王 磊，何莉娜，唐 雪，李碧筠，黃思藝，王鈺錕，徐德軍，趙中權(quán)

(西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

卵泡是卵巢的基本功能單位，其生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)雌性哺乳動(dòng)物的生殖進(jìn)程起決定作用[1]。卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)高度精確、有序且具有周期性的過程[2]，從原始卵泡的激活開始，逐漸生長(zhǎng)發(fā)育成熟直至選擇為優(yōu)勢(shì)卵泡或閉鎖，此過程伴隨著卵母細(xì)胞和周圍體細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中顆粒細(xì)胞(granulosa cells, GCs)的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)這一過程的影響尤為重要[3]。

GCs的增殖和凋亡是卵泡成熟或閉鎖的重要因素和必要條件[4]，GCs的增殖可以促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，而GCs凋亡則引發(fā)卵泡的閉鎖[5]，同時(shí)，GCs還是卵巢中類固醇激素生成的主要來源，卵泡液中的類固醇激素維持卵巢正常的生理功能，其主要包括雌二醇(estrogen, E2)和孕酮(progesterone, P4)[6]。哺乳動(dòng)物約有99%卵泡發(fā)育停滯或閉鎖，只有1%的卵泡可以發(fā)育成熟并排卵，卵泡的成熟或閉鎖對(duì)于雌性哺乳動(dòng)物維持健康的生殖系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡十分重要[7]，因此，長(zhǎng)期以來，卵泡的發(fā)育和閉鎖機(jī)制一直是生殖生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。

microRNA(miRNA)廣泛參與原始卵泡的形成、卵泡的募集、選擇和閉鎖等雌性哺乳動(dòng)物的生殖過程[8]。miRNA主要通過抑制靶基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)GCs增殖和凋亡[9]，例如：miR-181被證實(shí)通過減少PCNA的積累和靶向ACVRIA來抑制GCs的增殖[10]；而過表達(dá)miR-320則能抑制小鼠GCs的增殖[11]；同時(shí)，long non-coding RNA tcons-00814106通過海綿介導(dǎo)miR-1343調(diào)控豬GCs增殖和凋亡[12]。此外，miRNA對(duì)于類固醇激素合成也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，例如：miR-133b可以直接靶向FOXL2從而抑制FOXL2介導(dǎo)的StAR和CYP19A1的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)E2的生成[13]；而miR-378通過靶向CYP19A1抑制E2的合成[14]；miR-375參與調(diào)控CRH的表達(dá)進(jìn)而抑制GCs合成E2[15]。

最近研究報(bào)道，miR-495參與調(diào)控腔前卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育[16]。同時(shí)，與非妊娠期相比，妊娠早期miR-495高表達(dá)，暗示其可能參與早期妊娠的建立[17]。而在綿羊繁殖進(jìn)程中，miR-495-3p通過直接或間接方式影響促性腺激素釋放激素的活性和釋放[18]。但是，miR-495-3p調(diào)控卵巢卵泡發(fā)育的分子機(jī)制尚不明確。為了揭示miR-495-3p在山羊卵巢GCs中的功能及其調(diào)控機(jī)制，本研究轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimics和inhibitor，分析其對(duì)山羊卵巢GCs凋亡、增殖、周期、類固醇激素分泌及相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清FBS(HyClone，美國(guó))，F(xiàn)SHR一抗(稀釋比例1∶200，葆光生物，中國(guó))，生物素標(biāo)記二抗(稀釋比例1∶20，葆光生物，中國(guó))，辣根酶標(biāo)記的工作液、DAB工作液、CCK-8、BCA試劑盒(葆光生物，中國(guó))，EndoFectinTM(萊博斯，中國(guó))，Opti-DMEM(HyClone，美國(guó))，RNAiso(Invitrogen，美國(guó))，PrimeScriptTM RT Master Mix、MiR-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis(TaKaRa，中國(guó))，Annexin V-PE(Biolegend，中國(guó))， 7-AAD(Biolegend，中國(guó))，PI/RnaseA(SeaBiotech，中國(guó))，ELISA試劑盒(博諾恒，中國(guó))，細(xì)胞裂解液(Solarbio，中國(guó))。

