朱文平，劉碩碩，李志怡

(周口師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 河南 周口 466001)

T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)是一種典型的DNA修復(fù)酶，它在許多基本細(xì)胞過(guò)程中(包括DNA重組、DNA損傷修復(fù)和DNA復(fù)制等)起關(guān)鍵作用[1,2]。T4 PNK通過(guò)將γ-磷酸從三磷酸核苷轉(zhuǎn)移到核酸或寡核苷酸中，特異性催化5'-OH磷酸化，這在DNA修復(fù)和細(xì)胞核酸代謝中都很重要[3]。此外，T4 PNK參與遺傳完整性的維持與多種人類疾病密切相關(guān)，并被發(fā)現(xiàn)是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)，因此T4 PNK的測(cè)定和PNK抑制劑的篩選對(duì)于疾病診斷和藥物發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要[4,5]。

PNK測(cè)定的常規(guī)方法包括放射性同位素32P-標(biāo)記[6]、聚丙烯酰胺凝膠電泳[7]和放射自顯影等[8]。盡管這些方法已經(jīng)很成熟，但它們存在靈敏度和特異性低、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)，有些會(huì)導(dǎo)致放射性污染，因此，它們的用處有限。熒光法因其靈敏度高、響應(yīng)快而備受關(guān)注，現(xiàn)已發(fā)展成為應(yīng)用廣泛的PNK測(cè)定方法之一。但是大多數(shù)熒光法嚴(yán)重依賴復(fù)雜的序列設(shè)計(jì)和昂貴的染料標(biāo)記，從而增加了檢測(cè)的成本和操作難度[9]。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、低成本且高靈敏的T4 PNK活性熒光檢測(cè)方法仍然是一個(gè)不小的挑戰(zhàn)。

分子信標(biāo)(MB)是一種專門設(shè)計(jì)的單鏈DNA分子，以其優(yōu)異的靈敏度和特異性被廣泛用作熒光探針來(lái)構(gòu)建均相檢測(cè)系統(tǒng)[10]。傳統(tǒng)的MB需要對(duì)一個(gè)DNA 進(jìn)行雙重?zé)晒鈽?biāo)記，制備過(guò)程耗時(shí)且成本較高，而非標(biāo)記的熒光策略可以避免MB的缺點(diǎn)。G-三鏈體(G3)是一種新的非經(jīng)典DNA結(jié)構(gòu)，由只有三個(gè)G束的富含G的序列組成[11]，它可以與硫黃素T(ThT)結(jié)合形成“發(fā)光”熒光探針，近年來(lái)基于G3/ThT熒光特性構(gòu)建的生物傳感器已成功用于核酸、金屬離子、蛋白質(zhì)和生物小分子等的檢測(cè)[12]。綜上所述，本文利用G3/ThT復(fù)合物做信號(hào)報(bào)告分子，基于G3MB探針構(gòu)建了一種高效簡(jiǎn)便的T4 PNK熒光檢測(cè)新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

T4 PNK、Lambda核酸外切酶(λexo)、小牛腸堿性磷酸酶(CIP)等均購(gòu)于紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司。硫酸銨來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，ThT來(lái)自阿拉丁試劑(上海)有限公司。三磷酸腺苷溶液(ATP, 100 mmol/L)和三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)來(lái)自生工生物工程(上海)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)中的寡核苷酸由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并純化，序列組成如下：G3MB(5'-3')TGGGAAGGGAGGGAAAAAGAGTCTTCCAGTGTGATGATTTC

CCT(斜體部分為G3序列)；P1(5'-3')TCATCACACTGGAAGACTCT；實(shí)驗(yàn)所用緩沖溶液為Tris-HCl緩沖液1(50 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L MgCl2, pH=7.9)和Tris-HCl緩沖液2(20 mmol/L Tris-HCl, 20 mmol/L KCl, 20 mmol/L MgCl2, 140 mmol/L NaCl, pH=7.4)。

本實(shí)驗(yàn)熒光光譜的測(cè)定儀器為安捷倫Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為430 nm，熒光光譜的收集范圍為450～600 nm，PMT電壓設(shè)置為700V，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

