曹艷桃，樊江峰，余四九，周應(yīng)聰，杜培巖，李一娟，馬進(jìn)彪，趙生賢

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

早孕因子(early pregnancy factor，EPF)是熱休克蛋白10(Hsp10)的細(xì)胞外同源物，位于妊娠期間細(xì)胞外，在妊娠第一階段釋放來參與妊娠的建立[1]。研究表明，EPF是成功懷孕的重要因素，一方面，它既可作為生長因子，促進(jìn)胚胎和胎盤組織發(fā)育；另一方面，著床期胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的EPF也作為一種促進(jìn)母體免疫系統(tǒng)對胎兒產(chǎn)生免疫耐受的抑制劑，通過自分泌和旁分泌途徑，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞如CD4+、CD25+T細(xì)胞的分化并增強(qiáng)他們的免疫抑制活性。這可能是母體妊娠期間對胎兒產(chǎn)生免疫耐受的重要機(jī)制[2]。因此，EPF被認(rèn)為是直接或間接參與妊娠過程中母胎之間復(fù)雜相互作用的重要分子[3]。在正常生理?xiàng)l件下，EPF只在懷孕期出現(xiàn)，可間接促進(jìn)妊娠早期胚胎的發(fā)育[4]。哺乳動物妊娠期生殖器官的多個(gè)部位，如卵巢、輸卵管、胎盤都有EPF的特異性表達(dá)[5-6]。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在妊娠期牦牛生殖器官的多個(gè)部位也有豐富的EPF表達(dá)[7]，且血液中EPF的含量在妊娠20 d左右開始就明顯高于未孕個(gè)體[8]。因此，EPF具有作為妊娠診斷血液學(xué)參考指標(biāo)的可能，能夠更早、更準(zhǔn)確地反映出牦牛的妊娠狀態(tài)。然而，EPF作為重要的妊娠特異性變化指標(biāo)，在國內(nèi)尚未有應(yīng)用于妊娠診斷的相關(guān)檢測產(chǎn)品。

近年來，早期妊娠診斷在規(guī)?；B(yǎng)殖場中日益受到重視，診斷技術(shù)也在不斷發(fā)展[9-10]。尤其在大規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)中，如奶牛、綿羊等逐漸出現(xiàn)新的妊娠診斷技術(shù)[11-13]。受自然環(huán)境、技術(shù)水平和養(yǎng)殖習(xí)慣的影響[14-15]，妊娠診斷技術(shù)在我國牦牛生產(chǎn)中少有應(yīng)用。傳統(tǒng)的直腸檢查、B超掃查進(jìn)行妊娠診斷對技術(shù)要求高[16]，操作難度大，難于在實(shí)際生產(chǎn)中大范圍應(yīng)用。研制簡便易行的血液學(xué)早期妊娠診斷方法，將為加強(qiáng)牦牛妊娠期精細(xì)化管理、減少孕期誤宰誤售、預(yù)防流產(chǎn)、提高牦牛整體繁殖效率奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品、菌株、質(zhì)粒

牦牛胎盤組織樣品和卵巢組織樣品于2019年11月份采集自中國青海省西寧市屠宰場；大腸桿菌載體質(zhì)粒pET28-His10-Sumo由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫防控技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)均購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

GoScriptTMReverse Transcription System購自美國Promega公司；QIAprep Spin Miniprep Kit(50)購自于上海凱杰企業(yè)管理有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、1-5TM2X High-Fidelity Master Mix均購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；DL500 DNA marker、DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker購自日本TaKaRa公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow His標(biāo)簽蛋白純化填料購自愛必信(上海)生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ、SacⅠ、T4 DNA連接酶均購自美國NEB；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，北京天根生化科技有限公司)；THETM His Tag Antibody[HRP] 抗體購自金斯瑞生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

利用軟件Prime premier5 設(shè)計(jì)引物，兩端選擇SacⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，引物大小為309 bp。引物合成由上海生工生物股份有限公司完成。引物序列為：EPF-F：CGAGCTCATGGCAGGACAGGCA-TTTAGAA；EPF-R：CCCTCGAGTCAGTCGACATATTTCCCAAGAATGTCA。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 目的基因擴(kuò)增 用TRIzol裂解液從牦牛胎盤和卵巢組織提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為EPF基因擴(kuò)增模板。擴(kuò)增體系：上、下游引物和擴(kuò)增模板各1 μL，1-5TM2X High-Fidelity Master Mix 12.5 μL，用無菌去離子水補(bǔ)充體積至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)，72 ℃重延伸5 min，最后4 ℃保存。

