曹修凱 王珊 葛玲 張衛(wèi)博 孫偉，

（1. 揚州大學教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際聯(lián)合研究實驗室，揚州225009；2. 揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009）

過去人們認為遺傳變異和可變多樣連接重組（V（D）J recombination）是造成同一個體不同組織或相同組織不同細胞間基因組DNA異質性的主要原因。而最近研究表明從基因組上脫離形成的環(huán)形DNA是基因組DNA異質性的重要來源，在基因組進化和環(huán)境適應性等方面具有重要意義。染色體外環(huán)形DNA（extrachromosomal circular DNA，eccDNA）指來源于基因組DNA并游離于染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它在真核生物中普遍存在，如酵母、線蟲、果蠅、植物、哺乳動物等，通常攜帶部分或完整的基因以及功能元件，通過特殊的方式參與機體衰老、耐藥性、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展進程。

我國動物育種正處在現(xiàn)代分子生物學技術與傳統(tǒng)育種手段相結合的階段，而分子標記的鑒定對畜禽早期選種具有重要意義。最新研究表明作為癌癥研究熱點的eccDNA或許也可用于畜禽標記輔助選擇：（1）eccDNA介導KIT基因調控牛白色背線性狀［1］；（2） 包 含 肌 肉 發(fā) 育 相 關 基 因 AGRIN 的eccDNA在肉用王鴿肌肉中顯著富集［2］；（3）包含EPSPS基因的eccDNA使長芒莧對除草劑產(chǎn)生耐藥性，并且可以穩(wěn)定傳遞到子代［3-4］。但eccDNA與單核苷酸變異（SNP）、插入/缺失（Indel）和拷貝數(shù)變異（CNV）等DNA分子標記不同，它存在一定的組織特異性。本文將綜述eccDNA的分類、產(chǎn)生機制、功能研究及鑒定方法等，并就eccDNA在動物育種中的應用前景進行討論。

1 eccDNA研究歷史

從1869年Friedrich首次鑒定出DNA，到1953年Watson和Crick揭示DNA雙螺旋結構，前后歷經(jīng)85年，人們才確信染色體中的線性雙鏈DNA是遺傳信息的主要載體［5-6］。但基于細菌基因組環(huán)形DNA的現(xiàn)象，1962年Stahl提出真核生物可能存在染色體環(huán)形DNA分子。1965年，Hotta和Bassel［7］利用電鏡技術發(fā)現(xiàn)豬精子存在基因組染色體外環(huán)形DNA 分子，長度在 0.5 μm-16.8 μm（注 ：1 μm ≈3 100 bp［8］），初步證實了 Stahl的推測。同年 Cox 等［9］利用光學顯微鏡在有絲分裂中期的成神經(jīng)細胞瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了游離于基因組染色體之外的數(shù)目眾多、成對出現(xiàn)和大小不等的染色體（雙微體，doubleminute，DM）。1967年，Radloff等［10］將 Hela細胞核內環(huán)形DNA與線粒體DNA比較分析發(fā)現(xiàn)，細胞核內環(huán)形DNA長度在0.2 μm-19.8 μm，而線粒體DNA長度在（4.81±0.24）μm，前者個數(shù)占后者的20%左右，這項研究進一步證實了真核細胞中存在除線粒體之外的環(huán)形DNA。

