張亞萍，袁亞宏，岳田利，2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）（2.西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710069）

近年來，以高血脂為代表的“三高”癥狀已成為一種日益年輕化的疾病，據(jù)衛(wèi)生部門統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，自2012年以來，我國(guó)成年人的血脂異?？傮w患病率超過四成，6～17歲的兒童青少年群體中血脂異?？倷z出率高達(dá) 28.5%[1]。不合理的飲食結(jié)構(gòu)是誘導(dǎo)血脂異常的主要因素之一，長(zhǎng)期血脂水平過高會(huì)引發(fā)高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病[2]。研究表明，腸道菌群可促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，在宿主的能量代謝和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[3]，腸道菌群結(jié)構(gòu)改變、功能失調(diào)與肥胖、心腦血管疾病之間也具有關(guān)聯(lián)性[4，5]。相比于藥物治療，通過飲食改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成以恢復(fù)能量供需平衡，具有副作用產(chǎn)生率低、安全可控性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。

硒作為人體必需的微量元素，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、保護(hù)心腦血管等有益生理功能[6]。但自然界中分布較廣的為無機(jī)形態(tài)的硒，毒理活性強(qiáng)、體內(nèi)吸收利用率低[7，8]，使其開發(fā)利用受阻。紅曲霉是一種優(yōu)良的微生物富硒載體，通過微生物富集作用將亞硒酸鈉等無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為硒蛋白或硒代氨基酸等有機(jī)硒[9，10]，有效降低無機(jī)硒的毒副作用，提高硒的生物利用率。同時(shí)，紅曲霉在固態(tài)發(fā)酵過程中，也會(huì)產(chǎn)生抑制膽固醇合成的洛伐他汀[11]，相比于化學(xué)合成的他汀類降脂藥物，生物合成途徑獲取的洛伐他汀具有更顯著的降脂效果和較低的副作用產(chǎn)生率[12]，因此被廣泛應(yīng)用于高血脂人群的膳食干預(yù)研究中。研究證實(shí)，紅曲米的降血脂功效與腸道菌群組成的改變有關(guān)。Dong等[13]發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠經(jīng)紅曲米干預(yù)后，血脂水平降低，腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，其中與血清TC和LDL-C呈正相關(guān)的Alistipes和Flavonifractor的相對(duì)豐度顯著降低。Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)由紅曲米分離提取的紅曲色素具有改善高脂血癥的功效，模型組小鼠腸道中與脂質(zhì)代謝和炎癥參數(shù)呈負(fù)相關(guān)的菌屬的相對(duì)豐度顯著增加。

此外，硒與血脂水平、腸道健康之間也存在關(guān)聯(lián)性。研究證實(shí)，適量補(bǔ)充有機(jī)硒可恢復(fù)脂代謝和腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[15-17]。Sharma等[18]研究發(fā)現(xiàn)，膳食中攝入足量的硒可以優(yōu)化宿主的腸道菌群，保護(hù)腸道免受外界不良刺激誘導(dǎo)的炎癥損害和有害細(xì)菌侵染。Reid等[19]發(fā)現(xiàn)膳食中補(bǔ)充硒會(huì)影響宿主腸道菌群的組成，而腸道菌群也會(huì)影響硒的生物利用度。富硒紅曲米是將紅曲霉（Monascus）接種于添加亞硒酸鈉的大米上經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備的一種發(fā)酵食品。然而，人們對(duì)富硒紅曲米在體內(nèi)的降脂和腸道健康調(diào)節(jié)功效尚不明確。因此，本研究以高脂飲食小鼠為研究對(duì)象，探究富硒紅曲米對(duì)其脂代謝和腸道菌群的影響作用，旨在為一種降血脂功能性富硒食品的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

基礎(chǔ)對(duì)照飼料、高脂飼料（飼料成分表見表1），江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司；食品級(jí)羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），上海源葉生物科技有限公司；總甘油三酯（TG）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，武漢塞維爾生物科技有限公司；紅曲米、富硒紅曲米均由本實(shí)驗(yàn)室制備所得（采用高效液相色譜法[20]測(cè)定洛伐他汀含量；采用紫外可見分光光度法[21]測(cè)定紅曲色素含量；采用氫化物-原子熒光光譜法[22]測(cè)定總硒含量；采用柱前衍生化-高效液相色譜法[23，24]測(cè)定有機(jī)硒含量）。紅曲米和富硒紅曲米的主要成分及含量見表2。