1.4.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建 使用DNA凝膠回收試劑盒對擴(kuò)增出的EPF基因回收，并將該目的產(chǎn)物和載體pET28-His10-Sumo分別用SacⅠ內(nèi)切酶和XhoⅠ內(nèi)切酶于37 ℃水浴酶切2 h,用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。酶切體系為：4 μL 的10× CutSmart Buffer，SacⅠ和XhoⅠ各1 μL， 目的產(chǎn)物/載體8 μL，26 μL的free Water。將該產(chǎn)物、空載體和T4 DNA連接酶按一定的比例混合，置于16 ℃連接過夜。連接反應(yīng)體系為：10× T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase、目的片段、載體分別為1、1、6和2 μL。連接反應(yīng)后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中：將4 μL產(chǎn)物加入50 μL感受態(tài)中冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，迅速放入碎冰冰浴2 min，加入0.4～1 mL的LB于37 ℃搖床培養(yǎng)1 h，取50～100 μL涂在含卡那的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜倒置培養(yǎng)。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(50)提質(zhì)粒，并進(jìn)行重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定和測序驗(yàn)證。

1.4.3 牦牛EPF基因同源性分析 用相關(guān)軟件(ClustalX、GeneDoc、MEGA7)將經(jīng)過測序后的牦牛EPF基因核苷酸序列與人(Homosapiens，NM_002157.3)、小鼠(Musmusculus，NM_008303.4)、牛(Bostaurus，NM_174346.2)、黑猩猩(Chimpanzee，NM_001382477.1)、獼猴(Rhesusmonkey，NM_001195788.1)、彎角大羚羊(Oryxdammah，XM_040228872.1)、歐亞水田鼠(Eurasianwatervole，XM_038315376.1)、象海豹(Miroungaleonine，XM_035007463.1)、金絲猴(Rhinopithecusbieti，XM_017869311.1)、狒狒(Gelada，XM_025404234.1)、單峰駝(Camelusdromedaries，XM_031452070.1)、美洲野牛(Bisonbisonbison，XM_010860903.1)、山羊(Caprahircus，XM_018061298.1)、家兔(Oryctolaguscuniculus，XM_002712369.3)等14個(gè)GenBank中的參考序列進(jìn)行同源性分析。

1.5 EPF重組蛋白的表達(dá)及表達(dá)形式鑒定

將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。涂板培養(yǎng)后挑取單克隆于37 ℃震蕩培養(yǎng)13～16 h收集于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將保存的EPF重組菌液按1∶200接種于37 ℃震蕩培養(yǎng)，2～3 h后加入IPTG過夜誘導(dǎo)，次日收集菌液，用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破菌處理后取部分菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。剩余菌液離心，分別收集上清和包涵體進(jìn)行Western blot試驗(yàn)。

1.6 EPF重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

1.6.1 誘導(dǎo)劑濃度優(yōu)化 將保存的EPF重組菌液按1∶200接種于50 mL離心管37 ℃震蕩培養(yǎng)，2～3 h后分別依次加入0、100、300、500、700和900 nmol·L-1IPTG 在37 ℃下連續(xù)過夜進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成后各取1 mL菌液進(jìn)行處理，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色來確定最適合該蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑濃度。

1.6.2 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化 將保存的EPF重組菌液按1∶200接種于50 mL離心管37 ℃震蕩培養(yǎng)，2～3 h 后加入300 nmol·L-1IPTG并將其分別放在16、26、30和37 ℃下震蕩過夜進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成后各取1 mL菌液處理，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色來確定最適合該蛋白表達(dá)的溫度。

1.6.3 誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化 將保存的EPF重組菌液按1∶200接種于50 mL離心管37 ℃震蕩培養(yǎng)，2～3 h 后加入300 nmol·L-1IPTG在37 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，從0 h開始誘導(dǎo)，隔2 h收集1次重組菌液，到誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到8 h時(shí)各取1 mL菌液處理蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色確定蛋白表達(dá)最佳時(shí)間。