首先將G3MB和P1用Tris-HCl緩沖液1溶解成20 μmol/L的濃度，然后取出部分G3MB退火處理，后稀釋至10 μmol/L置于冰箱上層備用。取600 μL的離心管若干，編號(hào)之后各加入20 μL的反應(yīng)溶液，包括3 μL P1(10 μmol/L)，2 μL PNK緩沖液(10×)，2 μL ATP(10 mmol/L)以及不同體積的T4 PNK稀釋液和純水，混勻器上振蕩均勻，后置于水浴鍋中37 ℃恒溫水浴1 h。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置溫度為65 ℃，恒溫水浴20 min對(duì)T4 PNK進(jìn)行滅活處理。接著向上述溶液中分別加入5 μL λexo緩沖液(10×)，3 μL G3MB(10 μmol/L)和純水湊成50 μL的體積，37 ℃恒溫水浴20 min取出，加入0.5 μL的λexo原液，37 ℃下酶切1 h，然后分別加入10 μL ThT(300 μmol/L)和240 μL Tris-HCl緩沖液2，振蕩混勻后37 ℃水浴30 min，最后進(jìn)行熒光光譜的測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

筆者研究了一種基于G3MB的T4 PNK熒光檢測(cè)新方法，實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩條DNA鏈，分別為G3MB和P1，其中G3MB的5'端包含一個(gè)G3序列，G3MB自雜交形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)將部分的G3序列封閉到G3MB的莖干區(qū)。另外，G3MB環(huán)狀區(qū)的堿基與P1鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的。由圖1可知，P1鏈在ATP與T4 PNK的共同作用下被磷酸化， 后與G3MB雜交形成一個(gè)雙鏈復(fù)合物，打開(kāi)MB結(jié)構(gòu)將MB莖干區(qū)封閉的G3序列釋放出來(lái)。加入λexo后雙鏈復(fù)合物中5'磷酸化的P1鏈被λexo酶切降解，釋放出G3MB，后者又重新變成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，G3序列被重新封閉在G3MB的莖干區(qū)。再加入染料ThT，由于其不能與封閉的G3結(jié)合，只得到較弱的熒光信號(hào)。無(wú)T4 PNK時(shí)，P1鏈不能被磷酸化，P1和G3MB雜交形成雙鏈復(fù)合物，釋放出被封閉在莖干區(qū)的G3序列。此時(shí)加入λexo，由于沒(méi)有λexo的最適底物(即5'磷酸化的雙鏈DNA)，所以雙鏈復(fù)合物不能被λexo酶切，G3序列仍處于自由狀態(tài)，接著再加入染料ThT，G3與ThT特異性結(jié)合從而使熒光信號(hào)增強(qiáng)，檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度與T4 PNK的濃度呈反比。

圖1 基于G3MB探針的T4 PNK熒光檢測(cè)研究的原理示意圖

2.2 實(shí)驗(yàn)原理驗(yàn)證

在該實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)分析對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)條件下得到的熒光光譜可實(shí)現(xiàn)對(duì)方法實(shí)驗(yàn)原理的驗(yàn)證。如圖2所示，曲線e描述的是體系中只有10 μmol/L ThT無(wú)DNA鏈時(shí)的熒光光譜；曲線d代表在0.01 U/mL T4 PNK和ATP共同存在時(shí)，加入λexo得到的熒光光譜；曲線c的實(shí)驗(yàn)條件與曲線d類似，但T4 PNK是經(jīng)過(guò)熱滅活后添加的，其熒光光譜的強(qiáng)度跟T4 PNK測(cè)定的空白(曲線b)相差無(wú)幾，說(shuō)明T4 PNK的酶活性已熱滅活；熒光強(qiáng)度最大的曲線a代表體系中只存在P1與G3MB，兩者雜交形成雙鏈復(fù)合物，但無(wú)λexo作用加入ThT后得到的熒光光譜。通過(guò)圖2各曲線的對(duì)比分析可知，只有當(dāng)ATP與T4 PNK同時(shí)存在時(shí)，P1/G3MB雙鏈復(fù)合物中磷酸化的P1才會(huì)被λexo酶切，最終得到弱的熒光信號(hào)(曲線d)；無(wú)T4 PNK的空白或加入滅活的T4 PNK，P1/G3MB雙鏈復(fù)合物不能被λexo酶切， G3序列結(jié)合ThT后熒光增強(qiáng)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的原理是正確可行的。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)條件下的熒光光譜圖

2.3 實(shí)驗(yàn)條件考察

根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)摸索和相關(guān)資料查閱，本實(shí)驗(yàn)對(duì)檢測(cè)性能影響較大的有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，分別是熒光染料ThT和λexo的濃度。為達(dá)到最佳的檢測(cè)效果，實(shí)驗(yàn)中采取固定其他實(shí)驗(yàn)條件來(lái)對(duì)上述兩個(gè)條件進(jìn)行考察優(yōu)化，從而找出各自的最佳濃度，具體的考察內(nèi)容及結(jié)果如下。

