蔣麗，盧悅，買迪娜木·阿布力米提，商雪珂，許賀志祥，楊曉君，3*

（1.國(guó)藥集團(tuán)新疆新特藥業(yè)有限公司，新疆 烏魯木齊 830000）（2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）（3.新疆果品采后科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052）

山杏仁（Semen armeniacaeAmanrum）又名苦杏仁，是薔薇科杏屬植物，廣泛分布在世界各地，在我國(guó)主要產(chǎn)于遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、新疆等干旱和半干旱地區(qū)，資源豐富[1，2]。野山杏在新疆的伊犁和哈密地區(qū)分布廣泛，且因山杏樹耐寒、耐旱、耐貧瘠且適應(yīng)性強(qiáng)，具有良好的防風(fēng)固沙作用，加之國(guó)家政策的大力支持，使得山杏樹在新疆的栽培面積不斷擴(kuò)大。杏仁是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，不僅具有治風(fēng)寒、定喘潤(rùn)肺、止咳祛痰等藥效作用[3]，還具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種藥食兼用的材料，杏仁中含有油脂、蛋白質(zhì)、糖類、粗纖維以及維生素E等多種維生素。

目前我國(guó)對(duì)山杏的研究主要集中在果肉以及杏仁油上，隨著杏仁油加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生了大量杏仁粕，杏仁粕中含有約34%的果仁粗蛋白[4]，伊吾縣野山杏中杏仁粕蛋白可達(dá)47.8%，而杏仁粕僅作為動(dòng)物飼料處理，造成資源的浪費(fèi)，因此開發(fā)利用新疆野山杏特色資源具有十分重要的意義[5-7]。

近年來，食物蛋白質(zhì)酶解物中的水解產(chǎn)物被稱為食源性生物活性肽，生物活性肽（Bioactive peptides）是一種特殊的蛋白質(zhì)片段，與蛋白質(zhì)相比，生物活性肽不僅易于吸收，而且具有廣泛的生物活性[8，9]，例如：提高抗氧化性、降血壓、降血脂、抗血栓、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等作用受到廣泛關(guān)注[10-12]。其中抗氧化肽是重要的生物活性肽之一，按來源可分為天然抗氧化肽、蛋白降解抗氧化肽和人工合成抗氧化肽三種，其中以蛋白降解多肽為主，主要從動(dòng)植物中提取蛋白而得。研究表明，抗氧化肽可以預(yù)防與癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化等眾多退行性疾病相關(guān)的氧化應(yīng)激[13]。與其他制備方法相比，酶解法因價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)溫和，可保護(hù)產(chǎn)物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)廣泛使用[14]。

本研究以野山杏仁作為原料，在磁力攪拌方式下采用酶解法從杏仁中提取杏仁多肽，確定最佳提取條件，通過單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)確定木瓜蛋白酶酶解的最優(yōu)工藝指標(biāo)，同時(shí)針對(duì)野山杏多肽的體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行研究，探討伊吾縣野山杏多肽的體內(nèi)抗氧化作用，為伊吾縣野山杏多肽的生物活性機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料

新疆伊吾縣野山杏仁，由新疆伊吾天葦生物科技公司提供。

1.1.2 儀器設(shè)備和試劑

1.1.2.1 主要試劑

鹽酸（分析純），南京建成生物工程研究所；氨基酸水解分析標(biāo)準(zhǔn)樣品，德國(guó)塞卡姆Sykam；三羥甲基氨基甲烷（分析純），Gentihold；甲醛溶液（分析純），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；雙蒸水（自制）；丙二醛（MDA）測(cè)試盒，南京建成生物試劑研究所；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒，南京建成生物試劑研究所；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒，南京建成生物試劑研究所；抗壞血酸，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶，北京奧博星生物有限公司。

1.1.2.2 主要儀器

XMT-DA數(shù)顯恒溫水浴鍋，余姚市亞星儀器儀表有限公司；80-2離心沉淀器，金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-2C型精密酸度計(jì)，上海大普儀器有限公司；85-2控溫磁力攪拌器，江蘇金怡儀器科技有限公司；S-433D全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)塞卡姆 Sykam；X-Mark酶標(biāo)儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司；Neofuge 13R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，力康生物科技有限控股公司；XHF-DY高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野山杏多肽的提取工藝優(yōu)化

