劉靈，王萌，宋自娟，單媛媛*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）（2.陜西華州醫(yī)藥生物工程有限公司，陜西 西安 710054）

大豆異黃酮是大豆自然生長過程中生成的一種與雌激素結(jié)構(gòu)相似的多酚類次生物，營養(yǎng)價(jià)值豐富，對機(jī)體蛋白質(zhì)代謝、激素合成、細(xì)胞生長等方面都能產(chǎn)生一定程度的影響[1]。大豆異黃酮具有抗氧化損傷[2，3]、抗炎[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]等作用，在食品、醫(yī)療、飼料等領(lǐng)域均有十分廣闊的研究及應(yīng)用前景[6]。例如，大豆異黃酮可用于改善心血管疾病[7]、骨質(zhì)疏松[8]、阿爾茲海默癥[9]，以及煩躁、失眠等婦女更年期綜合征[10]，還可以預(yù)防子宮內(nèi)膜癌[11]、乳腺癌[12]、肝癌[13]等癌癥的發(fā)生。此外，在快節(jié)奏的現(xiàn)代生活中，免疫力低下的亞健康人群逐漸增多，大豆異黃酮在提高機(jī)體免疫功能方面的活性也逐漸受到研究者的關(guān)注，已有文獻(xiàn)證明，大豆異黃酮可以促進(jìn)細(xì)胞因子、特異性抗原等免疫分子的釋放[14，15]，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性[16]，調(diào)節(jié)胸腺等免疫器官的功能[17]。

但是，作為一種多酚類化合物，大豆異黃酮對環(huán)境較為敏感，在光照、高溫等條件下極易發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)，從而喪失生物活性[18]。采用軟膠囊對多酚類物質(zhì)進(jìn)行包埋是提高其穩(wěn)定性和加工適用性的重要手段。本研究團(tuán)隊(duì)前期以明膠和甘油為主要壁材，對苷元型大豆異黃酮進(jìn)行了有效的包埋，制備了大豆異黃酮苷元復(fù)合軟膠囊。目前，有關(guān)大豆異黃酮的免疫性能評價(jià)已經(jīng)比較全面，但是關(guān)于膠囊化后的大豆異黃酮的研究更多集中在醫(yī)療功能上[19，20]，對于其是否保留了增強(qiáng)免疫力的能力尚不清楚。同時(shí)，袁根良等[21]、李力[22]等研究的大豆異黃酮復(fù)合膠囊雖已被證明無毒，但本研究所制備的大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊的有效成分及含量均有所不同，其潛在的安全性仍需進(jìn)行系統(tǒng)的試驗(yàn)分析。因此，本研究依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》[23]，對以大豆異黃酮、大豆油、蜂蠟為芯材，以明膠、甘油、純化水、焦糖色、二氧化鈦為壁材制備的大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊進(jìn)行系統(tǒng)的提高免疫功能研究及安全性評價(jià)，以期為大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊的合理安全應(yīng)用提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊，自制，其標(biāo)志性成分及含量為：大豆異黃酮2.20%、大豆苷0.55%、染料木苷0.70%、大豆苷元0.35%、染料木素0.60%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠和昆明種小鼠（200只雌性小鼠用于免疫功能評價(jià)試驗(yàn)，其余均用于安全性試驗(yàn)），由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(陜)2018-001，動(dòng)物飼料、墊料均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)動(dòng)物房為屏障系統(tǒng)，使用許可證號(hào)為 SYXK(陜)2018-009，溫度20～25 ℃，相對濕度45%～65%。

1.1.3 主要試劑

生化試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；血細(xì)胞分析試劑盒、環(huán)磷酰胺、敵克松、疊氮化鈉、1，8-二羥基蒽醌、2-氨基芴，上海一基實(shí)業(yè)有限公同；TA97、TA98、TA100、TA102四種菌株，上海北諾生物科技有限公司購自Molecular Toxicology公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫功能評價(jià)試驗(yàn)