1972 年 Smith 等［11］將長度在 0.05 μm-2.0 μm的染色體外環(huán)形DNA定義為小多分散環(huán)狀DNA（small polydisperse circular DNA，spcDNA），并且發(fā)現(xiàn)放線酮處理或細胞接觸抑制會使Hela細胞spcDNA的數(shù)目增加至少10倍以上。深入研究發(fā)現(xiàn)同種細胞或組織的spcDNA在長度和個數(shù)上存在較高異質性［12-14］。20世紀80-90年代，人們利用Sanger雙脫氧鏈終止法、Dot blot、Southern blot和酶切等技術發(fā)現(xiàn)spcDNA存在大量基因組重復序列，如 SINE［15-16］、LINE［17］、串聯(lián)重復序列［18-19］、轉座子序列［20］、rDNA 序列［21］和端粒重復序列［22］等，其中，人染色體外環(huán)形rDNA（extrachromosomal rDNA circle，ERC）長度在 2 kb-20 kb［23］，人染色體外環(huán)形端粒（telomeric circle，t-circle）長度在0.7 kb-56.8 kb［24-25］，但有關非重復序列型spcDNA的研究報道很少［26-27］。DM是腫瘤特異的，并且存在完整癌基因序列，如肺癌［28］、軟骨肉瘤［29］、神經(jīng)膠質瘤［30-31］、淋巴瘤［32］和骨髓性白血?。?3］等，但DM出現(xiàn)的頻率很低：182/200種腫瘤中鑒定出DM；DM陽性腫瘤類型的病例檢出比為0.26%-44%；DM陽性腫瘤細胞水平檢出比例最低為7%［34-36］。因此，科學家們一度認為spcDNA是eccDNA的主要存在形式，并且spcDNA主要是由重復序列構成的。但隨著高通量測序技術的發(fā)展，人們開始對eccDNA有了新的認識。2012年，Shibata等［37］在小鼠組織和多種細胞系中鑒定出大量長度在200 bp-400 bp的小分子eccDNA，它們主要來源于5′ UTR、外顯子和CpG島等區(qū)域，并將其命名為microDNA。隨后M?ller等［38］在正常人類肌肉組織和白細胞中也鑒定出大量microDNA。2017年，Turner等［39］提出染色體外DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA）概念，他們發(fā)現(xiàn)在17種癌癥117種腫瘤細胞系中大約30%的ecDNA是以DM形式存在。之后人們用ecDNA特指腫瘤細胞中長度較大（數(shù)百 kb-數(shù)Mb）并且至少包含一個完整基因的染色體外環(huán)形DNA，而將長度較小的染色體外環(huán)形DNA用eccDNA（extrachromosomal circular DNA，eccDNA，狹義，筆者劃分為 ＜ 100 kb）表示［40-42］。

值得注意的是在早期研究染色體外環(huán)形DNA時，人們提出了一些相關概念，在此筆者做出區(qū)分。1985年，Kinoshita和Kunisada等［43-44］在煙草和小麥中鑒定出cccDNA（covalently closed circular）和spcDNA，隨后認為它們是不同分離富集方法下的同一類分子的兩種不同形態(tài)。1987年，Carroll等［45］將CAD基因重組質粒轉染CAD-/-CHO細胞系，研究DM的形成機制，結果發(fā)現(xiàn)有些細胞基因組整合了質粒，而有些細胞存在包含部分質粒序列和基因組序列環(huán)形分子（作者命名為episome）。深入研究發(fā)現(xiàn)，刪除的基因組序列環(huán)化形成episome，episome多聚化形成DM，DM又可以重新整合到基因組，因此游離體是DM的前體［46-51］。eccDNA分類如圖1所示。下文除明確指出外，eccDNA指廣義eccDNA。

圖1 eccDNA的分類Fig.1 eccDNA classification

2 eccDNA形成的分子機制

由上可知，eccDNA在序列長度和特征上有很大的異質性，因此eccDNA的產(chǎn)生可能涉及了不同分子機制，但這些機制似乎都與基因組DNA修復過程有關［52］。筆者將這些機制概括為4大類：同源重組（homologous recombination，HR）、非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）、DNA 復 制和轉錄（圖2），其真實性仍需進一步驗證。

