尤桂爽，易興友，蔣美山，李中偉，譚和林，曹 池，舒 剛，田堯夫，朱 慶，趙小玲*

(1．四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都 611130； 2．重慶市開州區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務中心，重慶 405499)

四川盆地由中國西部橫斷山脈、云貴高原、大巴山、武夷山環(huán)繞形成，盆地北部大巴山橫直在萬源宣漢北部，明月山、銅鑼山、華釜山由北而南縱臥其間，自然分割形成盆地和丘陵地貌。海拔跨度極大的地勢造就了豐富的生物多樣性，形成了包括國家畜禽遺傳資源舊院黑雞、城口山地雞、大寧河雞等在內(nèi)的家禽品種[1]。在大巴山脈與長江山峽的交界處，有1個新的家禽品種巖水雞，其體態(tài)輕盈，羽色為純黑或純白，目前處于地方畜牧部門保護開發(fā)的計劃中。南部地區(qū)武夷山和云貴高原的交匯點也有顯著的海拔變化，分布著沐川烏骨雞、豐巖烏骨雞等家禽品種[2]。

城口山地雞地處重慶市城口縣，為肉蛋兼用型品種，羽色純黑，黑膚、烏肉，肉質(zhì)細嫩，深受當?shù)厝嗣竦南矏?。舊院黑雞主產(chǎn)于四川省萬源市舊院鎮(zhèn)，是肉蛋兼用型品種，外觀與城口山地雞近似，羽色純黑，黑膚、烏肉，肉質(zhì)鮮美[3]。大寧河雞產(chǎn)于重慶市巫溪縣，屬兼用型地方品種，公雞紅羽，母雞黃麻羽。巖水雞白羽和黑羽群體產(chǎn)于重慶開州區(qū)，北鄰城口東鄰巫溪，是出名的高寒山區(qū)，該品種環(huán)境適應性強，肉蛋兼用[4]。豐巖烏骨雞羽毛、皮、骨、肉俱黑，產(chǎn)于四川瀘州敘永縣，已有300年以上歷史，長期以來當?shù)孛?、漢農(nóng)民就養(yǎng)殖烏骨雞饋贈親友，配以中草藥滋補療疾。

近年來隨著經(jīng)濟的發(fā)展，交通的便利，出現(xiàn)了相鄰地域品種混雜，毛色不純，膚色變淺等問題，根據(jù)農(nóng)業(yè)部的報告，一些地方雞種的種群數(shù)量一直在迅速減少甚至瀕臨滅絕[5]。第三次全國畜禽遺傳資源普查品種鑒定工作正在開展，為說明四川及其臨近區(qū)域品種間遺傳多樣性，便于后續(xù)的品種保護和開發(fā)利用[6]，本研究采用簡化基因組開展了6個地方雞群體的遺傳研究。簡化基因組測序技術(shù)(genotyping-by-sequencing，GBS)是在二代測序基礎上發(fā)展起來的[7]，通過酶切加標簽的方法測序獲得酶切位點附近基因序列信息，進而檢測大量高準確性的SNP變異位點信息，可了解種質(zhì)資源的遺傳背景和系統(tǒng)演化，研究群體親緣關(guān)系及種群結(jié)構(gòu)[8]。Pértille等[9]用GBS法對462只雞進行測序，鑒定出67 096個SNPs，全基因組覆蓋率為4.66%。豬群測序檢測到假定的SNPs，平均密度為每10 kb有0.33個SNPs[10]。此外，在一項牛研究中還鑒定出63 797個SNPs[11]。GBS是一種經(jīng)濟高效的方法，已成功地應用于群體遺傳學研究[12-14]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用了來自5個保種場的6個地方品種雞，每個品種選取20個個體(10公、10母)共120只，150～250日齡，分別為城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞、豐巖烏骨雞、巖水雞黑羽和巖水雞白羽，采樣信息見表1。將樣本進行翅下靜脈采血，并保存于-20 ℃。使用標準的苯酚/氯仿方法從全血中提取基因組DNA。用分光光度計(德國埃普多夫公司)定量DNA濃度，并將樣品稀釋至最終濃度100 ng·μL-1[15]。