（1）動(dòng)物分組與給藥

將 200只雌性小鼠隨機(jī)分為五大組，每大組 40只，每一大組再隨機(jī)分為4小組，每小組10只。第1大組用于ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、NK細(xì)胞活性測定；第2大組用于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）測定、淋巴器官/體重比值測定；第3大組用于抗體生成細(xì)胞（PFC）檢測、血清溶血素測定；第4大組用于碳廓清試驗(yàn)；第5大組用于腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。設(shè)置1000、670、340 mg/kg·bw三個(gè)高、中、低劑量組，分別相當(dāng)于人體推薦用量的30、20、10倍。大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊各所需濃度均用大豆油進(jìn)行配置，受試鼠每日經(jīng)口灌胃一次，連續(xù)30 d，陰性對照組給予等量大豆油。試驗(yàn)完成后稱重并處死小鼠，取出胸腺和脾臟，稱重并計(jì)算臟器/體重比。

（2）細(xì)胞免疫試驗(yàn)

DTH測定：于第26 d，先后用0.2 mL、20 μL 2%（V/V）SRBC間隔4 d對小鼠進(jìn)行致敏和攻擊。于攻擊前、后24 h分別測量每只動(dòng)物左后足跖部位厚度，每個(gè)部位測三次，計(jì)算足跖厚度差值。

ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）：取出脾臟，研磨、洗滌，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106cells/mL，參照劉穎芬等[24]的試驗(yàn)方法將其加入24孔培養(yǎng)板中，之后將其置于37 ℃孵育箱（5% CO2）中孵育72 h，于第68 h時(shí)，從每孔中吸出上清液0.7 mL，隨即加入與吸出上清液同體積的RPMI1640培養(yǎng)液和50 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)孵育至結(jié)束，每孔加入1 mL酸性(CH3)2CHOH，溶解混勻，在570 nm波長下測定光密度值。

（3）體液免疫實(shí)驗(yàn)

PFC檢測：將0.2 mL 2%（V/V）的SRBC注射進(jìn)每只小鼠的腹腔內(nèi)，免疫4 d后處死取脾，研磨、洗滌，同小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中的方法調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。參照劉穎芬等[24]的PFC檢測方法處理細(xì)胞液，最后取得溶血空斑數(shù)數(shù)值。

血清溶血素的測定：第26 d，四天的免疫方法同PFC檢測中所用的方法，之后摘眼球取血，分離血清并倍比稀釋，將100 μL不同稀釋度的血清、100 μL 0.5%（V/V）的SRBC懸液先后置于微量血凝板的每孔內(nèi)，充分混合均勻，置于平盤內(nèi)，放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 h后進(jìn)行血清溶血素的測定。

（4）單核-巨噬細(xì)胞功能測定

小鼠碳廓清試驗(yàn)：給各組受試動(dòng)物尾靜脈注射印度墨汁10 mL/kg·bw，分別于第2、10 min采取20 μL靜脈血，隨后將其與2 mL 0.1% NaHCO3溶液充分混合均勻，空白對照組采用NaHCO3溶液。設(shè)置紫外分光光度計(jì)波長為600 nm，測定并記錄光密度值（OD），將處死小鼠后所取的肝臟和脾臟別稱重，按照公式計(jì)算吞噬指數(shù)。

式中：

OD1——血樣在2 min時(shí)測定的光密度；

OD2——血樣在10 min時(shí)測定的光密度。

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)：每只小鼠腹腔注射1 mL 20%（V/V）雞紅細(xì)胞懸液，間隔30 min處死，腹腔注射 2 mL生理鹽水。吸腹腔洗液涂片，37 ℃下培養(yǎng)30 min，固定，Giemsa染色。記錄100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)和巨噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)及其被消化的程度。

（5）NK細(xì)胞活性測定

按照劉穎芬等[24]的研究中的NK細(xì)胞活性測定方法進(jìn)行測定大部分處理，最后在490 nm處測定光密度值（OD）。NK細(xì)胞活性計(jì)算公式如下：

1.2.2 安全性評價(jià)試驗(yàn)

（1）大鼠急性毒性試驗(yàn)