1.2.1.1 野山杏處理方法

野山杏仁置于燒杯中，在 60 ℃的水浴中浸泡10～20 min，即可去皮，外皮自然陰干保存，去皮后的杏仁于60 ℃干燥箱烘干2～4 h，將烘干的野山杏仁粉碎過60目篩，經(jīng)正己烷回流2 h后取沉淀，為杏仁粕，將脫油后的杏仁粕于45 ℃鼓風(fēng)干燥2 h，粉碎過80目篩，即為酶解粕原料。

1.2.1.2 粗蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（以氮計(jì)）（1.0 g/L）：稱取105 ℃干燥2 h的硫酸銨0.4720 g，加水溶解后轉(zhuǎn)于100 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，混勻，此溶液每毫升相當(dāng)于1.0 mg氮。

氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（0.1 g/L）：用移液管吸取10.00 mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加水定容至刻度，混勻，此溶液每毫升相當(dāng)于0.1 mg氮。

粗蛋白按GB 5009.5-2016分光光度法測(cè)定[15]，吸取0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，分別置于10 mL比色管中，加4.0 mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4.0 mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫后，移入1 cm比色杯內(nèi)，以零管為參比，波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點(diǎn)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算線性回歸方程。

以氨氮標(biāo)準(zhǔn)液濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值 A為縱坐標(biāo)，線性擬合，線性回歸方程為：A=0.9899C-0.0567（r=0.9980），在 0.00～1.00 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，故可以用此方法來快速檢測(cè)提取溶液中蛋白質(zhì)的含量。粗蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

1.2.1.3 木瓜蛋白酶水解條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)前期試驗(yàn)證明，野山杏多肽在磁力攪拌酶解方式下利用木瓜蛋白酶水解度最高，多肽水解度為：35.02%[16]。因此在磁力攪拌酶解方式下考察酶底物比、料液比、酶解時(shí)間、pH值和酶解溫度對(duì)野山杏多肽水解度的影響。

（1）酶底物比對(duì)野山杏多肽水解度的影響

設(shè)定酶底物比分別為1%、2%、3%、4%、5%，料液比1:20，pH為7.0，反應(yīng)溫度為60 ℃條件下，酶解120 min。

（2）料液比對(duì)野山杏多肽水解度的影響

根據(jù)（1）篩選出的酶底物比，料液比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，pH為7.0，反應(yīng)溫度為60 ℃條件下，酶解120 min。

（3）酶解時(shí)間對(duì)野山杏多肽水解度的影響

根據(jù)1篩選出的酶底物比，（2）篩選出的料液比，pH為7.0，反應(yīng)溫度為60 ℃條件下，將酶解時(shí)間分別設(shè)定為30、60、120、180、240 min。

（4）pH值對(duì)野山杏多肽水解度的影響

根據(jù)（1）篩選出的酶底物比，（2）篩選出的料液比（3）篩選出的酶解時(shí)間，設(shè)定pH值為4、5、6、7、8，反應(yīng)溫度為60 ℃條件下進(jìn)行酶解。

（5）酶解溫度對(duì)野山杏多肽水解度的影響

根據(jù)（1）篩選出的酶底物比，（2）篩選出的料液比，（3）篩選出的酶解時(shí)間，（4）篩選出的 pH值，設(shè)定反應(yīng)溫度分別為 50、55、60、65、70 ℃條件下進(jìn)行酶解。

1.2.1.4 木瓜蛋白酶水解條件的優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶底物比、時(shí)間、pH值和酶解溫度為試驗(yàn)因素，以多肽水解度為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。

1.2.1.5 野山杏仁粕水解度（DH）的測(cè)定

利用甲醛滴定法測(cè)定酶解液中的氨基氮[17]。原理：甲醛與氨基酸中的氨基作用，可消除其堿性，使羥基顯示出酸性，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以酸度計(jì)指示終點(diǎn)，即可對(duì)氨基酸進(jìn)行定量[18]。

吸取5 mL上清液，置于200 mL燒杯中，加入45 mL蒸餾水，用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH為8.2，記錄使用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；再加入10 mL甲醛溶液并混勻，繼續(xù)用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH為9.2，記錄使用體積，同時(shí)做空白試驗(yàn)。

（1）氨基酸態(tài)氮計(jì)算公式[19]

（2）總氮量測(cè)定計(jì)算公式

采用凱氏定氮法[20]測(cè)定：

（3）水解度公式[21]