1.2 卵巢采集與細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

本試驗(yàn)嚴(yán)格按照國(guó)際動(dòng)物福利合作委員會(huì)(ICCAW)和西南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)(西南大學(xué)〔2017〕7號(hào))要求。從西南大學(xué)羊場(chǎng)選取3～4月齡的大足黑山羊母羊，屠宰后收集新鮮卵巢，置于37 ℃ 的生理鹽水中1 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。山羊卵巢GCs收集培養(yǎng)方式同Wang等[19]的報(bào)道，GCs培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基中，補(bǔ)充10%胎牛血清，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2的條件培養(yǎng)。將miR-495-3p mimics、miR-495-3p mimics NC、miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC(序列見表1)分別轉(zhuǎn)染至GCs中，每組3個(gè)重復(fù)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染依據(jù)制造商說明書：5 μL miR-495-3p mimics/NC、inhibitor /NC(100 nmol·L-1)或EndoFectinTMMax轉(zhuǎn)染試劑用Opti-DMEM分別稀釋至150 μL，室溫靜置5 min。將稀釋的miR-495-3p mimics/NC或inhibitor /NC溶液以及EndoFectinTMMax溶液輕柔混合，室溫靜置20 min，向6孔板中逐滴添加RNA-EndoFectinTM復(fù)合物，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育24～48 h。

1.3 細(xì)胞免疫化學(xué)染色

將貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸浮液，轉(zhuǎn)入放有細(xì)胞爬片的12孔板中，培養(yǎng)24 h，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞爬片后用0.5%的Triton X-100溶液通透30 min，隨后用5% 的BSA溶液室溫封閉 30 min。結(jié)束封閉的細(xì)胞爬片滴加用1%BSA溶液稀釋的FSHR一抗，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。無菌PBS洗3次(每次5 min)，滴加用1%BSA溶液稀釋的生物素標(biāo)記二抗，置于37 ℃， 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。最后，細(xì)胞爬片與辣根酶標(biāo)記的工作液以及新配制的DAB工作液共孵育。FSHR陽(yáng)性細(xì)胞膜被染成棕色，細(xì)胞核染成藍(lán)色，利用倒置顯微鏡采集圖像。

1.4 CCK-8 檢測(cè)

CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性，在96孔板中培養(yǎng)或轉(zhuǎn)染GCs(1×104個(gè)·孔-1)，轉(zhuǎn)染后放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)時(shí)間梯度(24、36、48 h)，每個(gè)梯度4個(gè) 重復(fù)。每孔加入10 μL的CCK-8試劑，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。隨后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)混合物在450 nm 處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖活力。

1.5 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)

轉(zhuǎn)染36 h后收集GCs，利用緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為107個(gè)·mL-1，在流式管中加入100 μL細(xì)胞懸液，隨后分別加入5 μL Annexin V-PE 和5 μL 7-AAD混合均勻，室溫避光孵育15 min， 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染36 h后收集GCs，每個(gè)樣本加入500 μL提前配置好的PI/RNA染色工作液(PI∶RnaseA=9∶1)，室溫避光孵育1 h，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，用Modfit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 ELISA檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，收集細(xì)胞上清液50 μL，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)E2和P4水平。根據(jù)試劑盒說明書，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定不同處理組的吸光度。通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸，計(jì)算出相應(yīng)的樣品濃度。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

用RNAiso試劑從GCs中提取總RNA，用Nanodrop1000評(píng)估RNA的純度和濃度。利用PrimeScriptTM RT Master Mix將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)MiR-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis說明書要求，miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)TaKaRa 公司TB Green? Premix Ex TaqTMⅢ(Tli RNaseH Plus)進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為15 μL： TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)7.5 μL， PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)0.6 μL， PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.6 μL，RT 反應(yīng)液(cDNA 溶液)1.2 μL， 滅菌水5.1 μL。反應(yīng)條件為：第一階段預(yù)變性95 ℃ 30 s，循環(huán)一次；第二階段PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，熔解曲線根據(jù)引物不同設(shè)置為65～95 ℃，每0.5 ℃讀取一次Ct值。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算。編碼基因表達(dá)量歸一化為β-actin的相對(duì)表達(dá)量，miRNA表達(dá)量歸一化為U6的相對(duì)表達(dá)量。所有qRT-PCR反應(yīng)均為4個(gè)重復(fù)，所用引物見表2。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白水平