圖2 形成eccDNA的潛在機制Fig.2 Possible mechanisms of forming eccDNA

在DNA雙鏈斷裂的情況下，rDNA和tDNA可通過loop結構介導HR分別產(chǎn)生ERC和t-circle［53］。Dillon等［54］為了系統(tǒng)研究microDNA的產(chǎn)生機制，以雞DT40細胞系為模型，分別敲除NHEJ、HR和MMR關鍵蛋白，結果發(fā)現(xiàn)敲除錯配修復關鍵基因MSH3后，microDNA數(shù)量減少了81%，證明了microDNA的產(chǎn)生與DNA錯配修復存在密切關系。此外，microDNA主要來源于GC富集區(qū)、5′ UTR和外顯子區(qū)，這些區(qū)域在轉錄時極易形成DNA：RNA三鏈結構R-loop，而該結構參與了DNA損傷和修復過程，因此R-loop可能與microDNA產(chǎn)生有關，但這有待進一步驗證［55］。ODIRA（origin-dependent inverted-repeat amplification）可能也是產(chǎn)生microDNA的機制之一，由于復制泡兩端反向短重復序列的存在，使新生DNA鏈發(fā)生環(huán)化［56］。抑制HR關鍵基因BRCA1或NHEJ關鍵基因DNA-PK會導致含有DHFR基因的ecDNA拷貝數(shù)減少，也可消除結腸癌MTX（甲胺喋呤）抗性細胞中的eccDNA，說明雙鏈斷裂或大片段的DNA序缺失可通過HR或NHEJ環(huán)化形成ecDNA［57-58］，包括DM和游離體，游離體可進一步多聚化形成更加復雜的游離體或DM［46，48］。表1列舉了eccDNA機制研究相關文獻。

表1 形成eccDNA的11種潛在機制對應參考文獻Table 1 Corresponding references of 11 kinds of potential mechanisms for eccDNA formation

3 eccDNA的功能研究進展

eccDNA缺少著絲粒和端粒，能夠自我復制（microDNA未知），有絲分裂和減數(shù)分裂時隨機分配到子代細胞，部分eccDNA可以重新整合到基因組同源染色區(qū)域（homogeneously staining region，HSR），并且ecDNA較高染色質開放性強使得eccDNA上調控元件與靶基因互作更強，基因表達水平更高，這些特性極大的增加了細胞異質性和環(huán)境適應性［40-41，71］。eccDNA 功能概括如圖 3。

圖3 eccDNA的功能Fig.3 An overview of current understanding of eccDNA functions

3.1 端粒和rDNA拷貝數(shù)維持

不依賴于端粒酶的t-circle修復途徑對端?？勺冄娱L（alternative lengthening of telomeres，ALT）具有重要意義。這種機制最初是在酵母線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)的，t-circle可以作為端粒DNA滾環(huán)合成的模板，動植物中廣泛存在的t-circle極有可能具有類似的功能［25，72］。此外，據(jù)估計15%人類永生化細胞系可能通過ALT維持端粒長度［73］。真核生物rDNA拷貝數(shù)可達100-1 000個，以串聯(lián)重復的方式排列在基因組上，以滿足機體對核糖體合成的需求。ERC的產(chǎn)生會導致果蠅基因組rDNA拷貝數(shù)減少，但是其子代生殖細胞rDNA拷貝數(shù)可恢復正常，研究表明ERC可以自我復制并可以重新整合到基因組上維持或增加基因組rDNA的拷貝數(shù)［59］。但是ERC的整合并不多見，因此ERC對維持基因組rDNA拷貝數(shù)的作用仍有待深入研究。

3.2 細胞中eccDNA的積累導致衰老

Sinclair等［74］發(fā)現(xiàn)衰老的酵母細胞中會出現(xiàn)大量ERC，在有絲分裂時這些具有自我復制能力的ERC表現(xiàn)出母細胞偏好性，使ERC在母細胞中進一步累積。據(jù)估計，酵母細胞分裂15代之后，每個母細胞含有500-1 000個ERC。大量的ERC會吸附復制和轉錄復合物，使得基因組DNA無法進行有效復制和轉錄，最終導致酵母生長停滯，直至死亡［74］。酵母解螺旋酶Sgs1基因突變會導致ERC的快速積累并發(fā)生早衰，相反，復制叉阻斷蛋白Fob1基因突變會抑制ERC的形成，并延緩衰老［75］。M?ller與Payen等［76-77］研究發(fā)現(xiàn)年輕酵母群中存在近1 800種不同基因組來源的eccDNA，并且絕大多數(shù)eccDNA至少含有蛋白編碼基因的部分序列，但這1 800種eccDNA拷貝數(shù)很少，它們幾乎不會對酵母表型產(chǎn)生影響，任何eccDNA只有大量積累之后才會產(chǎn)生作用［75］?；谝陨鲜聦?，Hull等［75］提出酵母衰老可能是酵母為適應外部或內部環(huán)境富集了某些eccDNA而犧牲了健康的結果，因為基因拷貝數(shù)的擴增會在某種程度上破壞基因調控網(wǎng)絡和蛋白穩(wěn)態(tài)。按照Hull等推測，CuSO4處理酵母后而富集的CUP1 eccDNA可能對酵母衰老也有作用［53］，但這需要進一步實驗驗證。