表1 飼料成分表Table 1 Feed composition table

表2 不同物質(zhì)中主要成分含量Table 2 Content of main components in different products

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

ABI-9700 PCR儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；KZ-II高速組織研磨儀，武漢塞維爾生物科技有限公司；D3024R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，大龍興創(chuàng)儀器（北京）股份公司；Epoch-67酶標(biāo)檢測(cè)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；Chemray-240全自動(dòng)生化分析儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；BX-43電子顯微鏡，美國(guó)奧林巴斯公司。

1.3 紅曲米及富硒紅曲米混懸液的制備

（1）紅曲米混懸液的制備流程：將紅曲霉菌株CICC41601接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。無菌條件下，將生理鹽水注入菌種的斜面培養(yǎng)基上，用竹簽將菌絲輕輕刮下，將洗脫液轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的錐形瓶中，于28 ℃、120 r/min震蕩30 min，使孢子均勻分布（孢子懸液濃度為106～107CFU/mL）。移取1 mL孢子懸液接種于100 mL PDB培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，獲得種子擴(kuò)大培養(yǎng)液。稱取30 g秈米于250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水將基質(zhì)的初始含水量調(diào)節(jié)至 30%左右，自然 pH，浸泡過夜后，于121 ℃、高壓滅菌15 min。取3 mL種子擴(kuò)大培養(yǎng)液，接種于滅菌后的秈米上，用竹筷充分?jǐn)嚢韬?，用透氣封口膜將瓶口扎緊，于28 ℃恒溫培養(yǎng)15 d。發(fā)酵結(jié)束后，將產(chǎn)物置于 50 ℃烘箱中烘干至恒重。將紅曲米粉碎過篩（40目）后，以0.5%的CMC-Na制成質(zhì)量濃度為9.4%的紅曲混懸液，置于4 ℃低溫、避光條件下密封儲(chǔ)存。

（2）富硒紅曲米混懸液的制備流程：將富硒馴化后的紅曲霉菌株 CICC41601作為發(fā)酵菌株，用 20 μg/mL的亞硒酸鈉溶液替代蒸餾水以調(diào)節(jié)基質(zhì)的初始含水量，其他步驟與紅曲米制備過程相同。將富硒紅曲米粉末與0.5%的CMC-Na充分混合，分別制成質(zhì)量濃度為 2.4%、4.7%、9.4%的富硒紅曲混懸液，置于4 ℃低溫、避光條件下密封儲(chǔ)存。

1.4 動(dòng)物分組及處理方法

48只6周齡雄性C57BL/6J小鼠(體重18～20 g)，購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（陜）2020-001；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（陜）2020-005）。所有實(shí)驗(yàn)流程均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南：第八版》(ISBN-10:0-309-15396-4)執(zhí)行，該實(shí)驗(yàn)規(guī)程已獲取西北農(nóng)林科技大學(xué)批準(zhǔn)。適應(yīng)性培養(yǎng)1周后，按體重水平隨機(jī)分為 6組（n=8），根據(jù)不同物質(zhì)中洛伐他汀含量確定各組小鼠的每日灌胃劑量：HFD-LSRYR和HFD-MSRYR 組分別為0.24 g/kg·BW、0.47 g/kg·BW（相當(dāng)于洛伐他汀的人體推薦劑量的5倍、10倍），HFD-HSRYR組、HFD-RYR組均為0.94 g/kg·BW（相當(dāng)于洛伐他汀的人體推薦劑量的20倍）。具體分組及處理方法見表3。

表3 動(dòng)物分組及處理方法Table 3 Animal grouping and treatment methods

試驗(yàn)過程中，除CD組動(dòng)物喂以基礎(chǔ)對(duì)照飼料外，其余各組均喂以高脂飼料。試驗(yàn)期間，每天對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物灌胃一次，各組動(dòng)物自由飲水，正常攝食。經(jīng)過 8周的飲食干預(yù)后，對(duì)小鼠禁食12 h（不禁水）后麻醉、解剖。