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后36 h，用含1%蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，混合物4 ℃離心，收集細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度?？偟鞍滋崛∫涸?2% SDS PAGE凝膠上分離，并在硝化纖維素膜上印跡。用5%脫脂牛奶在4 ℃ 的TBST緩沖液中封閉2 h，結(jié)束后將膜與一抗4 ℃孵育過夜，隨后二抗孵育2 h，用ECL顯影液(A液∶B液=1∶1)顯影，Image LAS-4000系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光，Image J軟件分析蛋白灰度。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

利用Prism-6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多個(gè)數(shù)據(jù)的比較用單因素方差(One-Way ANOVA)分析，兩組數(shù)據(jù)比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 山羊卵巢GCs的分離鑒定及miR-495-3p轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

山羊卵巢GCs最初分離培養(yǎng)呈現(xiàn)圓點(diǎn)狀，培養(yǎng)24 h后貼壁生長(zhǎng)，呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形(圖1A)。為了檢測(cè)本研究分離培養(yǎng)的GCs純度，利用GCs中特異性表達(dá)的FSHR來鑒定GCs。染色后可觀察到GCs膜被染成棕色，細(xì)胞核染成藍(lán)色(圖1B)。為研究miR-495-3p在卵巢GCs中的作用，將miR-495-3p mimics、mimics NC、miR-495-3p inhibitor和inhibitor NC轉(zhuǎn)染到GCs中，分別在24、36和48 h觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況(圖1C)，并用qRT-PCR驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率(圖1D)。結(jié)合細(xì)胞熒光信號(hào)，轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimics 36 h時(shí)miR-495-3p表達(dá)量最高(P<0.01)。因此，后續(xù)試驗(yàn)轉(zhuǎn)染時(shí)間為36 h。由于miRNA inhibitor的干擾原理，未檢測(cè)到miR-495-3p表達(dá)量變化。

2.2 miR-495-3p對(duì)GCs凋亡的影響

為探究miR-495-3p對(duì)GCs凋亡的影響，轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimics、mimics NC、miR-495-3p inhibitor和inhibitor NC 36 h后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，與mimics NC組相比，miR-495-3p mimics極顯著升高細(xì)胞凋亡率(圖2A、2B、2E，P<0.01)；而與inhibitor NC組相比，miR-495-3p inhibitor極顯著下調(diào)細(xì)胞凋亡率(圖2C～E，P<0.01)。qRT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與mimics NC組相比，miR-495-3p mimics顯著上調(diào)BAXmRNA相對(duì)表達(dá)水平(P<0.05)，極顯著下調(diào)BCL2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平(P<0.01)；與inhibitor NC組相比，miR-495-3p inhibitor極顯著下調(diào)BAXmRNA相對(duì)表達(dá)水平(P<0.001)，但對(duì)BCL2的表達(dá)無顯著影響(圖2F)。Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果趨勢(shì)相一致(圖2G、2H)。以上結(jié)果表明，過表達(dá)miR-495-3p可以促進(jìn)GCs凋亡，而抑制miR-495-3p可以阻礙細(xì)胞凋亡。

A. 貼壁生長(zhǎng)的山羊卵巢GCs；B. 細(xì)胞免疫組化鑒定山羊卵巢GCs；C.轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimics、mimics NC、miR-495-3p inhibitor和inhibitor NC細(xì)胞熒光圖(24、36、48 h)；D. 轉(zhuǎn)染36 h后，qRT-PCR檢測(cè)miR-495-3p mRNA表達(dá)量：ns表示差異不顯著，*表示差異顯著P<0.05，**表示差異極顯著P<0.01A. Goat ovary GCs that grow adherently; B. Cellular immunohistochemistry to identify goat ovarian GCs; C. Fluorescence images of cells transfected with miR-495-3p mimics, mimics NC, miR-495-3p inhibitor and inhibitor NC (24, 36, 48 h); D. 36 h after transfection, the expression of miR-495-3p mRNA was detected by qRT-PCR: ns indicates that the difference is not significant, * indicates the significant difference P<0.05, ** indicates the extremely significant difference P<0.01圖1 卵巢GCs的分離鑒定及miR-495-3p轉(zhuǎn)染Fig.1 Isolation and identification of ovarian GCs and miR-495-3p transfection