3.3 eccDNA通過增加基因拷貝數(shù)使機體產(chǎn)生耐藥性

致癌變異EGFR vIII能有效加速膠質母細胞瘤生長，但是它也使表達它的腫瘤細胞對EGFR酪氨酸激酶抑制劑TKI更加敏感。TKI處理之后，腫瘤組織中高表達EGFR vIII的TKI敏感腫瘤細胞比例降低，低表達EGFR vIII的TKI抗性腫瘤細胞比例升高。研究表明腫瘤TKI耐藥性是通過消除包含EGFR vIII的DM而產(chǎn)生的，消失的DM可以整合到基因組HSR上，但當停藥后，這種DM又會快速出現(xiàn)，通過該途徑，癌細胞可以逃避癌基因的靶向治療。因此，TKI的脈沖間歇治療可達到更好的靶向抑制效果，同時使腫瘤恢復藥物敏感性［39，78-79］。值得注意的是，EGFR DM在復制過程中也能會產(chǎn)生EGFR DM，進一步提高腫瘤異質性和適應性［79］。在植物中，Koo等［3-4］發(fā)現(xiàn)在抗草甘膦長芒莧中存在包含EPSPS基因的eccDNA，而且eccDNA可以通過有絲分裂和減數(shù)分裂傳給下一代，這表明eccDNA分子可以驅動高等生物的快速適應性進化。

3.4 腫瘤發(fā)生

ecDNA是基因擴增的一種形式，ecDNA的非孟德爾遺傳會導致腫瘤內細胞間的異質性增強，促進腫瘤進化［39，80-81］。攜帶完整原癌基因MET、EGRF或MYC的ecDNA可以使腫瘤細胞快速增殖，攜帶完整原癌基因MYCN的ecDNA對腫瘤侵襲和遷移具有重要作用［69，80］。早期的研究認為ecDNA對癌基因表達的貢獻主要是由于基因拷貝數(shù)的增加所致。2019年Wu團隊研究發(fā)現(xiàn)ecDNA對癌基因的表達增高不僅僅由于基因拷貝數(shù)的升高，還包括ecDNA本身高度轉錄活性的貢獻［41］。ecDNA上面缺乏抑制型的組蛋白修飾和高級壓縮結構，導致其開放性比染色體DNA要強，并且ecDNA上的增強子不受絕緣子的束縛，可以與原癌基因產(chǎn)生超遠距離的DNA相互作用，進一步促進基因表達［82-83］。人類正常個體和癌癥個體血清和血漿中存在大量游離的eccDNA，這些eccDNA主要是microDNA［84-85］。切除腫瘤前后，血液中游離的mircoDNA其長度分布會發(fā)生變化，說明microDNA可以作為腫瘤診斷的分子標記［85］。腫瘤異種移植后可以在受體血液中檢測到游離的供體microDNA，說明microDNA可能參與了細胞間通訊［85］。含有ecDNA的腫瘤患者其生存期要顯著低于不含有ecDNA的腫瘤患者，說明ecDNA可以作為腫瘤的預后標記物［86-87］。