1.2.1.6 野山杏多肽得率計(jì)算

1.2.2 野山杏多肽對(duì)衰老模型小鼠的抗氧化作用

1.2.2.1 試驗(yàn)原料的制備

野山杏多肽為1.2.1.3中優(yōu)化試驗(yàn)后木瓜蛋白酶磁力加熱攪拌所得野山杏仁酶解液，經(jīng)過冷凍干燥得野山杏多肽粉，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼料

健康昆明種S級(jí)小鼠，雄性，體重18±4 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK[新]2017-0004）。滅菌全價(jià)顆粒飼料，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2.2.3 分組與造模

選取健康的雄性小鼠72只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為六組，每組12只。選取五組小鼠以D-半乳糖100 mg/kg·bw·d頸后皮下注射，每天一次，連續(xù)30 d，制備衰老模型。五組分別為：野山杏多肽低劑量組（后文簡(jiǎn)稱低劑量組）、野山杏多肽中劑量組（后文簡(jiǎn)稱中劑量組）、野山杏多肽高劑量組（后文簡(jiǎn)稱高劑量組）、衰老模型組（后文簡(jiǎn)稱模型組）、Vc陽性對(duì)照組（后文簡(jiǎn)稱陽性對(duì)照組），另取一組為空白對(duì)照組。同時(shí)進(jìn)行野山杏多肽按低、中、高劑量每天一次灌胃給藥，陽性對(duì)照組灌胃給予Vc，空白對(duì)照組和模型組用等劑量生理鹽水代替。持續(xù)喂養(yǎng)30 d，試驗(yàn)過程中小鼠每周稱取體重1次調(diào)整給予劑量，自由進(jìn)食，進(jìn)水。末次給藥后禁食24 h，不禁水，處死前稱量體重。

1.2.2.4 劑量設(shè)計(jì)

在體外抗氧化的基礎(chǔ)上，以體外抗氧化清除自由基能力最佳劑量結(jié)合文獻(xiàn)資料，設(shè)置高、中、低劑量進(jìn)行體內(nèi)抗氧化預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的實(shí)驗(yàn)劑量分別為50、75、100 mg/kg，詳見表1所示。

表1 各組給藥劑量Table 1 Dosage of each group

1.2.2.5 樣品制備

各組小鼠眼眶取血，4 ℃條件下3000 r/min離心15 min，取上清（即血清）備用。小鼠取血后脫臼處死，快速取出肝組織及腦組織，0 ℃～2 ℃生理鹽水洗去淤血。精密稱取肝組織0.5 g，加入0 ℃生理鹽水4.5 mL，迅速研磨制成組織勻漿，4 ℃條件下4000 r/min離心10 min，取上清，備用。

1.2.3 MDA、T-SOD及GSH-Px含量測(cè)定

1.2.3.1 腦組織、肝組織蛋白測(cè)定[22]

取腦組織、肝組織勻漿上清用生理鹽水稀釋，取樣50 μL測(cè)定。混勻，將配置好的溶液靜置10 min，于595 nm波長(zhǎng)，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值。計(jì)算方法見公式（5）。

1.2.3.2 MDA含量測(cè)定[23]

（1）小鼠血清MDA測(cè)定：直接取血清0.05 mL進(jìn)行測(cè)定。將配置好的混勻，塑料薄膜封口，剌一小孔，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻，3500 r/min，離心10 min，取上清，于532 nm處，1 cm光徑4 mm內(nèi)徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。計(jì)算方法見公式（6）。

（2）小鼠肝組織、腦組織MDA測(cè)定：取上清組織勻漿待測(cè)，將配置好的試劑旋渦混勻器混勻，用保鮮薄膜封口，刺一小孔，沸水浴40 min，取出后流水冷卻，然后3500 r/min，離心10 min，取上清，于532 nm處，1 cm光徑4 mm內(nèi)徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。計(jì)算方法為見公式（7）。

1.2.3.3 T-SOD含量測(cè)定[24]

（1）小鼠血清T-SOD測(cè)定：將小鼠血清稀釋2倍，取50 μL測(cè)定。將溶液混勻，室溫靜置10 min，550 nm，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。計(jì)算方法見公式（8）。