A、B、C、D. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GCs轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC 36 h后的細(xì)胞凋亡：UL表示死亡細(xì)胞，UR表示晚期凋亡細(xì)胞，LR表示早期凋亡細(xì)胞，LL表示活的非凋亡細(xì)胞；E. 柱狀圖顯示凋亡細(xì)胞的百分比；F. qRT-PCR檢測(cè)細(xì)BAX、BCL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量；G、H. Western blot檢測(cè)BAX、BCL2的蛋白相對(duì)表達(dá)量。*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001，下同A, B, C, D. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of GCs on 36 h after transfection of miR-495-3p mimics, mimics NC, inhibitor and inhibitor NC: UL stands for dead cells, UR stands for late apoptotic cells, LR stands for early apoptotic cells, and LL stands for live non-apoptotic cells; E. The histogram shows the percentage of apoptotic cells; F. qRT-PCR detects the relative expression of BAX and BCL2 mRNA; G, H. Western blot was used to detect the relative expression of BAX and BCL2 proteins. *. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001,the same as below圖2 miR-495-3p促進(jìn)卵巢GCs的凋亡Fig.2 miR-495-3p promotes the apoptosis of ovarian GCs

2.3 miR-495-3p對(duì)GCs增殖的影響

用CCK-8檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染時(shí)間細(xì)胞的增殖活力，分析miR-495-3p對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，過表達(dá)或抑制miR-495-3p對(duì)細(xì)胞的增殖活力無顯著影響(P>0.05)；轉(zhuǎn)染36 h時(shí)，與mimics NC組相比，miR-495-3p mimics顯著降低細(xì)胞增殖活力(P<0.05)，而inhibitor組無顯著變化；轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，與對(duì)照組相比miR-495-3p mimics組和miR-495-3p inhibitor組顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.001)降低細(xì)胞增殖活力(圖3A)，表明隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，細(xì)胞的增殖活力逐漸下降，并且細(xì)胞增殖結(jié)果與miR-495-3p在GCs中的轉(zhuǎn)染結(jié)果一致(圖1D)。qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)或抑制miR-495-3p對(duì)增殖標(biāo)志基因PCNAmRNA的相對(duì)表達(dá)水平無顯著影響(圖3B，P>0.05)，但Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-495-3p顯著降低PCNA的蛋白表達(dá)水平(圖3C，P<0.05)。綜上表明，過表達(dá)miR-495-3p可以抑制GCs增殖。

A.CCK8檢測(cè)miR-495-3p mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC處理組的細(xì)胞活力；B. qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志基因PCNA的mRNA表達(dá)；C. Western blot檢測(cè)增殖標(biāo)志基因PCNA蛋白的表達(dá)A. CCK8 detect the cell viability of miR-495-3p mimics, mimics NC, inhibitor and inhibitor NC treatment groups; B. qRT-PCR detect the mRNA expression of the cell proliferation marker gene PCNA; C. Western blot was used to detect the protein expression of PCNA圖3 miR-495-3p抑制GCs的增殖Fig.3 miR-495-3p inhibits the proliferation of GCs

2.4 miR-495-3p對(duì)GCs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

為明確miR-495-3p影響細(xì)胞增殖的具體分裂時(shí)期，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-495-3p極顯著降低了G1期比率(P<0.01)，顯著增加G2/M期比率(P<0.05)，對(duì)S期沒有顯著影響(圖4A、4B、4E)，而抑制miR-495-3p對(duì)細(xì)胞周期沒有顯著影響(圖4C、4D、4E，P>0.05)。qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-495-3p顯著降低了CDK4(P<0.001)和CCND1(P<0.05)的mRNA水平，但其對(duì)CCNE1沒有顯著影響(P>0.05)；抑制miR-495-3p極顯著降低CCNE1的mRNA水平(P<0.01)，而對(duì)CDK4和CCND1的mRNA水平無顯著影響(圖4F)。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-495-3p引起細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