1.5 血脂水平測(cè)定

對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉后，通過眼球取血法獲取新鮮血液，在4 ℃下，以5000 r/min離心15 min以分離出上層血清，并將其轉(zhuǎn)移至潔凈的離心管中。置于液氮罐中凍存待測(cè)。采用試劑盒法通過全自動(dòng)生化分析儀對(duì)小鼠血清中血脂生化指標(biāo)（甘油三酯 TG、總膽固醇TC、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C和低密度脂蛋白膽固醇LDL-C）含量進(jìn)行測(cè)定。

1.6 肝臟組織的病理學(xué)觀察

取出部分已去除表面血漬的新鮮肝臟組織，將其浸沒于 4%的多聚甲醛溶液中，進(jìn)行固定處理。然后通過石蠟包埋、切片、經(jīng)蘇木素伊紅（HE）工作液染色處理后，封片。于電子顯微鏡下對(duì)不同組織進(jìn)行病理學(xué)形態(tài)觀察，并拍照記錄。

1.7 肝臟組織的脂肪狀態(tài)觀察

取出部分已去除表面血漬的新鮮肝臟組織置于液氮罐中快速冷凍，用 OCT包埋膠（聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物）在冷凍好的組織表面進(jìn)行包埋、切片。切片先經(jīng)水洗、異丙醇浸洗，進(jìn)行油紅O染液染色處理，再經(jīng)異丙醇分色、水洗，進(jìn)行HE復(fù)染。最后，流水清洗以進(jìn)行藍(lán)化，蒸餾水洗后，棄去多余水分，封片。在電子顯微鏡下觀察肝臟組織中脂肪堆積狀態(tài)。

1.8 糞便的采集及送樣

最后一天灌胃結(jié)束后，在無菌操作條件下，利用無菌離心管收集每組小鼠（n=8）的新鮮糞便，并立即放入液氮罐中凍存。將新鮮糞便樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行腸道菌群基因組提取及高通量測(cè)序處理。

1.9 動(dòng)物腸道菌群分析

通過高通量測(cè)序技術(shù)[25]分析富硒紅曲米對(duì)高脂飲食小鼠腸道菌群的影響：采用試劑盒法對(duì)小鼠糞便基因組DNA進(jìn)行提取，紫外-可見分光光度法對(duì)DNA純度及濃度進(jìn)行測(cè)定，通過糞便菌群的16S rRNA的V3和V4區(qū)構(gòu)建Miseq測(cè)序文庫(kù)，使用的引物對(duì)序列為 ： 338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。PCR 擴(kuò)增體系：4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL 引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu DNA聚合酶，0.2 μL BSA，10 ng樣本基因組DNA模板，加入無菌的去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng) 3 min；95 ℃反應(yīng) 30 s，58 ℃反應(yīng) 30 s，72 ℃反應(yīng)45 s，循環(huán)數(shù)為29；72 ℃反應(yīng)10 min。取PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物3 μL通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，原始數(shù)據(jù)已存入 NCBI序列讀檔案（SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)中，將原始的 16S rRNA基因測(cè)序讀數(shù)經(jīng)過多路分解、質(zhì)量過濾和合并，對(duì)具有97%相似性截止值的操作分類單位（ASV）進(jìn)行了聚類、鑒定并去除嵌合序列，在 Majorbio I-Sanger Cloud在線平臺(tái)上對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.10 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行 3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行，采用Duncan's檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的顯著性，p＜0.05為顯著，p＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 富硒紅曲米對(duì)高脂飲食小鼠血脂水平的影響

各組小鼠的血脂水平變化如表4所示。與CD組相比，HFD組小鼠血清中的TG和TC分別顯著上升了71.15%、66.82%（p＜0.05），LDL-C水平顯著增加了5.65倍（p＜0.05），HDL-C水平顯著降低了58.33%（p＜0.05）。經(jīng)口灌胃富硒紅曲米混懸液可不同程度地改善高脂飲食小鼠的血脂異常癥狀。與HFD組相比，HFD-LSRYR組的血清 TC濃度顯著下降了 13.92%（p＜0.05）；HFD-MSRYR組的血清TC和LDL-C濃度分別顯著降低了20.17%、44.66%（p＜0.05），HDL-C濃度顯著提升了 71.43%（p＜0.05）；HFD-HSRYR 組的血清 TG、TC和 LDL-C濃度分別顯著減少了26.97%、24.43%、49.03%（p＜0.05），HDL-C 濃度顯著增加了95.71%（p＜0.05）。