3.5 eccDNA對畜禽表型的影響

目前有關eccDNA對畜禽表型影響的研究已有報道，包括牛白色背線性狀（colour sideness，Cs）和鴿子肌肉發(fā)育。牛白色背線性狀表現(xiàn)為從頭頸至臀尾部的白色背線，屬于顯性遺傳性狀。eccDNA通過影響毛色關鍵基因KIT的表達調控牛白色背線性狀。6號染色體上一段包含KIT基因的492 kb的片段通過環(huán)化形成eccDNA（Durkin等命名為環(huán)形中間體circular intermediate）易位到29號染色體，形成Cs29等位基因。包含Cs29等位基因的一段575 kb的基因組片段環(huán)化后易位到6號染色體，構成Cs6等位基因［1］。eccDNA介導了KIT基因轉座，使其異常表達。M?ller［2］研究發(fā)現(xiàn)肉用王鴿（king pigeon）肌肉組織eccDNA數(shù)目比信鴿（homing pigeon）高9倍，并且在肉用王鴿顯著富集了包含AGRIN基因的eccDNA，而AGRIN基因編碼一種細胞膜蛋白，參與神經(jīng)肌肉接頭的發(fā)育，該基因突變會導致肌肉發(fā)育異常［2］。并且在植物中，Koo與Molin等［3-4］發(fā)現(xiàn)在抗草甘膦長芒莧中存在包含EPSPS基因的eccDNA，而且eccDNA可以通過有絲分裂和減數(shù)分裂傳給下一代，這表明eccDNA分子可以驅動高等生物的快速適應性進化。這些研究結果表明eccDNA或許可以用于畜禽分子標記選擇。但是eccDNA具有一定的時空特異性，類似于mRNA，這會限制其應用。例如，如何利用肌肉組織特異的eccDNA作為分子標記來實現(xiàn)肉用家畜的早期選種？因此，血液中游離的mircoDNA或許可作為未來畜禽分子育種的方向之一。通過前期血液eccDNA的篩選和后期關聯(lián)分析，或許可以鑒定出相關eccDNA標記。

4 eccDNA的鑒定方法

樣品總DNA提取之后，可直接進行顯微觀測，也可利用Hirt法簡單富集低分子量（low molecular weight，LMW）DNA后進行顯微觀測和2D電泳［88-89］。染色體核型分析時，可在光學顯微鏡下觀測到DM［35］，但小分子eccDNA則需要電子顯微鏡進行觀測，并且可以估算eccDNA大?。?0］（圖4）。2D電泳也可鑒定eccDNA的大小，Cesare等［24］利用2D電泳鑒定出的eccDNA在0.7 kb-56.8 kb。2D電泳通?？捎^測到4條泳帶，包括開放環(huán)（open circle）條帶、超螺旋環(huán)（supercoiled circle）條帶、線性DNA（linear DNA）條帶和電泳過程中超螺旋環(huán)轉變?yōu)殚_放環(huán)（supercoilded to open circle）而形成的條帶［88］。開放環(huán)是eccDNA主要構型，但無法確定2D電泳條帶中的開放環(huán)是松散環(huán)（relaxed circle）還是缺口環(huán)（nicked circle）［90］。2D 電泳結合Southern blot等印記技術可以進一步揭示eccDNA序列特征及相對豐度［90］。此外，細胞經(jīng)DAPI染色后，利用電鏡結合ECdetect軟件可實現(xiàn)細胞中ecDNA的計數(shù)［39］。

與質粒提取試劑盒相比，CsCl-EB法從總DNA中富集eccDNA上樣量大、操作繁瑣、缺口環(huán)易丟失，所以目前應用較少［90-92］。富集后的eccDNA可采用Circulome-seq［92］、mobilome-seq［93］、Circle-seq［76］或 CIDER-seq［94］進行高通量測序（圖 4）。Circulome-seq采用Tn5轉座酶在一個反應中完成實現(xiàn)eccDNA線性化、末端修復和接頭連接，極大簡化了文庫構建，可檢測數(shù)百bp-數(shù)百kb的eccDNA；mobilome-seq采用核酸外切酶DNase消化eccDNA富集樣品中的線性DNA，滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）后，進行高通量測序，可用于鑒定反轉座子形成的eccDNA；Circle-seq為了充分消化線性DNA，在核酸外切酶DNase消化之前，先用核酸內切酶Not I對富集的樣品進行處理，所以會造成部分eccDNA的丟失，鑒定范圍在1 kb-38 kb；CIDER-seq可檢測數(shù)百bp-數(shù)百kb的eccDNA，但＜ 10 kb的eccDNA鑒定準確度更高。該方法對富集后的eccDNA直接進行RCA，沒有進行酶切處理，因此線性基因組得到大量擴增，但該方法采用了SMRT長讀長（long read）測序策略，可以得到更多的split read，這有利于eccDNA的鑒定，因為用于eccDNA鑒定的軟件都依賴于split read。在進行測序文庫構建時可以加入質粒作為對照或內參，可提高驗證文庫構建和后續(xù)數(shù)據(jù)分析的可靠性。依據(jù)eccDNA的數(shù)據(jù)分析原理，可以直接從全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）或ATAC-seq 數(shù) 據(jù) 中 鑒 定 eccDNA［39，80，95］， 或 者 先富集總DNA中的高分子量（high molecular weight，HMW）DNA，WGS后，進行數(shù)據(jù)分析，可鑒定出更多的 ecDNA［41］。Koche 等［42］證實 100% 的 WGS ecDNA在Circle-seq ecDNA中重現(xiàn)，但僅有30% 的WGS eccDNA（狹義）被Circle-seq鑒定出來。目前利用高通量測序數(shù)據(jù)鑒定eccDNA的軟件主要有AmpliconArchitect［96］、AmpliconReconstructor［97］、CIRCexplorer2［98］、Circle_finder［42］、Circle-Map［99］和ECCsplorer［100］等，Prada-Luengo對應用較多的3款軟件進行了對比［99］，此處不再詳述。