表1 地方雞群體采樣信息

1.2 試驗方法

1.2.1 簡化基因組測序和SNP 鑒定 DNA樣品送往廣州基迪奧生物科技有限公司利用Gallusgallus基因組(GenBank登錄號：GCF_000002315.6)作為參考基因組，用GBS技術(shù)構(gòu)建測序文庫，采用限制性內(nèi)切酶CTGCAG(PstⅠ) + CATG(NlaⅢ)對DNA進行酶切，連接回收后對片段使用高保真酶進行PCR擴增，測定PCR產(chǎn)物濃度后將混好的文庫上機測序(Illumina HiSeqTM 2500)。

高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別轉(zhuǎn)化為原始測序序列，過濾后使用比對軟件BWA(0.7.12)采用mem算法后將過濾后的reads比對到參考基因組上，比對參數(shù)為-k 32 -M；比對完之后結(jié)果使用PICARD(版本1.129)軟件進行標記[16]。使用變異檢測軟件GATK(版本3.4-46)進行群體SNP檢測，然后使用ANNOVAR(版本2)對檢測出的突變位點進行功能注釋。

1.2.2 遺傳數(shù)據(jù)分析 用Perl編程計算觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)、多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)、觀測等位基因數(shù)(number of observed alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(number of effective alleles，Ne)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，Pi)、遺傳分化系數(shù)(F-statistic，F(xiàn)st)、遺傳距離(genetic distance，DR)及基因流(gene flow，Nm)。利用軟件GCTA(Version 1.25.0)進行主成分分析(principle component analysis，PCA)，采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，通過Treebest軟件計算距離矩陣，系統(tǒng)發(fā)生樹的可靠性通過Boot-strap法進行檢驗。使用Admixture軟件(v1.3)[17]進行群體結(jié)構(gòu)的推斷，分別假設樣品的分群數(shù)(K值)為1～9， 然后進行聚類，根據(jù)交叉驗證錯誤率來確定最優(yōu)分群數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 6個地方雞群體的基因組SNPs鑒定

2.1.1 測序質(zhì)量 120個地方雞樣本，剔除2個核酸質(zhì)量低的樣本，通過GBS測序，剩余118個樣本測序質(zhì)量較高(Q20≥97.58%、所有樣品的平均測序深度為20×，平均覆蓋度為6.48%)。經(jīng)過篩選過濾后，118個樣品共獲得291 359個高質(zhì)量的SNPs位點。Q30≥92.74%，GC分布正常，群體樣本與參考基因組的平均比對率為99.33%。

2.1.2 突變篩選 去除等位基因數(shù)大于2、缺失數(shù)據(jù)大于50%、次要等位基因頻率小于5%、雜合度大于80%的標記(SNPs/Indels)，保留271 672個SNPs和19 687個Indels，用于群體遺傳分析。

2.2 6個地方雞群體的遺傳多樣性分析

6個群體的核酸多態(tài)性范圍為6.71×10-5(巖水雞黑羽)～8.58×10-5(大寧河雞)；觀測雜合度范圍為0.133(巖水白羽雞)～0.168(城口山地雞)；期望雜合度范圍為0.154(巖水黑羽雞) ～0.197(大寧河雞)；多態(tài)信息含量范圍為0.125(巖水黑羽雞)～0.162(大寧河雞)，屬低度多態(tài)性(PIC<0.25)；觀測等位基因數(shù)范圍為1.534(巖水雞黑羽)～1.750(城口山地雞)；有效等位基因數(shù)范圍為1.256(巖水雞黑羽)～1.318(大寧河雞)(表2)。整體上大寧河雞和城口山地雞的遺傳多樣性較高，巖水雞黑羽和巖水雞白羽的遺傳多樣性較低。

表2 6個雞群體遺傳多樣性參數(shù)