（2）小鼠肝組織、腦組織T-SOD測(cè)定：取腦組織、肝組織勻漿上清用生理鹽水稀釋，取樣50 μL測(cè)定。將試劑混勻，室溫放置10 min，于波長(zhǎng)550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。計(jì)算方法見公式（9）。

1.2.3.4 GSH-Px含量測(cè)定[25]

（1）小鼠血清GSH-Px測(cè)定：將小鼠血清2倍稀釋，取100 μL測(cè)定。將各試劑與待測(cè)樣品混勻，4000 r/min，離心10 min，取酶促反應(yīng)上清液1 mL，將試劑與待測(cè)樣品溶混勻，15 min后，412 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。計(jì)算方法見公式（10）。

（2）小鼠肝組織、腦組織GSH-Px測(cè)定：取腦組織、肝組織勻漿上清取樣200μL測(cè)定。操作同小鼠血清GSH-Px測(cè)定。計(jì)算方法見公式（11）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 2018軟件進(jìn)行圖形繪制，SPSS 24.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解法提取野山杏多肽的單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶底物比對(duì)野山杏多肽水解度的影響

當(dāng)酶底物比分別為1%、2%、3%、4%、5%，料液比1:20，pH為7.0，60 ℃酶解120 min時(shí)，水解度見圖2。

由圖2可知，水解度隨酶底物比的增加而上升，酶底物比為3%時(shí)野山杏仁水解度為29.23%；當(dāng)酶底物比大于 3%時(shí)，水解度趨于平穩(wěn)，根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)原理，酶的用量過少不利于水解，過多不僅水解效果差，還會(huì)造成一定程度上的資源浪費(fèi)[26]。因此，綜合考慮選擇酶底物比 3%作為野山杏多肽水解度最適酶底物比。

2.1.2 料液比對(duì)野山杏多肽水解度的影響

當(dāng)酶底物比為3%，料液比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，pH為7.0，60 ℃酶解120 min時(shí)，水解度見圖3。

由圖3可知，料液比對(duì)于水解度影響不大，野山杏多肽水解度在料液比為1:10時(shí)最低為21.66%，料液比1:25時(shí)水解度最大為27.07%，因此料液比為1:25時(shí)為最適料液比。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)野山杏多肽水解度的影響

當(dāng)酶底物比為3%，料液比為1:25，pH為7.0，60 ℃酶解30、60、120、180、240 min時(shí)，水解度見圖4。

由圖4可知，酶解時(shí)間對(duì)野山杏多肽水解度影響較大。酶解120 min時(shí)水解度最大為27.07%。水解時(shí)間180 min和240 min時(shí)，水解度降低。因此，水解時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以120 min為中點(diǎn)，取60、120、180 min做正交試驗(yàn)條件。

2.1.4 pH對(duì)野山杏多肽水解度的影響

當(dāng)酶底物比為3%，料液比為1:25，60 ℃酶解120 min時(shí)，設(shè)定pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0酶解，水解度見圖5。

由圖5可以看出，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，溶液呈酸性，野山杏多肽水解度為10.83%，為最低，可以看出酶解溶液呈酸性可抑制酶解，木瓜蛋白酶在酸性條件下可部分失活，酶解能力下降。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，為木瓜蛋白酶的酶解最適pH，水解度為25.99%。因此，正交試驗(yàn)選取pH為6.0、7.0、8.0三個(gè)梯度。

2.1.5 酶解溫度對(duì)野山杏多肽水解度的影響

當(dāng)酶底物比為3%，料液比為1:25，pH為7.0，酶解120 min時(shí)，不同溫度50、55、60、65、70 ℃條件下，水解度見圖6。

由圖6可以看出，55 ℃時(shí)野山杏多肽水解度亦最大，為24.90%。隨著溫度的升高，水解度下降，說明溫度越高，酶解能力越弱。由于溫度過高會(huì)使木瓜蛋白酶失活，酶解能力下降。由于木瓜蛋白酶在水解過程中，最適pH值溫度在55 ℃～65 ℃之間[27]，因此選用55、60、65 ℃為正交試驗(yàn)條件。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析的基礎(chǔ)上，對(duì)影響野山杏多肽水解度的四個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平表見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result and analysis of orthogonal experiment

從表2～表4正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，以野山杏多肽水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各個(gè)因素影響極差R大小的主次順序依次為：C＞D＞B＞A，即溫度＞pH值＞酶解時(shí)間＞酶底物比。因此，野山杏多肽提取最佳工藝組合為A2B2C3D3，即酶底物比為4%，酶解時(shí)間120 min，pH值為8.0，酶解溫度為65 ℃。