1.7 EPF重組蛋白純化

將保存的EPF重組菌液按1∶200接種于錐形瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，2～3 h后加入濃度為300 nmol·L-1的IPTG 1 mL 在37 ℃下誘導(dǎo)6 h。離心將沉淀的菌體用PBS重懸，用超聲波細(xì)胞破碎儀250 W進(jìn)行破菌處理60 min。離心收集上清用過濾器過濾后與Ni Sepharose 6 Fast Flow His標(biāo)簽蛋白純化填料結(jié)合4 h。用不同濃度(順序?yàn)?0、40、60、80、150、500 mmol·L-1)洗脫液洗脫，分別收集處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.8 多克隆抗體的制備及鑒定

用純化后的EPF重組蛋白免疫小鼠。四免后采集小鼠血液，置于4 ℃冰箱，次日離心收集血清。用包被液稀釋牦牛EPF重組蛋白作為抗原包被96孔板(抗原包被濃度為10 μg·mL-1)，每孔100 μL置于4 ℃冰箱中過夜包被，小鼠抗血清按1∶200稀釋后2倍稀釋作為一抗，采集未注射任何免疫原的小鼠血清作為陰性對照，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，一抗、二抗皆于37 ℃孵育1 h，孵育抗體前后用PBST洗滌3～5次。每孔加50 μL顯色液，室溫顯色15～20 min后用50 μL終止液終止顯色。以O(shè)D450 nm陽性血清/OD450 nm陰性血清>2.1的最大稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)；將小鼠多抗血清以1∶2 000用10 g·L-1脫脂奶粉稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作濃度按1∶10 000稀釋，純化后的EPF重組蛋白作為抗原進(jìn)行Western blot檢測鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒PCR鑒定

PCR擴(kuò)增目的基因，在300 bp左右得到比較單一的條帶(圖1A)，與預(yù)期結(jié)果一致。EPF重組質(zhì)粒采用通用引物方法進(jìn)行菌液PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約在300 bp左右(圖1B)，與預(yù)期結(jié)果一致。送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了重組EPF質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A. 牦牛EPF基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳；B. 重組質(zhì)粒pET28-His10-Sumo-EPF擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。M. DNA Marker；泳道1～2為目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3為空白對照；泳道4～5為菌液PCR產(chǎn)物；泳道6～7為重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；泳道8為空白對照；泳道9為重組質(zhì)粒A. Agarose gel electrophoresis of EPF gene amplification product of yak; B. Agarose gel electrophoresis of amplified product of recombinant plasmid pET28-His10-Sumo-EPF. M. DNA Marker; Lane 1 and 2 represent PCR amplification products of the target gene; Lane 3 is blank control;Lane 4 and 5 are colony PCR product; Lane 6 and 7 represent recombinant plasmid PCR product; Lane 8 represents blank control; Lane 9 represents recombinant plasmid圖1 EPF基因擴(kuò)增和pET28-His10-Sumo-EPF質(zhì)粒鑒定Fig.1 EPF gene amplification and identification of pET28-His10-Sumo-EPF plasmid

2.2 牦牛EPF基因同源性分析

將牦牛EPF核苷酸與人、小鼠、牛、黑猩猩、獼猴、彎角大羚羊、歐亞水田鼠、象海豹、金絲猴、狒狒、單峰駝、美洲野牛、山羊、家兔的序列相比較，結(jié)果顯示，其核苷酸同源性分別為91%、88%、98%、91%、90%、66%、86%、63%、90%、89%、63%、97%、65%、90%(圖2)。進(jìn)行EPF基因進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示牦牛EPF與黃牛和美洲野牛的親緣關(guān)系最近，與象海豹的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)(圖3)。

2.3 EPF重組蛋白表達(dá)形式鑒定

將EPF重組菌液于37 ℃震蕩培養(yǎng)，2～3 h后加入IPTG過夜誘導(dǎo)，次日收集菌液，用超聲波細(xì)胞破碎儀對菌液進(jìn)行超聲破菌處理，離心后收集上清和包涵體進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌培養(yǎng)上清液和包涵體中，都有牦牛EPF蛋白的表達(dá)(圖4A)。以其中1個(gè)上清中蛋白表達(dá)量作為對照，灰度值分析其上清和包涵體中的相對表達(dá)量。分析結(jié)果顯示，上清中的蛋白表達(dá)量要低于包涵體中的表達(dá)量(圖4B)。