圖4 eccDNA的鑒定方法Fig.4 Methods for eccDNA identification

5 總結與展望

eccDNA在真核生物中是普遍存在的，包括動物、植物和酵母等。依據(jù)來源和大小，eccDNA可以劃分為不同種類，它們的產(chǎn)生機制也不盡相同，共涉及了11種模型。但這些模型都缺少直接證據(jù)，例如支持eccDNA自我復制的直接證據(jù)，因此這些模型仍需要進一步驗證。盡管這些問題尚未解決，但是目前已開發(fā)了可用于單倍型分型的CRISPR-hapC技術［101］。該技術基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因組片段（兩個SNP位點位于片段兩端），環(huán)化形成eccDNA，使兩個SNP出現(xiàn)在eccDNA接頭處，提取DNA，轉化感受態(tài)細胞后，單克隆測序鑒定基因組單倍型。該技術可以可以實現(xiàn)200 Mb基因組序列單倍型鑒定［101］，在功能基因組學研究和因果突變鑒定方面具有廣闊的應用前景。

大分子eccDNA，如ecDNA，通?？梢詳y帶完整原癌基因，這使其成為腫瘤研究領域的熱點。并且攜帶eccDNA的腫瘤患者，其生存率顯著低于不攜帶eccDNA的患者，說明大分子eccDNA可以作為腫瘤預后的生物標記［86-87］。在動植物中，大分子eccDNA也可以攜帶完整基因，如KIT和EPSPS在表型變異環(huán)境適應方面發(fā)揮重要作用，并且這種以獲得的表型可以穩(wěn)定地傳遞給下一代［1，3-4］。此外，這種大分子eccDNA在正常組織中含量不低，如鴿子肌肉組織中共有1 083個完整基因存在于eccDNA上［2］。這些結果表明，大分子eccDNA可用于分子標記輔助選擇。但eccDNA存在時空特異性，這在某種程度上限制了其應用，例如，肌肉組織特異的eccDNA在畜禽肉用選育中的應用。因為即便是肌肉組織活體采樣，也會對待測畜禽產(chǎn)生影響，更不用提早期選育。

研究表明，microRNA占eccDNA的絕大部分，它們可以由其他組織釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中［84-85］。通過高通量測序技術，鑒定血液中游離的microDNA，利用qPCR進行相對定量，并與畜禽表型數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析，鑒定可用的microDNA標記。因此，血液游離microRNA的鑒定及其與表型關聯(lián)分析是未來eccDNA應用于畜禽育種的一個重要方向。目前，已有eccDNA專門數(shù)據(jù)庫（eccDNAdb，http：//www.eccdnadb.net/），并已收錄了人、小鼠和雞共計170萬個eccDNA，這些數(shù)據(jù)可為關聯(lián)分析提供數(shù)據(jù)支撐。如果血液中microDNA的豐度確實與表型變異存在顯著相關，那其中的分子機制又有哪些。目前，已有人提出了兩種潛在機制：作為分子海綿吸附轉錄因子和轉錄產(chǎn)生非編碼RNA，但目前尚未有任何相關研究報道［60，64，102-103］。這些問題的深入研究，將促進eccDNA在畜禽育種中的應用。