù)30 d后，各組間動(dòng)物質(zhì)量未見明顯差異（見圖1）。

圖1 SH對(duì)乙醇致大鼠胃黏膜損傷實(shí)驗(yàn)初始質(zhì)量及終末質(zhì)量的影響

2.1.2 SH對(duì)乙醇致大鼠胃黏膜損傷模型評(píng)分的影響各組胃黏膜損傷積分指數(shù)及抑制率見表5。

表5 乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷積分指數(shù)及損傷抑制率（n=10）

由表5可見，模型對(duì)照組大鼠胃黏膜損傷最嚴(yán)重；與模型對(duì)照相比，其余各組胃黏膜損傷情況減輕。SH低、中、高劑量組對(duì)乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷抑制率雖不如陽(yáng)性對(duì)照組高，但與模型對(duì)照組相比，對(duì)乙醇引起的胃黏膜損傷仍有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

2.1.3 組織病理學(xué) 各組動(dòng)物病變總積分見表6，組織病理學(xué)檢查見圖2。

圖2 乙醇致大鼠胃黏膜損傷組織病理照片

由表6可見，除正常對(duì)照組外，其余組別SD大鼠胃黏膜病變總積分均顯著升高，與之相比，SH低、中、高劑量組SD大鼠胃黏膜病變總積分平均值為109，明顯降低，與陽(yáng)性對(duì)照組基本持平。

表6 乙醇致大鼠胃黏膜損傷病理學(xué)檢查病變總積分

由圖2可見，正常對(duì)照組：動(dòng)物胃黏膜色澤正常，表面光滑，無出血點(diǎn)和出血帶；模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、SH低、中、高劑量組：動(dòng)物胃黏膜整體色澤正常，腺區(qū)可見出血點(diǎn)及條索狀出血帶，且隨著劑量的增加，腺區(qū)出血點(diǎn)及出血帶有明顯減輕，尤其是SH高劑量組。

2.2 消炎痛致大鼠急性胃黏膜損傷模型保護(hù)試驗(yàn)

2.2.1 SH對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 在30 d的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠外觀體征和行為活動(dòng)未見異常，無中毒體征及死亡。各受試物灌胃干預(yù)30 d后，各組間動(dòng)物質(zhì)量未見明顯差異，各組別動(dòng)物試驗(yàn)期間體重正常增長(zhǎng)未見明顯異常（見圖3）。

圖3 SH對(duì)消炎痛致大鼠胃黏膜損傷實(shí)驗(yàn)初始質(zhì)量及終末質(zhì)量的影響

2.2.2 SH對(duì)消炎痛致大鼠胃黏膜損傷模型評(píng)分的影響 消炎痛致大鼠胃黏膜損傷組損傷積分指數(shù)及抑制率見表7。

表7 消炎痛致大鼠急性胃黏膜損傷積分指數(shù)及損傷抑制率（n=10）

由表7可見，模型對(duì)照組損傷積分指數(shù)明顯高于SH各劑量組；SH低、中、高劑量組損傷抑制率均較高，尤其是中、高劑量組損傷抑制率高達(dá)60.5 %，結(jié)果均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。SH對(duì)消炎痛致大鼠急性胃黏膜損傷有保護(hù)作用，且隨著SH濃度的提高，保護(hù)作用增強(qiáng)。

2.2.3 組織病理學(xué) 各組動(dòng)物病變總積分見表8，組織病理學(xué)檢查病變見圖4。

表8 消炎痛致大鼠胃黏膜損傷病理學(xué)檢查病變總積分

由表8可見，除正常對(duì)照組外，其余組別SD大鼠胃黏膜病變總積分均顯著升高，模型對(duì)照組病變總積分88分，與之相比，SH低、中、高劑量組SD大鼠胃黏膜病變總積分均較低，且隨著劑量的增加，病變總積分呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)；其中SH高劑量組的結(jié)果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。

由圖4可見，正常對(duì)照組胃黏膜色澤正常，表面光滑，無出血點(diǎn)及出血帶；其他組動(dòng)物胃黏膜整體色澤正常，腺區(qū)可見出血點(diǎn)或條索狀出血帶，各組胃黏膜損傷發(fā)生率均為100 %；且隨著劑量的增加，出血點(diǎn)及出血帶減少，表明SH對(duì)消炎痛致大鼠胃黏膜損傷的治療有一定的潛力。

圖4 消炎痛致大鼠胃黏膜組織病理圖片

2.3 冰醋酸致大鼠慢性胃黏膜損傷模型保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 冰醋酸對(duì)各組動(dòng)物體質(zhì)量的影響 各組別動(dòng)物試驗(yàn)期間體重正常增長(zhǎng)未見明顯異常（P＞0.05）（見圖5）。