2.3 6個地方雞群體的遺傳分化系數(shù)和遺傳距離

6個群體間兩兩遺傳分化系數(shù)(Fst)范圍為0.053～0.183，遺傳距離(DR)為0.087～0.119，基因流(Nm)為1.12～4.50。巖水雞黑羽與大寧河雞、舊院黑雞、豐巖烏骨雞，巖水雞白羽與豐巖烏骨雞的遺傳分化較大(0.15≤Fst≤0.25)，其余品種之間的遺傳分化中等(0.05≤Fst≤0.15)。群體間遺傳分化最大的是豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體(Fst=0.183)，最小的是城口山地雞和大寧河雞(Fst=0.053)。群體間遺傳距離最近的是巖水雞黑羽和白羽群體(DR=0.087)，遺傳距離最遠的是大寧河雞和巖水雞白羽群體(DR=0.119)。群體間基因流動最大的是大寧河雞和城口山地雞(Nm=4.05)，流動最小的是巖水雞黑羽和豐巖烏骨雞(Nm=1.12)(表3和表4)。

表3 6個群體間的遺傳分化系數(shù)(Fst)和遺傳距離(DR)

表4 6個群體的基因流

2.4 6個地方雞群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 主成分分析 對獲得的SNPs標記進行主成分分析，結(jié)果表明3個主成分變異貢獻率分別為7.31%、4.31%和4.04%(圖1)。由圖1可以看出，城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞形成一個緊密的類群，豐巖烏骨雞、巖水雞白羽和黑羽相對獨立，并且豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體相對集中，巖水雞白羽群體相對分散。

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)生樹分析 根據(jù)地方雞6個群體的系統(tǒng)發(fā)生樹可以明顯看出(圖2)，城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞和豐巖烏骨雞各自聚為一類，巖水雞白羽和黑羽聚為一類。

圖1 地方雞6個群體的主成分分析Fig.1 Principal components analysis of 6 local chicken populations

圖2 地方雞6個群體的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic tree of 6 local chicken populations

2.5 6個地方雞群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

預設群體分群數(shù)從2到9，通過Admixture軟件分析地方雞的群體結(jié)構(gòu)，根據(jù)交叉驗證錯誤率的谷值確定最優(yōu)分群數(shù)(K)。如圖3所示，當K=5時交叉驗證錯誤率最低，說明本研究分析的樣品最大概率來自于5個原始的祖先。圖4展示了6個群體的遺傳結(jié)構(gòu)。當K=2和3時，巖水雞黑羽和白羽明顯具有和其它品種不同的來源。在K=4時，豐巖烏骨雞與巖水雞黑羽遺傳結(jié)構(gòu)差異大，而城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞遺傳結(jié)構(gòu)近似。在K=5時，大寧河雞、舊院黑雞、豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽遺傳差異明顯，城口山地雞和巖水雞白羽呈現(xiàn)出部分血液混雜，K=6～9呈現(xiàn)出更詳細的品種遺傳信息。

圖3 交叉驗證錯誤率Fig.3 Cross validation error rate

3 討 論

對品種內(nèi)多樣性和物種種群結(jié)構(gòu)的了解是改進品種選擇計劃、了解群體環(huán)境適應性和政府實施種群保護計劃的基礎[18-19]。雖然大多數(shù)群體遺傳結(jié)構(gòu)研究都針對世界性的商用品種，但人們對地方品種的遺傳學關(guān)系越來越感興趣，因為它們可以從根本上理清品種的內(nèi)在關(guān)系[20]。

本試驗利用簡化基因組研究了四川盆地周邊山脈6個地方雞種的基因組多態(tài)性。期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)是衡量標記多態(tài)性較好的指標[21-22]。6個地方雞品種的He范圍為0.154～0.197，平均期望雜合度和Cendron等[23]用全基因組測序分析意大利地方品種雞的結(jié)果相似。6個地方雞品種的PIC范圍為0.125～ 0.162，為低度多態(tài)性(PIC<0.25低度多態(tài)性；0.250.5高度多態(tài)性)[24]。本研究中PIC含量結(jié)果低于微衛(wèi)星的結(jié)果[25]，這是由于標記類型之間的差異。由于SNP的雙等位特性，簡化基因組的PIC在0～0.5之間，而對于多等位的微衛(wèi)星標記，PIC在0～1.0之間，由于前者的PIC較低，因此需要比微衛(wèi)星更多的SNPs才能獲得相同的排斥力[26]。Abdalhag等[27]也檢測到類似的低PIC值。在這6個地方品種中，巖水雞黑羽和巖水雞白羽群體的雜合度較低，6個種群遺傳多態(tài)性最高的是大寧河雞，最低的是巖水雞白羽和黑羽群體，其原因是大寧河雞的群體數(shù)量較大且分布的范圍較廣，而巖水雞白羽和黑羽群體可能由于保種群體小，存在遺傳漂變，并局限在一個較為封閉的高山環(huán)境中，與其它群體之間基因交流的機會少。從基因流也可以看出，這兩個群體同其它4個群體的基因流動值最小，因此該品種具有一定的遺傳獨特性，這突顯了保護這些品種生物多樣性的難度，因此必須特別注意這些品種的保護，可以采用各家系等量留種的保種方式，盡量保持現(xiàn)有等位基因，防止近交衰退[28]。大寧河雞的遺傳多樣性較為豐富，其保種效果較好。