表4 各處理組小鼠血脂水平（mmol/L）Table 4 Blood lipid levels of mice in each treatment group

隨著富硒紅曲米劑量的增加，小鼠血清TG、TC和LDL-C濃度下降，HDL-C濃度上升；與低劑量組相比，中劑量組的TG水平變化不顯著（p＞0.05）；不同劑量組的TC水平變化無顯著性差異（p＞0.05）；與中劑量組相比，高劑量組的HDL-C增加、LDL-C下降，但均不顯著（p＞0.05），可能是由于干預(yù)周期過短，不能充分凸顯其降血脂活性。此外，與HFD-RYR組相比，HFD-HSRYR組小鼠血清中LDL-C含量顯著降低（p＜0.05），HDL-C水平上升，但不具有顯著性差異（p＞0.05）。結(jié)果表明，高脂飲食誘導(dǎo)小鼠血脂水平升高，導(dǎo)致脂代謝紊亂。富硒紅曲米可改善高脂飲食小鼠的血脂異常癥狀，主要表現(xiàn)為降低血清TC水平，干預(yù)效果與劑量呈正相關(guān)。與紅曲米相比，富硒紅曲米通過顯著降低 LDL-C水平調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠的脂代謝。

研究表明，紅曲米含有天然的降脂活性成分-洛伐他汀，其在體內(nèi)與膽固醇合成反應(yīng)過程的關(guān)鍵限速酶（HMG-CoA還原酶）形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制，從而抑制LDL-C的合成[26]。程慧敏[27]利用紅曲對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠進(jìn)行膳食干預(yù)，12周后發(fā)現(xiàn)血清TC和LDL-C水平顯著降低。除洛伐他汀外，紅曲色素也是一類潛在的降脂活性物質(zhì)。紅曲色素中的紅、黃、橙色素不僅能顯著降低高脂飲食大鼠的血脂水平，而且對(duì)肝臟脂肪堆積癥狀也具有明顯的緩解作用[14]。硒以硒代半胱氨酸的形式參與谷胱甘肽過氧化物酶的構(gòu)成，能及時(shí)清除沉積于血管內(nèi)壁上的自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，避免血管阻塞。然而，缺硒會(huì)誘導(dǎo)血液中的膽固醇和甘油三酯水平上升，增加動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[28]。研究表明，飲食中增加有機(jī)硒蛋白的攝入可顯著降低血清總膽固醇含量[29]。Zhou等[30]發(fā)現(xiàn)膳食生物硒可通過抑制 HMG-CoA還原酶的mRNA表達(dá)降低高脂飲食小鼠血清和肝臟中脂質(zhì)水平。以上文獻(xiàn)報(bào)道與本研究結(jié)果具有相似性，表明富硒紅曲米的降血脂活性可能是由于有機(jī)硒和紅曲中的洛伐他汀、色素的協(xié)同作用，而微生物富硒提高了富硒紅曲米的有機(jī)硒含量，使其對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的膽固醇水平上升具有顯著的抑制效果。

2.2 富硒紅曲米對(duì)高脂飲食小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響

各處理組小鼠肝臟組織切片的HE染色結(jié)果如圖1所示。CD組的肝臟細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核明顯且居于中央，胞間排列緊密，輪廓清晰。HFD組的肝臟細(xì)胞明顯腫脹，空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重，細(xì)胞核偏移，胞間排列松散，輪廓模糊。與 HFD組相比，富硒紅曲米高劑量組的改善效果較顯著，表現(xiàn)為空泡化細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞腫脹化程度下降，細(xì)胞核回歸到細(xì)胞中央位置。然而，紅曲米組和富硒紅曲米低、中劑量組相較于 HFD組，肝臟組織中空泡化細(xì)胞明顯增多且空泡變大，可能是由于試驗(yàn)周期過短，紅曲米和低、中劑量富硒紅曲米對(duì)高脂飲食小鼠肝臟組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改善效果尚未顯現(xiàn)。