圖5 冰醋酸致大鼠慢性胃黏膜損傷實(shí)驗(yàn)初始質(zhì)量及終末質(zhì)量的影響

2.3.2 動(dòng)物損傷面積和體積 冰醋酸致大鼠慢性胃黏膜損傷面積和體積見表9 。

表9 冰醋酸致大鼠慢性胃黏膜損傷面積和體積（n=10，±s）

表9 冰醋酸致大鼠慢性胃黏膜損傷面積和體積（n=10，±s）

注：*P＜0.05 vs 正常對(duì)照組，#P＜0.05 vs 模型對(duì)照組

組別 面積/mm2 體積/μl正常對(duì)照組 0.00±0.00 0.0±0.0模型對(duì)照組 25.39±9.29* 18.8±10.9*陽(yáng)性對(duì)照組 14.62±9.11*# 7.6±7.4*#SH低劑量組 24.57±12.10* 12.7±8.7*SH中劑量組 17.59±8.12* 13.9±11.5*SH高劑量組 12.67±9.30*# 9.3±8.8*

由表9可見，模型對(duì)照組大鼠慢性胃黏膜損傷面積和體積均是最大值，SH低、中、高劑量組與之相比損傷面積和體積下降趨勢(shì)明顯，其中高劑量組的損傷面積比陽(yáng)性對(duì)照組的損傷面積低。SH各劑量組均有減輕冰醋酸所導(dǎo)致胃黏膜損傷的趨勢(shì)，且隨劑量增加，對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用越明顯。尤其是SH 100 mg/kg劑量下可顯著（P＜0.05）縮小冰醋酸所導(dǎo)致的潰瘍面積，并有縮小潰瘍體積的趨勢(shì)。

3 討論

胃黏膜有潤(rùn)滑、機(jī)械保護(hù)、抗酸逆流和防止自體消化的作用[12]。胃黏膜易受到環(huán)境、飲食、藥物、酗酒等因素的影響，一旦胃黏膜受損，很難恢復(fù)如初。目前，胃黏膜損傷模型的建立方法主要有冰醋酸法、無水乙醇灌胃法、熱灼法、應(yīng)激法等[13]。本實(shí)驗(yàn)采用無水乙醇及消炎痛灌胃法建立急性胃黏膜損傷模型：乙醇可溶解、破壞消化道上皮細(xì)胞細(xì)胞膜的完整性，從而增加細(xì)胞膜通透性，也可刺激黏膜的微循環(huán)血管，引起微循環(huán)血管收縮、黏膜缺血?jiǎng)┭装Y介質(zhì)和細(xì)胞因子產(chǎn)生；消炎痛引起胃黏膜損傷則主要與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，脂質(zhì)過氧化和引起消化道上皮細(xì)胞凋亡等有關(guān)[14-15]。采用冰醋酸胃壁注射法建立慢性胃潰瘍模型，微量冰醋酸腐蝕胃黏膜，得到很好的胃潰瘍模型，同時(shí)又不會(huì)危及大鼠的生命[16]。

HA主要分布在關(guān)節(jié)腔、皮膚、眼玻璃體、軟骨、臍帶和公雞冠等組織中，且研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)不同來源的HA進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定表明，其結(jié)構(gòu)均一致，未發(fā)現(xiàn)種屬間差異，只有分子量的差異[11]。研究發(fā)現(xiàn)，口服HA可起到美容保健、改善關(guān)節(jié)功能和骨質(zhì)疏松、修復(fù)胃黏膜損傷、以及促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、改善心血管系統(tǒng)、改善軟骨病癥狀、提高人體免疫力、促血管生成等功效[17-20]。HA正式獲批為新食品原料，產(chǎn)品使用范圍從原來保健食品原料，擴(kuò)大到新食品原料，為推廣HA的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在本研究中，SH對(duì)無水乙醇、消炎痛誘發(fā)的大鼠急性胃黏膜損傷和冰醋酸誘發(fā)的大鼠慢性胃黏膜損傷有一定的保護(hù)作用，可改善胃黏膜損傷大鼠胃黏膜組織病理變化，逆轉(zhuǎn)胃黏膜損傷面積和體積，且具有一定的量效關(guān)系。研究報(bào)道，HA在口腔黏膜、膀胱黏膜、鼻黏膜、皮膚黏膜和角膜損傷中均具有較好的改善效果[21-23]，其主要體現(xiàn)在HA可降低損傷黏膜的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，增加熱休克蛋白70的表達(dá)等有關(guān)[24-25]。綜上，HA對(duì)胃黏膜損傷有較明顯的保護(hù)作用，為HA開發(fā)具有胃黏膜損傷保護(hù)作用的功能食品、保健食品和藥品等提供科學(xué)參考價(jià)值。