2.4 EPF重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

2.4.1 最佳誘導(dǎo)劑濃度 將菌液于37 ℃培養(yǎng)2.5 h后分別加入0、100、300、500、700和900 nmol·L-1IPTG過夜誘導(dǎo)。對SDS-PAGE結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，結(jié)果顯示EPF重組蛋白在IPTG濃度為300 nmol·L-1時(shí)蛋白表達(dá)量最大(圖5)。故選擇重組蛋白誘導(dǎo)的最佳誘導(dǎo)劑濃度為300 nmol·L-1。

圖2 牦牛與其他物種EPF核苷酸多序列比對Fig.2 Multiple comparison of yak EPF nucleotide sequences with other species

圖3 EPF系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 EPF phylogenetic tree analysis

A. 上清和包涵體中表達(dá)蛋白的Western blot檢測；M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.上清；3～4. 包涵體；5. 空載體。B. 上清和包涵體中蛋白相對表達(dá)量分析A. Western blot analysis of expressed proteins in supernatant and inclusion bodies; M. Protein Marker; 1 and 2 represent supernatants; 3 and 4 represent inclusion bodies; 5 represents negative control. B. Relative expression analysis of expressed proteins in supernatant and inclusion bodies圖4 上清和包涵體中表達(dá)蛋白的Western blot檢測及相對表達(dá)量分析Fig.4 Western blot and relative expression analysis of expressed proteins in supernatant and inclusion bodies

A. EPF重組蛋白誘導(dǎo)劑IPTG濃度優(yōu)化；M蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6分別代表IPTG濃度為0、100、300、500、700和900 nmol·L-1。B. 誘導(dǎo)劑IPTG濃度灰度值分析結(jié)果A. Optimization of IPTG concentration of EPF recombinant protein; M. Protein Marker; 1-6 represent the level of IPTG are 0, 100, 300, 500, 700 and 900 nmol·L-1, respectively. B. Gray value analysis results of different inducer concerntrations圖5 EPF重組蛋白誘導(dǎo)劑IPTG濃度優(yōu)化Fig.5 Optimization of IPTG concentration of EPF recombinant protein

2.4.2 最佳誘導(dǎo)溫度 將菌液于37 ℃培養(yǎng)2.5 h后加入300 nmol·L-1IPTG分別于16、26、30、37 ℃過夜誘導(dǎo)。SDS-PAGE結(jié)果顯示EPF重組蛋白在37 ℃時(shí)蛋白表達(dá)量最高(圖6)，故選擇37 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

2.4.3 最佳誘導(dǎo)時(shí)間 將菌液于37 ℃培養(yǎng)2.5 h后加入300 nmol·L-1IPTG繼續(xù)在37 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔1或2 h取1次菌液，放置于4 ℃冰箱備用，最后誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到8 h后取出所有菌液，將所有菌液處理后跑膠驗(yàn)證。由SDS-PAGE結(jié)果可知，牦牛EPF重組蛋白在第6小時(shí)蛋白表達(dá)量最高。從灰度值分析結(jié)果也可以直觀地看出不同誘導(dǎo)時(shí)間下的蛋白表達(dá)量不同(圖7)。最終選擇最佳誘導(dǎo)時(shí)間為 6 h。

2.5 EPF重組蛋白純化

EPF重組蛋白經(jīng)Ni柱純化后用梯度濃度的洗脫液洗脫，當(dāng)洗脫液濃度較小時(shí)洗脫掉大量的雜蛋白，當(dāng)洗脫液濃度達(dá)到300 mmol·L-1時(shí)既有雜蛋白又有少量目的蛋白(故洗脫過程中取濃度為300 mmol·L-1的洗脫液)，目的蛋白大部分存在于500 mmol·L-1的洗脫液中，蛋白純化效果較好(圖8A)。透析后EPF重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，獲得的純化蛋白無雜蛋白(圖8B)。

2.6 多克隆抗體的制備及鑒定

采集四免后小鼠血清，未免小鼠作為陰性對照用間接ELISA法檢測多抗血清抗體效價(jià)。由圖9可知1∶25 600為OD450 nm陽性血清/OD450 nm陰性血清>2.1血清最大稀釋度，因此，鼠抗EPF多克隆抗體效價(jià)為1∶25 600(圖9A)。以重組EPF蛋白作為抗原，小鼠抗血清以1∶2 000稀釋作為一抗，二抗以1∶10 000稀釋進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示在29 ku處出現(xiàn)特異性條帶(圖9B)。結(jié)果表明，制備的鼠抗EPF多克隆抗體與重組后牦牛EPF蛋白能夠發(fā)生特異性反應(yīng)。