參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技技規(guī)范》的試驗(yàn)方法[23]。取雌雄各半的SD大鼠20只，以最大耐受劑量（MTD）19.76 g/kg·bw（相當(dāng)于人體推薦量的 593.4倍）的劑量經(jīng)口灌胃，記錄14 d內(nèi)受試大鼠出現(xiàn)的的表現(xiàn)、行為異常等中毒癥狀和死亡情況，分別在1 d、7 d、14 d給受試動(dòng)物稱重，隨后處死動(dòng)物并進(jìn)行大致解剖，觀察肝、腎、脾、心、肺等臟器的變化情況。

（2）遺傳毒性試驗(yàn)

Ames試驗(yàn)：采用平板摻入法，體外代謝活化系統(tǒng)選用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶（S-9），菌株為 TA97、TA98、TA100、TA102四種，大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊試驗(yàn)時(shí)用 DMSO配制成所需濃度。設(shè)置5000、1000、200、40、8 μg/皿五個(gè)劑量組，另外設(shè)置溶劑對照組（DMSO）、自發(fā)回變組、陽性對照組。計(jì)數(shù)回變菌落數(shù)。

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)：采用30 h給樣品法，設(shè)置10.0、5.0、2.5 g/kg·bw三個(gè)劑量組，另設(shè)溶劑對照組（大豆油）及環(huán)磷酰胺陽性對照組（CP，40 mg/kg·bw）。經(jīng)口灌胃，第一次灌胃24 h后再次給樣，6 h后處死動(dòng)物并取股骨骨髓制片。每只動(dòng)物統(tǒng)計(jì)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE）中的微核細(xì)胞數(shù)，計(jì)算干分率，計(jì)數(shù) 200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞/成熟紅細(xì)胞（PCE/NCE）的值。

小鼠精子畸形試驗(yàn)：設(shè)置10.0、5.0、2.5 g/kg·bw三個(gè)劑量組，另設(shè)溶劑對照組及CP（40 mg/kg·bw）陽性對照組，連續(xù)經(jīng)口灌胃5 d，每日一次，對照組給樣等量大豆油。初次灌胃35 d后，處死小鼠并取雙側(cè)附睪制片，記錄1000條完整精子的畸形數(shù)、畸形類型，計(jì)算畸形率。

（3）常規(guī)臨床指標(biāo)測定

設(shè)3.33、1.67、0.84 g/kg·bw（分別相當(dāng)于人體推薦用量100、50、25倍）三個(gè)劑量組，另設(shè)溶劑對照組。連續(xù)灌胃30 d，每日觀察動(dòng)物的生長發(fā)育狀況，注重觀察中毒癥狀，每周稱量一次受試鼠體重和記錄一次二次食物攝入量。試驗(yàn)?zāi)┢?，將大鼠禁?6 h，空腹稱重后采血并處死，測定血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)，解剖動(dòng)物觀察內(nèi)臟，稱肝、腎、脾、睪丸（卵巢）濕重值并做組織病理學(xué)檢查，計(jì)算臟器/體重比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定

免疫力評價(jià)實(shí)驗(yàn)均采用方差分析，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)，小鼠精子畸形試驗(yàn)釆用秩和檢驗(yàn)。依據(jù)文獻(xiàn)[23]中的標(biāo)準(zhǔn)判斷，細(xì)胞免疫功能檢測、體液免疫功能檢測、單核-巨噬細(xì)胞功能檢測、NK細(xì)胞活性檢測4個(gè)方面任何2個(gè)方面的結(jié)果為陽性，即可判定該受試樣品能夠增強(qiáng)免疫力。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對小鼠免疫功能的影響

2.1.1 大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對小鼠體重和臟器比值的影響

胸腺和脾臟在機(jī)體免疫中貢獻(xiàn)了免疫場所和免疫細(xì)胞，發(fā)揮了十分重要的免疫作用，免疫學(xué)中常用其重量變化來評價(jià)受試物對動(dòng)物免疫功能造成的影響[16，25]。大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對小鼠體重和臟器比值的影響如表1所示，各劑量組的小鼠各時(shí)期體重及增重與陰性對照組相比，差異不顯著（p＞0.05），各劑量組與陰性對照組的小鼠臟器/體重比值維持在同一水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。表明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對小鼠體重、臟器/體重比值無顯著影響，不能通過增加免疫器官重量來增強(qiáng)免疫力。