圖4 6個地方雞品種的結(jié)構(gòu)聚類分析Fig.4 Structure clustering of 6 local chicken populations

為了解這6個地方品種之間的遺傳關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)，本研究計算了群體的遺傳分化指數(shù)(Fst)和遺傳距離(DR)的成對估計，并進行了主成分、系統(tǒng)發(fā)生樹和Structure分析。Fst揭示了種群間的遺傳分化程度，本試驗中城口山地雞和大寧河雞間分化中等，舊院黑雞和豐巖烏骨雞間分化較大[29-30]。前人的研究表明，印度[31]、中國[32]和非洲本土雞群[33]的Fst值較高(0.15到0.26)，而Rashid等[34]報告了孟加拉國5個地方雞種的Fst在0.084～0.154之間。Hassen等[35]報告了埃塞俄比亞西北部7個土生雞種群的地理距離從0.073到0.13。Seo等[36]發(fā)現(xiàn)5個韓國本土雞之間的成對遺傳距離為0.083～0.171。本研究結(jié)果與上述3個研究結(jié)果相似，遺傳距離值較小。此外，Yamamoto[37]的研究報告了孟加拉土雞不同群體之間的遺傳分化程度較低?？傮w而言，四川盆地地方雞群體間的遺傳分化程度較低，這可能是由于它們之間以及構(gòu)建群體的共同祖先之間的基因流動所致。本研究中Fst和基因流都顯示城口山地雞和大寧河雞群體間的分化程度最小，豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體間的分化最大。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，巖水雞白羽和巖水雞黑羽聚為一類，與基因流結(jié)果一致。利用Structure程序?qū)χ袊胤?個雞群的遺傳結(jié)構(gòu)進行了研究，當K=5時，交叉驗證錯誤率最低，說明本研究分析的樣品應該是來自于5個原始的祖先。結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)還表明，在每個群體中有一定比例的遺傳混合來自其他品種，鄰近地區(qū)或種群可能存在一定的基因流動。同時結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明，豐巖烏骨雞和舊院黑雞被明顯分離開，這與主成分分析和系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果一致。前人研究認為，兩個品種間的遺傳相似系數(shù)為0.795，二者親緣關(guān)系較近[38]。檢測方法不同可能導致了結(jié)果差異[39]。本研究結(jié)果還表明，巖水雞白羽處于系統(tǒng)發(fā)生樹的最遠分支，與本研究其他地方雞種相比存在明顯的遺傳差異。這在主成分、Fst和基于模型的聚類結(jié)果中均有體現(xiàn)。這個聚類結(jié)果與各品種在四川盆地的分布區(qū)域基本吻合, 說明四川地方雞品種的形成與地理環(huán)境存在很大的關(guān)系[40]。

4 結(jié) 論

本研究應用簡化基因組對四川盆地的6個地方雞品種進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巖水雞黑羽群體的遺傳多樣性較低，大寧河雞遺傳多樣性最為豐富。城口山地雞和大寧河雞之間的遺傳分化最低，基因流最高，豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體之間的遺傳分化最高，對應的基因流最低。巖水雞白羽群體和黑羽群體聚為一類，城口山地雞、大寧河雞和舊院黑雞聚為一類，豐巖烏骨雞單獨為一類。位于烏蒙山區(qū)的豐巖烏骨雞與大巴山脈的舊院黑雞、城口山地雞、大寧河雞、巖水雞黑羽和白羽具有較遠的遺傳距離。