A. EPF重組蛋白誘導(dǎo)溫度優(yōu)化；M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4過夜誘導(dǎo)溫度分別為16、26、30和37 ℃。B. 不同溫度誘導(dǎo)SDS-PAGE灰度值分析結(jié)果A. Optimum temperature selection for inducing EPF recombinant protein; M. Protein Marker; 1-4 represent the induced temperature are 16, 26, 30 and 37 ℃, respectively. B. Different temperatures induced SDS-PAGE gray value analysis results圖6 EPF重組蛋白誘導(dǎo)溫度優(yōu)化Fig.6 Optimum temperature selection for inducing EPF recombinant protein

A. 牦牛EPF重組蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間；M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～8分別代表誘導(dǎo)時(shí)間為0、8、6、5、4、3、2、1 h; B. 不同時(shí)間誘導(dǎo)SDS-PAGE灰度值分析結(jié)果A. Optimization of induction time of yak EPF recombinant protein; M. Protein Marker;1-8 represent the induction time are 0, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1 h, respectively; B. Induced SDS-PAGE gray value analysis results at different times圖7 重組牦牛EPF蛋白誘導(dǎo)最佳時(shí)間選擇Fig.7 Optimization of induction time of EPF recombinant protein of yak

3 討 論

EPF是一種免疫抑制反應(yīng)因子，存在于孕初女性和妊娠早期家畜血清細(xì)胞中[17-18]。Morton等[19]證明，EPF存在于所有研究的哺乳動物物種中，至少在妊娠的前三分之二時(shí)間內(nèi)持續(xù)存在。Cruz等[20]研究發(fā)現(xiàn)，懷孕(第10天除外)動物血清中存在EPF，而未懷孕和排卵前動物血清中不存在該物質(zhì)，這表明懷孕與EPF合成特別相關(guān)。Hu和Zheng等[21]利用RIA試驗(yàn)檢測EPF活性，證明EPF是反映胎兒存活的敏感標(biāo)志物,可用于預(yù)測不明原因自然流產(chǎn)患者的預(yù)后。

本試驗(yàn)通過對牦牛EPF基因的同源性分析，得到其與牛的親緣關(guān)系最近，這與馬進(jìn)彪等[8]的分析結(jié)果一致，另外，在此基礎(chǔ)上，本研究還進(jìn)一步比較了與小鼠、家兔、美洲野牛、黑猩猩、獼猴、彎角大羚羊、歐亞水田鼠、象海豹、金絲猴、狒狒等動物EPF序列，結(jié)果顯示單峰駝、山羊、象海豹、彎角大羚羊形成一個(gè)分支，且牦牛與該分支的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

A. 純化的EPF重組蛋白SDS-PAGE分析；B. EPF重組蛋白透析后SDS-PAGE分析結(jié)果。M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 純化前破菌后上清；2. 20 mmol·L-1洗脫液；3. 40 mmol·L-1洗脫液；4. 60 mmol·L-1洗脫液；5. 80 mmol·L-1洗脫液；6. 100 mmol·L-1洗脫液；7. 150 mmol·L-1洗脫液；8. 500 mmol·L-1洗脫液；9. EPF重組蛋白未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)時(shí)菌液；10. EPF重組蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后菌液；11. 純化前上清；12. 包涵體；13. 透析后的純化EPF重組蛋白A. SDS-PAGE analysis of purified EPF recombinant protein; B. Results of SDS-PAGE analysis of EPF recombinant protein after dialysis. M. Protein Marker; 1. Supernatant after bacteria destruction; 2. 20 mmol·L-1 eluent; 3. 40 mmol·L-1 eluent; 4. 60 mmol·L-1 eluent; 5. 80 mmol·L-1 eluent; 6. 100 mmol·L-1 eluent; 7. 150 mmol·L-1 eluent; 8. 500 mmol·L-1 eluent; 9. EPF recombinant protein was not induced by IPTG; 10. EPF recombinant protein was induced by IPTG and expressed in bacterial fluid; 11. Prepurification supernatant; 12. Inclusion body; 13. Purified recombinant EPF protein after dialysis圖8 EPF重組蛋白的表達(dá)及純化Fig.8 Expression and purification of EPF recombinant protein