A、B、C、D. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-495-3p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC處理組的細(xì)胞周期；E. 柱狀圖顯示細(xì)胞周期分布的百分比；F. qRT-PCR檢測(cè)與細(xì)胞周期相關(guān)基因(CDK4、CCND1和CCNE1)的mRNA表達(dá)A, B, C, D. Flow cytometry detect the cell cycle of miR-495-3p mimics, mimics NC, inhibitor, inhibitor NC treatment groups; E. The histogram shows the percentage of cell cycle distribution; F. qRT-PCR detects the mRNA expression of genes related to cell cycle (CDK4, CCND1 and CCNE1)圖4 miR-495-3p阻滯GCs的細(xì)胞周期進(jìn)程Fig.4 miR-495-3p blocks the cell cycle progression of GCs

2.5 miR-495-3p對(duì)GCs類固醇激素分泌的影響

利用ELISA試劑盒檢測(cè)GCs培養(yǎng)液上清中的E2和P4含量。結(jié)果表明，過表達(dá)或抑制miR-495-3p均顯著促進(jìn)E2(P<0.01)和P4(P<0.001，P<0.05)的分泌(圖5A、5B)。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)類固醇激素合成相關(guān)基因和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-495-3p顯著升高3β-HSD(P<0.001)、CYP11A1(P<0.01)和CYP19A1(P<0.05)的mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖5C、5D、5F、5G)，但對(duì)StAR無顯著影響(圖5C、5E，P>0.05)。抑制miR-495-3p極顯著增加CYP11A1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平(圖5C、5F，P<0.01)，極顯著降低StAR的mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖5C&E，P<0.001)，極顯著降低3β-HSD的mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，但對(duì)蛋白的表達(dá)無顯著影響(圖5C、5D)，同時(shí)，抑制miR-495-3p對(duì)CYP19A1的mRNA和蛋白表達(dá)水平并無顯著影響(圖5C、5G，P>0.05)。

3 討 論

miRNA在卵巢中的表達(dá)十分豐富，并且對(duì)卵巢的生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用[20]。在本研究中，過表達(dá)miR-495-3p促進(jìn)GCs凋亡，這一結(jié)果與其它miRNA在卵巢GCs中的研究結(jié)果類似。Tu等[21]報(bào)道m(xù)iR-10家族在人、大鼠和小鼠中均可誘導(dǎo)GCs凋亡，相反，Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p靶向Smad7抑制豬卵巢GCs凋亡，表明miRNA對(duì)GCs凋亡具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。miR-144[23]和miR-29[24]在促進(jìn)卵巢GCs凋亡的同時(shí)伴有BAX、BCL2和caspase3等凋亡基因的表達(dá)量變化，通常細(xì)胞凋亡途徑分為內(nèi)部線粒體途徑和死亡受體介導(dǎo)的外部凋亡途徑，其中內(nèi)部凋亡途徑主要受BCL2家族蛋白調(diào)控，而外部凋亡途徑的主要調(diào)控因子為效應(yīng)凋亡蛋白酶caspase3[25]。本試驗(yàn)證實(shí)了miR-495-3p能夠引起B(yǎng)AX和BCL2表達(dá)量的變化，表明miR-495-3p可能通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)GCs凋亡。

GCs的增殖對(duì)卵泡發(fā)育成熟起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p呈時(shí)間依賴性地抑制GCs增殖并下調(diào)PCNA蛋白水平，過表達(dá)miR-495-3p將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。在腫瘤細(xì)胞中，CDK的表達(dá)變化導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂[26]，抑制CDK4可以影響細(xì)胞G1期阻滯，顯著抑制細(xì)胞增殖[27]，而在骨肉瘤的研究中，過表達(dá)miR-495-3p能夠降低CDK4、CDK6、CCND1和CCNA2表達(dá)水平從而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖[28]。因此，miR-495-3p通過抑制CDK4和CCND1的表達(dá)可能阻滯了細(xì)胞周期進(jìn)程，但是miR-495-3p具體通過何種途徑影響GCs周期有待進(jìn)一步研究。