表1 受試物對小鼠體重的影響Table 1 Effect of test substance on body weight of mice (±s)

表1 受試物對小鼠體重的影響Table 1 Effect of test substance on body weight of mice (±s)

注：與陰性對照組比較p＞0.05。表2同。

組別 劑量/(g/kg·bw) 動(dòng)物數(shù)/只 初始重/g 中期重/g 末期重/g 增重/g 胸腺/體重(×10-3) p 值 脾臟/體重(×10-3) p 值高劑量 1.00 10 19.90±1.40 26.20±2.00 34.00+2.40 14.10±2.60 2.40±0.50 0.91 3.88±0.60 0.38中劑量 0.67 10 19.40±1.30 27.90±2.10 34.20±2.70 14.80±2.80 2.15±0.52 0.88 3.61±0.46 1.00低劑量 0.34 10 19.40±1.10 27.90±2.20 34.50±3.40 15.10±3.30 2.24±0.36 1.00 3.51±0.32 0.93陰性對照 - 10 20.00±1.60 27.50±2.10 34.90±2.70 14.90±3.00 2.28±0.52 - 3.60±0.37 -

2.1.2 大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對細(xì)胞免疫和體液免疫功能影響

以DTH和ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力試驗(yàn)為指標(biāo)，評價(jià)大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對細(xì)胞免疫功能的影響；以PFC和血清溶血素水平為指標(biāo)評估大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對體液免疫功能的影響，結(jié)果如圖1所示。如圖1a所示，高劑量組SRBC誘導(dǎo)DTH左后足跖厚度差為0.79 mm，相對于對照組，提升了34.87%，提升效果顯著（p＜0.05）。如圖1b所示，高劑量組的淋巴細(xì)胞增殖 OD差達(dá)到 0.17，相對于對照組，增長了36.07%，增長效果顯著（p＜0.05）。說明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊可以顯著誘發(fā)DTH、提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能，結(jié)果與郭智慧[16]的研究結(jié)果一致。如圖1c所示，與陰性對照組相比，高劑量組溶血空斑數(shù)顯著增長（p＜0.05），增長效果為 15.85%。如圖1d所示，相對于陰性對照組，中劑量組小鼠的血清溶血素水平有顯著提升（p＜0.05），高劑量組有極顯著提升（p＜0.01），提升效果分別為9.98%、12.66%。表明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊能顯著增加小鼠PFC數(shù)量、提高小鼠血清溶血素水平，增強(qiáng)小鼠體液免疫功能。

2.1.3 大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性的影響

碳廓清試驗(yàn)、受試物腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)和NK細(xì)胞活性試驗(yàn)的結(jié)果如表2所示。巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞均是非特異性免疫細(xì)胞，前者主要發(fā)揮吞噬作用，后者直接殺傷靶細(xì)胞，因此前者的吞噬能力及后者的活性可以評價(jià)機(jī)體的免疫功能[16，26，27]。由表2可見，相較于與陰性對照組，各劑量組小鼠的吞噬指數(shù)、雞紅細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)有一定程度的提升，但提升效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。說明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊不能顯著提高小鼠的碳廓清能力，無法增強(qiáng)小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能。各劑量組小鼠 NK細(xì)胞活性與陰性對照組相比較，均無顯著差異（p＞0.05）。表明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊不能顯著提高小鼠NK細(xì)胞活性。

表2 受試物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞活性的影響Table 2 Effect of test substance on phagocytosis and NK cell activity of peritoneal macrophages in mice (±s)

表2 受試物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞活性的影響Table 2 Effect of test substance on phagocytosis and NK cell activity of peritoneal macrophages in mice (±s)

組別 劑量/(g/kg·bw) 吞噬指數(shù)a p值 吞噬百率/% p值 吞噬指數(shù)b p值 NK細(xì)胞活性/% p值高劑量 1.00 5.60±1.02 0.56 34.10±6.20 0.70 0.82±0.08 0.59 30.49±7.61 0.86中劑量 0.67 5.48±1.11 0.76 33.80±5.30 0.78 0.82±0.70 0.53 30.30±5.98 0.90低劑量 0.34 5.29±0.95 0.97 33.70±3.80 0.81 0.80±0.07 0.84 30.80±6.61 0.80陰性對照 - 5.15±0.52 - 32.00±5.20 - 0.78±0.07 - 28.62±5.87 -