各處理組小鼠肝臟組織切片的油紅O染色如圖2所示。HFD組小鼠肝臟組織中有大量的紅色脂滴聚集，出現(xiàn)明顯的脂肪肝癥狀。與 HFD組相比，紅曲米組和富硒紅曲米組小鼠的肝臟組織中紅色脂滴面積明顯變小，脂肪堆積現(xiàn)象顯著改善。其中，富硒紅曲米中、高劑量組抑制肝臟脂肪蓄積的作用明顯優(yōu)于低劑量組。然而，紅曲米和富硒紅曲米對(duì)肝臟脂肪分布的影響無顯著差異，可能是由于灌胃周期過短，紅曲米和富硒紅曲米抑制肝脂質(zhì)蓄積的作用還未完全凸顯。

本研究結(jié)果表明，高脂飲食會(huì)誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪堆積，破壞肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)。富硒紅曲米對(duì)高脂飲食小鼠的脂肪肝和組織損傷具有明顯的改善作用。Zhou等[14]從古田紅曲米中提取分離出紅曲色素（MPs），對(duì)高脂飲食大鼠灌胃8周，觀察到高脂飲食大鼠的肝脂質(zhì)蓄積和脂肪變性癥狀有明顯改善。李艷[31]探究了硒的濃度對(duì)高脂飲食大鼠脂代謝的影響，16周后觀察肝臟病理切片，相比于對(duì)照組，中劑量硒組的脂滴空泡化和脂肪變性程度顯著減輕。結(jié)合上述相似性文獻(xiàn)報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，富硒紅曲米對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪堆積具有顯著的改善效果。

2.3 富硒紅曲米對(duì)高脂飲食小鼠腸道微生物多樣性的影響

Ace指數(shù)、Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)均代表樣本的物種豐富度，Shannon指數(shù)代表樣本物種多樣性。各處理組小鼠的腸道菌群物種多樣性如圖3所示。同CD組相比，HFD組的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Sobs指數(shù)呈極顯著下降（p＜0.001），Shannon指數(shù)也顯著降低（p＜0.05）。與HFD組相比，隨著富硒紅曲劑量的增加，樣本的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Sobs指數(shù)呈顯著上升趨勢(shì)（p＜0.05），其中HFD-HSRYR組的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Sobs指數(shù)顯著高于HFD組（p＜0.05）。結(jié)果表明，高脂飲食會(huì)降低腸道菌群的物種多樣性和物種豐富度，富硒紅曲米對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群的物種多樣性下降具有顯著的改善作用。

Gao等[32]以紅曲合生元、酵母硒及其復(fù)配組合對(duì)高脂飲食動(dòng)物進(jìn)行30 d膳食干預(yù)，與高脂對(duì)照組和單一物質(zhì)組相比，紅曲合生元和酵母硒復(fù)配組的腸道菌群多樣性均顯著增加，Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著上升，由此推測(cè)紅曲和硒可能對(duì)腸道菌群物種多樣性的提升起到了協(xié)同作用。聯(lián)系本研究得到的相似結(jié)果，表明富硒紅曲米同樣具有改善高脂飲食小鼠腸道菌群多樣性的效果。

在 Venn圖中，重疊區(qū)域代表各組樣本的共有物種數(shù)目，未重疊區(qū)域表示該組樣本的獨(dú)有物種數(shù)目。由圖4可知，七組共有物種數(shù)量為62，各組樣本腸道菌群群落的獨(dú)有物種數(shù)目不同。與CD組相比，HFD組獨(dú)有物種數(shù)量由256減少至40。與HFD組相比，HFD-LSRYR組和HFD-MSRYR組的獨(dú)有物種數(shù)目無明顯變化，可能是由于灌胃干預(yù)周期過短，富硒紅曲米對(duì)高脂飲食小鼠腸道菌群物種豐富度的改善效果還未凸顯。HFD-HSRYR組的獨(dú)有物種數(shù)目為 105，相較于HFD組，增加了1.63倍。與HFD-RYR組相比，HFD-HSRYR組的獨(dú)有物種數(shù)目由57上升至105，增加了84.21%。由此可見，高脂飲食通過減少腸道菌群群落中的獨(dú)有物種數(shù)目以降低小鼠腸道菌群的物種豐富度。與紅曲米相比，富硒紅曲米通過增加高脂飲食小鼠腸道菌群的獨(dú)有物種數(shù)目以提高腸道菌群的物種豐富度。