從方差分析表4可以看出，pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)野山杏多肽水解度影響差異極其顯著（p＜0.001），酶底物比對(duì)野山杏多肽水解度影響差異不顯著（p＞0.05）。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of analysis of variance

綜上所述，酶解法提取野山杏多肽的最佳工藝為酶底物比為4%，酶解時(shí)間120 min，pH值為8，酶解溫度為65 ℃。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取10 g野山杏仁粕放置于500 mL燒杯中，按1:25料液比加入250 mL去離子水，以酶底物比為4%加入木瓜蛋白酶，pH值為8，65 ℃水浴酶解120 min后，離心，分離上清液，測(cè)定多肽水解度。該試驗(yàn)過程平行進(jìn)行三組。

通過驗(yàn)證試驗(yàn)可以得知：在此工藝條件下野山杏多肽水解度為35.73%，多肽液經(jīng)過酸沉、洗脫、冷凍干燥，得白色粉末，得率為7.22%。

酶解法通常采用一種或多種蛋白酶，王琳等人[28]以杏仁粕為原料，通過脫脂和提取蛋白處理后，以木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶作為復(fù)合酶解制備杏仁肽，以水解度為指標(biāo)，最終杏仁蛋白水解度為23.60%；趙換霞等[29]通過響應(yīng)面分析法研究并優(yōu)化了扁杏仁抗氧化肽的酶解制備工藝，同時(shí)研究其體外抗氧化活性，以堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合酶制備的扁杏仁抗氧化活性肽水解度為 20.87%，本試驗(yàn)多肽水解度為35.73%，與上述文獻(xiàn)進(jìn)行比較，分別高出 12.13%和14.86%，由此可見本試驗(yàn)優(yōu)化后的多肽提取工藝較優(yōu)于對(duì)方。

2.4 野山杏多肽對(duì)衰老模型小鼠的抗氧化作用

2.4.1 試驗(yàn)前后小鼠的體重變化

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以（ˉX±SD）表示，采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

通過表5可以看出，各組小鼠試驗(yàn)前后體重差別不明顯（p＞0.05），各組間試驗(yàn)小鼠體重?zé)o顯著差異（p＞0.05）。模型組小鼠注射D-半乳糖，30 d后體重略有下降，其余各組小鼠體重稍微增加。

表5 試驗(yàn)中總體動(dòng)物體重變化Table 5 The overall animal body weight change in the experiment (ˉX±SD， n=12)

2.4.2 野山杏多肽對(duì)小鼠血清T-SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以（ˉX±SD）表示，采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較方差分析和t檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 野山杏多肽對(duì)小鼠血清T-SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響Table 6 Effects of Noama Kyoto polypeptide on T-SOD， GSH-Px activity and MDA content in serum of mice (ˉX±SD， n=10)

由表6可知，與空白對(duì)照組比，模型組小鼠血清T-SOD、GSH-Px活性極顯著下降（p＜0.001、p＜0.01），MDA含量極顯著升高（p＜0.001），表明衰老模型小鼠造模成功。

MDA是體內(nèi)含氧自由基與細(xì)胞膜表面脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化損傷程度[30]。GSH-Px可以催化還原型谷胱甘肽（GSH）過氧化氫反應(yīng)生成對(duì)機(jī)體無害的水和氧化型谷胱甘肽，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫和細(xì)胞損傷[31]。SOD幾乎存在于所有生物細(xì)胞中，能夠催化超氧化物轉(zhuǎn)化，T-SOD活力的高低代表著機(jī)體清除氧自由基的能力大小[32]。

與模型組比，陽性對(duì)照組及低、中、高劑量組小鼠血清中T-SOD、GSH-Px活性顯著升高（p＜0.01或p＜0.05 或p＜0.001），MDA活性均極顯著降低（p＜0.001或p＜0.01）。其中低劑量組GSH-Px活性達(dá)到271.99 U/mL，高劑量組T-SOD活力達(dá)到177.24 U/mL，與空白對(duì)照組結(jié)果相近；低、中、高劑量組小鼠T-SOD活性隨著野山杏多肽給藥量的增加而增加，具有劑量依賴性。說明不同劑量的野山杏多肽均能對(duì)小鼠血清中的MDA含量值以及T-SOD、GSH-Px活力產(chǎn)生顯著影響。