2.2 大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊安全性評價(jià)結(jié)果

2.2.1 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。以19.76 g/kg·bw的劑量經(jīng)口灌胃，14 d內(nèi)，雌、雄大鼠體重均有所增長，未觀察到急性中毒癥狀及死亡現(xiàn)象。解剖后，觀察到小鼠肝、腎、脾、心、肺、胃、腸等主要臟器的均呈正常狀態(tài)。表明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對大鼠急性毒性（MTD）大于19.76 g/kg·bw，參照急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，急性毒性屬于無毒性等級(jí)。

表3 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of acute toxicity test in rats (±s)

表3 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of acute toxicity test in rats (±s)

性別 動(dòng)物數(shù)/只 劑量(MTD)/(g/kg·bw) 初始體重/g 第7 d體重/g 第14 d體重/g 出現(xiàn)中毒癥狀動(dòng)物數(shù)/只 死亡數(shù)/只雌性 10 19.76 195.90±10.60 227.10±12.70 247.70±13.50 0 0雄性 10 19.76 199.20±10.80 242.10±13.90 272.70±15.00 0 0

2.2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

Ames試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊各劑量組在有、無S-9存在的條件下，回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的兩倍，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系，表明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊不會(huì)誘發(fā)菌株突變。

表4 Ames試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of Ames test (±s)

表4 Ames試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of Ames test (±s)

注：以上結(jié)果為3個(gè)平皿的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

劑量/(μg/皿) TA97 TA98-S-9 +S-9 -S-9 +S-9 5000 138.00±7.90 135.00±11.40 34.30±2.10 32.00±1.70 1000 134.30±10.10 135.00±9.80 36.70±2.50 35.30±1.50 200 137.70±9.00 137.70±11.20 35.00±3.60 36.30±1.50 40 137.00±10.80 135.00±8.00 35.30±3.50 34.70±2.50 8 139.30±8.60 135.30±9.00 34.30±2.50 36.00±3.00溶劑對照 135.30±9.10 138.70±11.00 34.70±2.10 34.30±3.10自發(fā)回變 134.30±8.60 142.00±7.90 36.00±2.00 37.30±1.50陽性照 2401.30±265.90 1758.70±143.40 1049.30±67.70 5588.00±330.60敵克松 2-AF 敵克松 2-AF 50.00 μg/皿 10.00 μg/皿 50.00 μg/皿 10.00 μg/皿劑量/(μg/皿) TA100 TA102-S-9 +S-9 -S-9 +S-9 5000 181.30±11.90 177.00±12.50 283.00±17.10 288.30±15.70 1000 188.70±11.00 183.70±13.70 281.70±16.000 285.70±15.40 200 182.30±14.20 191.70±13.70 276.3±12.70 276.30±17.80 40 186.30±12.10 179.30±13.80 291.00±16.70 286.30±16.10 8 190.00±12.10 182.70±11.00 289.70±12.30 286.70±17.60溶劑對照 179.00±14.20 186.30±14.40 285.70±16.00 288.30±13.70自發(fā)回變 180.00±13.70 181.30±11.00 286.70±15.30 283.70±17.20陽性照 2618.70±251.70 2678.70±221.60 833.30±66.30 909.30±86.20 NaN3 2-AF 敵克松 1，8-二羥基蒽酮1.50 μg/皿 10.00 μg/皿 50.00 μg/皿 50.00 μg/皿

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，CP陽性對照組的微核率顯著高于溶劑對照組（p＜0.01）；各劑量組微核率與溶劑對照組相比較，均無顯著性差異（p＞0.05）；各劑量組的PCE/NCE值均在正常值范圍內(nèi)，且各劑量組PCE值占紅細(xì)胞總數(shù)的比例均不少于溶劑對照組的20%。表明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對小鼠骨髓細(xì)胞沒有致突變作用。

表5 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of micronucleus test in mouse bone marrow cell (±s)

表5 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of micronucleus test in mouse bone marrow cell (±s)