2.4 富硒紅曲米對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響

基于門水平上，各組小鼠腸道菌群組成基本相同，如圖5所示，按相對(duì)豐度大小排在前四位的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrumcomicrobiota）、變形菌門（Proteobicteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）。在CD組小鼠腸道菌群中，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidota作為主要的優(yōu)勢(shì)菌門，兩者的相對(duì)豐度之和達(dá)到70%以上。與CD組相比，HFD組小鼠腸道中Firmicutes和Bacteroidota豐度明顯改變，其中Firmicutes由30.84%增至80.09%，Bacteroidota由40.21%下降至3.91%，F(xiàn)irmicutes/Bacteroidota的比值顯著上升。與 HFD組相比，各膳食干預(yù)組的Bacteroidota豐度無明顯變化。Dong等[13]基于IlluminaHiSeq 16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)研究了紅曲米對(duì)高脂飲食小鼠腸道微生物群組成的影響，結(jié)果表明，在門水平上，紅曲米干預(yù)后，小鼠腸道中 Firmicutes豐度顯著降低，而 Bacteroidota豐度的變化無顯著差異，這與本研究結(jié)果一致。以上研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生顯著影響。

與高脂飲食組相比，富硒紅曲米各劑量組和紅曲米組的Firmicutes豐度均降低，Verrumcomicrobiota豐度均增加。對(duì)各處理組 Firmicutes和Verrumcomicrobiota豐度變化進(jìn)行顯著性差異分析，如圖6所示。與HFD組相比，HFD-RYR和HFD-HSRYR組的Firmicutes豐度分別顯著減少了24.84%、39.26%（p＜0.05），而Verrumcomicrobiota豐度分別顯著增加了 22.56%、36.09%（p＜0.05）。HFD-LSRYR 和HFD-MSRYR組無顯著差異（p＞0.05），可能是由于干預(yù)周期過短，富硒紅曲米對(duì)高脂飲食小鼠腸道Firmicutes和 Verrumcomicrobiota的調(diào)節(jié)作用尚未凸顯。與HFD-RYR組相比，HFD-HSRYR組的Firmicutes顯著減少了26.10%（p＜0.05），Verrumcomicrobiota顯著增加了46.59%（p＜0.05）。Firmicutes相對(duì)豐度的增加會(huì)促進(jìn)機(jī)體吸收熱量、儲(chǔ)存脂肪[33，34]，這可能是誘導(dǎo)小鼠肥胖和血脂升高的原因之一。Verrucomicrobia相對(duì)豐度的減少會(huì)抑制機(jī)體的新陳代謝，誘導(dǎo)脂肪積累和血脂水平升高[34]。

結(jié)果表明，紅曲米和富硒紅曲米均有助于高脂飲食小鼠腸道中的 Verrumcomicrobiota增加，而對(duì)Firmicutes具有抑制作用。值得注意的是，與紅曲米相比，富硒紅曲米在改善高脂飲食小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成方面具有更顯著的效果。

在屬水平上，各組小鼠腸道菌群的組成分布如圖7所示。CD組小鼠腸道中相對(duì)豐度較高的菌屬包括Akkermansia、Bifidobacterium、Lactobacillus等，HFD組小鼠腸道中優(yōu)勢(shì)菌屬為Akkermansia、Romboutsia、Escherichia-Shigella等。已有研究證實(shí)，Bifidobacterium和Lactobacillus等腸道有益菌屬通過增強(qiáng)腸道屏障預(yù)防病原菌的感染，維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[35]。Escherichia-Shigella常見于能量代謝紊亂的動(dòng)物或人群的腸道環(huán)境中，與細(xì)菌性痢疾具有一定的關(guān)聯(lián)[36]。結(jié)果表明，高脂飲食會(huì)降低Bifidobacterium、Lactobacillus等有益菌屬豐度，增加Escherichia-Shigella有害微生物，從而誘導(dǎo)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂。