A. 不同血清稀釋度的OD450 nm值；M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；B. Western blot檢測EPF抗血清與EPF反應(yīng)性；1. EPF抗血清和EPF重組蛋白反應(yīng)條帶；2. 空載體A. OD450 nm values of different serum dilutions; M. Protein Marker; B. The reactivity of EPF antiserum to EPF was detected by Western blot; 1. EPF antiserum and EPF recombinant protein reaction bands; 2. Negative control圖9 EPF多克隆抗體效價(jià)及特異性檢測Fig.9 EPF polyclonal antibody titer and specificity detection

Ohnuma等[22]用RIT檢測到馬在交配后24～72 h出現(xiàn)EPF，并持續(xù)到妊娠中期。馬進(jìn)彪等[8]分別檢測了妊娠期牦牛和未孕牦牛血液中EPF含量，發(fā)現(xiàn)妊娠組EPF含量顯著高于未孕組，表明血液EPF可作為妊娠檢測因子用于牦牛早期妊娠診斷?；贓PF以上的特性，Ohnuma等[23]試圖從懷孕母馬血清中采用離子交換和超濾的方法純化EPF，但由于血清中EPF含量過少并沒有純化出馬EPF，且血液純化成本高、效率低。因此，本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)來大量表達(dá)純化EPF蛋白，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

Somodevilla-Torres等[24]將感染了桿狀病毒的EPF在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，通過生產(chǎn)一種完全未修飾的分子，并依靠其高pI (8.9)使用離子交換技術(shù)實(shí)現(xiàn)完全純化，但純化后蛋白有明顯的雜蛋白存在。楊杰等[25]在Rosseta菌中表達(dá)了家兔EPF，但其蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，通過包涵體洗滌等一系列過程后得到的蛋白回收率較低。劉靜靜等[26]通過原核表達(dá)系統(tǒng)得到重組綿羊EPF蛋白，并通過GST親和層析進(jìn)行了蛋白純化，其蛋白只有少量可溶性表達(dá)。因此，基于以上這些表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)來大量表達(dá)純化EPF蛋白，并獲得大量的可溶性表達(dá)。

由于EPF在大腸桿菌中表達(dá)主要以包涵體形式表達(dá)[27]，為了減少蛋白純化難度，本試驗(yàn)選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，在pET28a載體上添加了SUMO標(biāo)簽。唐楚煜等[28-29]認(rèn)為，SUMO標(biāo)簽具有抵抗蛋白酶水解的功能，它還能使靶蛋白正確折疊。本研究結(jié)果也證實(shí)了，在助溶標(biāo)簽SUMO的作用下，不但提高了重組蛋白的表達(dá)量，促進(jìn)了EPF的可溶性表達(dá)，使大量蛋白出現(xiàn)在原核表達(dá)系統(tǒng)上清液中。同時(shí)也提高了鎳柱純化時(shí)的蛋白結(jié)合效率，避免了包涵體純化的一系列復(fù)雜過程，為后期研究節(jié)約成本。

在蛋白表達(dá)過程中，對誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示EPF蛋白在誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，與劉云等[30]對奶牛EPF蛋白誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果一致，此外，本研究對誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度也進(jìn)行了優(yōu)化，確定了37 ℃下誘導(dǎo)劑濃度為300 nmol·L-1為最佳條件。通過在載體上添加了SUMO及His標(biāo)簽，對誘導(dǎo)條件優(yōu)化等方法，提高了EPF蛋白可溶性表達(dá)量，His標(biāo)簽鎳柱純化出的牦牛EPF重組蛋白濃度高達(dá)2 mg·mL-1，制備出的抗體效價(jià)高達(dá)1∶25 600，而劉云等[30]制備的奶牛EPF抗體效價(jià)僅達(dá)1∶12 800，宋立峰等[31]制備的綿羊EPF抗體效價(jià)為1∶16 000。EPF抗體的成功制備為牦牛妊娠早期高效快速診斷技術(shù)研究奠定了很好的基礎(chǔ)，對于今后開展牦牛大規(guī)模妊娠檢查具有重大意義。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了牦牛EPF基因，構(gòu)建了牦牛EPF重組質(zhì)粒，采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了可溶性EPF重組蛋白。最終得到純度相對較高的牦牛EPF重組蛋白。用純化透析后的重組牦牛EPF蛋白注射免疫小鼠，成功獲得牦牛早孕因子的小鼠多克隆抗體，且該抗體具有良好的反應(yīng)原性。