注：與溶劑對照組比較，**表示p＜0.01。

性別 劑量/(g/kg·bw) 檢查PCE數(shù)/個(gè) 微核數(shù)/個(gè) 微核率/‰ (images/BZ_65_1640_393_1662_438.png±s) PCE/NCE 比值(images/BZ_65_1640_393_1662_438.png±s)雌10.0 5000 7 1.40±0.55 1000/926 1.08±0.07 5.0 5000 5 1.00±0.71 1000/928 1.08±0.08 2.5 5000 5 1.00±1.00 1000/919 1.09±0.06 0.0 5000 8 1.60±0.55 1000/918 1.10±0.09 CP(40 mg/kg·bw) 5000 108 21.60±2.61** 1000/1041 0.96±0.03雄10.0 5000 6 1.20±0.84 1000/930 1.08±0.04 5.0 5000 8 1.60±0.89 1000/938 1.07±0.08 2.5 5000 6 1.20±1.10 1000/926 1.09±0.09 0.0 5000 7 1.40±1.14 1000/929 1.08±0.07 CP(40 mg/kg·bw) 5000 112 22.40±2.70** 1000/1036 0.97±0.03

小鼠精子畸形試驗(yàn)如表6所示，CP陽性對照組精子畸形率極顯著高于溶劑對照組（p＜0.01），各劑量組小鼠的精子畸形率與溶劑對照組比較，均無顯著性差異（p＞0.05）。實(shí)驗(yàn)中的精子畸形主要表現(xiàn)類型為無鉤、香蕉形、無定形。表明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對小鼠精子無致畸性作用。

表6 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of sperm malformation test in mice (±s)

表6 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of sperm malformation test in mice (±s)

注：與溶劑對照組比較，**表示p＜0.01。

劑量/(g/kg·bw) 動(dòng)物數(shù)/只受檢精子數(shù)/條精子畸形類型 精子畸形數(shù)/條精子畸形率/%(images/BZ_65_1640_393_1662_438.png±s)無鉤 香蕉形 無定形 胖頭 尾折疊 雙頭 雙尾10.0 10 10000 19 21 118 5 0 0 0 163 1.63±0.32 5.0 10 10000 17 24 112 7 0 0 0 160 1.60±0.27 2.5 10 10000 17 23 109 5 0 0 0 154 1.54±0.23 0.0 10 10000 15 23 121 6 1 0 0 166 1.66±0.31 CP/(40 mg/kg·bw) 10 10000 64 107 375 47 3 0 2 598 5.98±0.66**

此外，30 d試驗(yàn)期間，大鼠生長情況良好，與溶劑對照組比較，各劑量組的體重、進(jìn)食量、食物利用率、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；解剖觀察和組織病理學(xué)檢查也并未發(fā)現(xiàn)異常。在試驗(yàn)劑量下，大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊對大鼠各項(xiàng)觀測指標(biāo)未產(chǎn)生可見毒副作用，未觀察到有害作用劑量（NOAEL）大于3.33 g/kg·bw。

3 結(jié)論

3.1 本研究對大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊的免疫功能進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果顯示，與對照組相比，高劑量組增強(qiáng)DTH能力、小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的效果分別為34.87%（p＜0.05）、36.07%（p＜0.05），說明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊具有提升細(xì)胞免疫的功能；高劑量組PFC 增值效果為 15.85%（p＜0.05），中、高劑量組分別提升小鼠血清溶血素水平9.98%（p＜0.05）、12.66%（p＜0.01），說明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊具有提升體液免疫的功能。綜上，大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊具有增強(qiáng)免疫功能的作用，這一結(jié)論為大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊在保健品方面的合理應(yīng)用提供了理論支持。

3.2 對大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊的安全性進(jìn)行了評價(jià)。大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊大鼠急性毒性MTD大于19.76 g/kg·bw，相當(dāng)于人體推薦量的593.4倍，NOAEL大于3.33 g/kg·bw，屬無毒級(jí)。Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)均為陰性，說明大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊無致突變和損害生殖系統(tǒng)作用。在本試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)及相應(yīng)環(huán)境條件下，大豆異黃酮復(fù)合軟膠囊口服無明顯毒副作用，食用安全性較高。