與高脂飲食組相比，富硒紅曲米各劑量組和紅曲米組的Akkermansia豐度均上升。對(duì)各處理組Akkermansia豐度變化進(jìn)行顯著性差異分析，如圖8所示。較HFD組相比，HFD-RYR、HFD-MSRYR和HFD-HSRYR組的Akkermansia豐度分別顯著增加了23.92%、31.57%、36.93%（p＜0.05），HFD-LSRYR組無顯著差異（p＞0.05），可能是由于劑量過小，富硒紅曲米促進(jìn)高脂飲食小鼠腸道Akkermansia的生長(zhǎng)作用尚未凸顯。與HFD-RYR組相比，HFD-HSRYR組的Akkermansia顯著增加了44.01%（p＜0.05）。Cicero等[37]發(fā)現(xiàn)膳食中補(bǔ)充紅曲米后，高脂大鼠的腸道Akkermansia菌屬顯著上升，這與本研究結(jié)果一致。綜合上述研究結(jié)果，表明富硒紅曲米可通過提高Akkermansia菌屬的相對(duì)豐度以改善高脂飲食小鼠腸道菌群的組成。

2.5 血脂指標(biāo)與腸道菌群關(guān)聯(lián)分析

采用相關(guān)性系數(shù) Spearman評(píng)估小鼠的腸道微生物與血脂水平之間的關(guān)聯(lián)性（藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)，紅色代表正相關(guān)）?；陂T水平上的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果如圖9所示，F(xiàn)irmicutes與TG呈極顯著性負(fù)相關(guān)（p＜0.01），與 LDL-C 呈 極 顯 著 性 正 相 關(guān) （p＜0.01）；Verrumcomicrobiota與 HDL-C呈顯著性正相關(guān)（p＜0.05），與LDL-C 呈極顯著性負(fù)相關(guān)（p＜0.01）；Proteobicteria與 TC 呈顯著性正相關(guān)（p＜0.05），與HDL-C呈極顯著性負(fù)相關(guān)（p＜0.01）；Bacteroidota與TG、TC和LDL-C呈負(fù)相關(guān)，但無顯著差異（p＞0.05）。

基于屬水平上的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果如圖10所示，Escherichia-Shigella與 HDL-C呈極顯著性負(fù)相關(guān)（p＜0.01）；Bifidobacterium與 HDL-C呈顯著性正相關(guān)（p＜0.05），與LDL-C呈極顯著性負(fù)相關(guān)（p＜0.01）；Akkermansia與HDL-C呈顯著性正相關(guān)（p＜0.05），與LDL-C呈極顯著性負(fù)相關(guān)（p＜0.001）?；诟咄繙y(cè)序和代謝組學(xué)技術(shù)，Cicero等[27]發(fā)現(xiàn)膳食中補(bǔ)充紅曲米后，高脂大鼠的腸道中所增加的Akkermansia菌屬與血脂和肝脂質(zhì)指標(biāo)呈顯著性負(fù)相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。

聯(lián)系各組小鼠基于門水平和屬水平上的腸道菌群豐度變化可知，高脂飲食可通過增加Firmicutes誘導(dǎo)小鼠血脂水平上升，富硒紅曲米通過減少 Firmicutes并增加Verrumcomicrobiota和Akkermansia改善高脂飲食小鼠的脂代謝。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，富硒紅曲米對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的血脂水平上升具有顯著的抑制作用，其效果優(yōu)于紅曲米，具體表現(xiàn)為降低血清LDL-C含量。此外，富硒紅曲米可顯著增加高脂飲食小鼠腸道菌群的物種多樣性，并通過顯著降低Firmicutes（與血脂水平呈正相關(guān)）含量、增加Verrumcomicrobiota和Akkermansia（與血脂水平呈負(fù)相關(guān)）含量抑制高脂飲食誘導(dǎo)的血脂水平上升，改善脂代謝紊亂癥狀。綜上，富硒紅曲米具備紅曲米和有機(jī)硒的雙重功能，發(fā)揮的作用大于兩者，具有較好的體內(nèi)降血脂作用，該結(jié)論為富硒紅曲米作為降脂功能性保健食品的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。然而，富硒紅曲米中硒的釋放路徑以及硒增強(qiáng)降血脂活性的分子機(jī)制還有待后續(xù)深入探究。