哺乳動(dòng)物在整個(gè)發(fā)情周期，卵泡會(huì)經(jīng)歷形態(tài)和生理功能變化，這些變化是由卵巢中GCs分泌的類固醇激素E2和P4調(diào)控介導(dǎo)。有研究表明，哺乳動(dòng)物體內(nèi)E2濃度越高，體內(nèi)卵泡數(shù)量和體積會(huì)逐漸增加[29]，一般來說，E2合成量取決于兩種情況:一是參與E2合成酶的活性;二是分泌E2細(xì)胞的數(shù)量[30]，并且研究發(fā)現(xiàn)，將E2合成過程中的關(guān)鍵酶CYP19A1敲除后，會(huì)使小鼠出現(xiàn)E2分泌不足從而影響卵泡的發(fā)育[31]。本研究中，同抑制miR-143[32]或miR-764-3p[33]可以增加小鼠卵巢GCs中E2分泌的結(jié)果相似，過表達(dá)miR-495-3p后，在mRNA和蛋白水平均顯著增加E2合成限速酶CYP19A1的表達(dá)量。此外，P4能夠調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)，影響排卵及卵子的質(zhì)量，因此P4是評(píng)價(jià)卵巢功能的重要指標(biāo)之一[34]，在P4合成過程中，StAR將膽固醇從線粒體外運(yùn)送到線粒體內(nèi)，隨后CYP11A1促進(jìn)膽固醇向孕烯醇酮的轉(zhuǎn)化，孕烯醇酮在3β-HSD的作用下生成P4[35]，CYP11A1作用的膽固醇向孕烯醇酮轉(zhuǎn)化過程是P4合成的限速步驟[36]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-495-3p可上調(diào)3β-HSD和CYP11A1表達(dá)，這一結(jié)果說明過表達(dá)miR-495-3p可以通過上調(diào)3β-HSD和CYP11A1促進(jìn)膽固醇到孕烯醇酮再到P4的合成過程。值得注意的是，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制miR-495-3p顯著降低StAR蛋白表達(dá)，這將導(dǎo)致膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體膜內(nèi)的量減少，進(jìn)而限制P4的合成，但試驗(yàn)結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)miR-495-3p促進(jìn)P4合成，這可能由于抑制miR-495-3p提高了P4合成限速酶CYP11A1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)GCs分泌P4。相似的，在豬卵巢GCs中，抑制miR-21-5p可以抑制E2和促進(jìn)P4分泌；抑制miR-130a-3p促進(jìn)山羊卵巢GCs中E2和P4的分泌[37]；miR-101-3p增加奶山羊GCs培養(yǎng)液中E2和P4的含量[38]，這表明，miRNA調(diào)控GCs合成孕酮的機(jī)制可能比預(yù)想的更為復(fù)雜。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，miR-495-3p促進(jìn)山羊卵巢GCs凋亡、抑制其增殖，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，刺激類固醇激素的分泌。表明miR-495-3p在山羊卵泡發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用。

A、B. ELISA檢測(cè)miR-495-3p mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC處理組上清液中E2和P4含量；C. qRT-PCR檢測(cè)類固醇激素合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量；D、E、F、G. Western blot檢測(cè)類固醇激素合成相關(guān)基因3β-HSD、StAR、CYP11A1、CYP19A1的蛋白表達(dá)量A, B. ELISA was used to detect the contents of E2 and P4 in the supernatant of miR-495-3p mimics, mimics NC, inhibitor and inhibitor NC treatment groups; C. qRT-PCR detection of mRNA expression of steroid hormone synthesis-related genes; D, E, F, G. Western blot was used to detect the protein expression of steroid hormone synthesis-related genes 3β-HSD, StAR, CYP11A1 and CYP19A1圖5 miR-495-3p促進(jìn)GCs類固醇激素分泌Fig.5 miR-495-3p promotes the secretion of steroid hormones in GCs