2.4.3 野山杏多肽對(duì)小鼠肝組織 T-SOD、GSH-Px活性、以及MDA含量的影響

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以（ˉX±SD）表示，采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較才有方差分析和t檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 野山杏多肽對(duì)小鼠肝組織T-SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響Table 7 Effects of apricot kernel polypeptide on T-SOD， GSH-Pxactivity and MDA content in liver tissues of mice (ˉX±SD， n=10)

由表7可知，與空白對(duì)照組比，模型組小鼠肝組織 T-SOD、GSH-Px活力極顯著下降（p＜0.001或p＜0.01），MDA 含量極顯著升高（p＜0.001）；與模型組相比，陽性對(duì)照組及各劑量組MDA含量不同程度的降低（p＜0.05或p＜0.001），T-SOD、GSH-Px活性均有不同程度的增加（p＜0.01或p＜0.05或p＜0.001），其中T-SOD活性隨著野山杏多肽劑量的增加而增加，具有劑量依賴性。說明不同劑量的野山杏多肽均能對(duì)小鼠肝組織中的 T-SOD、GSH-Px活性、以及MDA含量值產(chǎn)生影響。

2.4.4 野山杏多肽對(duì)小鼠腦組織 T-SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果以（ˉX±SD）表示，采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)如表8所示。

表8 野山杏多肽對(duì)小鼠腦組織T-SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響Table 8 Effect of Noama Kyoto polypeptide on T-SOD， GSH-Px activity and MDA content in the brain of mice (ˉX±SD， n=10)

由表8可知，與模型組相比，中、高劑量組均可顯著提高衰老小鼠腦組織中 T-SOD、GSH-Px活性（p＜0.01），降低MDA含量（p＜0.05或p＜0.01），其中高劑量組MDA含量為1.84 nmol/mL，與空白對(duì)照組腦組織中MDA含量接近，表明當(dāng)野山杏多肽給藥劑量為100 mg/kg，給藥周期30 d后，可使衰老模型小鼠腦組織中MDA含量顯著降低并基本恢復(fù)至造模前水平。與低劑量組相比，中、高劑量組T-SOD及MDA數(shù)據(jù)差異較大，中高劑量組明顯好于小劑量組，且數(shù)據(jù)更接近于陽性對(duì)照組。綜上，中、高劑量組野山杏多肽均能對(duì)小鼠肝組織中的T-SOD、GSH-Px活性以及MDA含量值產(chǎn)生顯著影響。

綜上所述，本試驗(yàn)通過野山杏多肽各劑量組研究其對(duì)衰老模型小鼠的體內(nèi)抗氧化作用，與模型組相比，各劑量組可以不同程度地增加小鼠體內(nèi) GSH-PX及T-SOD活力，降低MDA含量，其中以中、高劑量組效果較為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但野山杏多肽的不同劑量組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)并未呈現(xiàn)出完全一致的變化趨勢(shì)，可能是由于機(jī)體存在不同的抗氧化調(diào)節(jié)機(jī)制而導(dǎo)致的，其他研究也表明SOD和GSH-Px在某些狀態(tài)下呈現(xiàn)出一定范圍內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，而非絕對(duì)的同時(shí)增加，即當(dāng)其中一種機(jī)制被激活時(shí)，另一種會(huì)呈現(xiàn)出有所抑制的狀態(tài)[33]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過研究得到酶解法提取野山杏多肽的最佳工藝：酶底物比為4%，酶解時(shí)間120 min，pH值為8，酶解溫度為65 ℃。并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得知：在此工藝條件下野山杏多肽水解度為35.73%，多肽液經(jīng)過酸沉、洗脫、冷凍干燥，得白色粉末，得率為7.22%。通過上述工藝得到的野山杏多肽給予 D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老模型，發(fā)現(xiàn)中、高劑量的野山杏多肽皆能提高衰老小鼠血清、肝組織以及腦組織勻漿中的T-SOD、GSH-Px活性，同時(shí)降低MDA含量，抑制血清及組織中的脂質(zhì)過氧化。綜上所述，本試驗(yàn)優(yōu)化后提取的野山杏多肽對(duì)衰老小鼠具有良好的體內(nèi)抗氧化作用。