熒光染料ThT作為該實(shí)驗(yàn)的信號(hào)報(bào)告分子，其濃度對(duì)檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度有著直接影響，實(shí)驗(yàn)中首先對(duì)ThT的濃度進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了8種不同濃度的ThT，分別是2、4、6、8、10、12、14和16 μmol/L。如圖3所示，當(dāng)ThT濃度增大時(shí)，相應(yīng)的熒光信號(hào)比先增大后減小，峰值對(duì)應(yīng)的ThT濃度為10 μmol/L。當(dāng)熒光信號(hào)比達(dá)到峰值后，繼續(xù)增大ThT的濃度，熒光信號(hào)強(qiáng)度增大速率減緩，但對(duì)應(yīng)的背景熒光增強(qiáng)，導(dǎo)致熒光信號(hào)比減小。因此，在隨后的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，ThT的最佳濃度選作10 μmol/L并保持不變。

圖3 體系的熒光信號(hào)比對(duì)ThT濃度作圖(熒光信號(hào)比是指熒光信號(hào)在490 nm處的強(qiáng)度與空白的比值)

另外，λexo的濃度也是實(shí)驗(yàn)考察的重要對(duì)象之一。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一共考察了7個(gè)不同的λexo濃度，分別為0.000 5、0.002、0.01、0.05、0.1、0.2和0.3 U/mL。如圖4所示，熒光強(qiáng)度在初期隨λexo濃度的增大急劇減小，在濃度為0.1 U/mL后趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增大λexo濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，說(shuō)明此濃度時(shí)λexo對(duì)DNA底物的酶切趨于完全，因此0.1 U/mL是λexo的最佳濃度，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將λexo的濃度固定在0.1 U/mL。

圖4 體系的熒光強(qiáng)度對(duì)λexo濃度作圖

2.4 傳感方法對(duì)T4 PNK的檢測(cè)性能

在上述最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，本方法通過(guò)測(cè)定不同濃度T4 PNK條件下的熒光光譜來(lái)考察T4 PNK的檢測(cè)性能。如圖5A所示，隨著T4 PNK濃度的逐漸增大對(duì)應(yīng)的熒光光譜強(qiáng)度反而逐漸減小，這是因?yàn)楦嗟腜1被磷酸化導(dǎo)致P1/G3MB雙鏈復(fù)合物中的P1被酶切，釋放出更多的封閉G3序列的G3MB。圖5B表示的是傳感方法對(duì)T4 PNK檢測(cè)的熒光響應(yīng)(490 nm處)校準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熒光響應(yīng)值跟T4 PNK濃度的對(duì)數(shù)在0.000 2～0.01 U/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如圖5B的插圖所示。該方法對(duì)T4 PNK檢測(cè)的線性回歸方程為

圖 5 (B)傳感方法對(duì)T4 PNK檢測(cè)的熒光響應(yīng)(490 nm處)校準(zhǔn)曲線；插圖為衍生的校準(zhǔn)曲線，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是N = 3次單獨(dú)測(cè)量的平均值，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

F=-52.37 logC-48.81，

其中F代表檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度，C代表T4 PNK濃度。另外，根據(jù)3σ規(guī)則估算，本方法對(duì)T4 PNK的檢測(cè)限為0.000 2 U/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 6。

(A)檢測(cè)體系在分析不同濃度T4 PNK時(shí)的熒光光譜

2.5 傳感方法的選擇性

T4 PNK熒光檢測(cè)選擇性的評(píng)估是將方法對(duì)目標(biāo)T4 PNK和其他核酸酶的熒光響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行對(duì)比分析，如圖6所示。

從圖6可以明顯看出，只有加入T4 PNK時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度才較小，而加入其他大濃度的核酸酶時(shí)，相對(duì)強(qiáng)度與無(wú)T4 PNK的空白接近。實(shí)驗(yàn)中T4 PNK的濃度為0.01 U/mL，其他5種核酸酶的濃度10倍于T4 PNK，但其他核酸酶引發(fā)的熒光響應(yīng)的相對(duì)強(qiáng)度仍然與空白相近，由此可見(jiàn)，本方法對(duì)T4 PNK的檢測(cè)具有十分突出的選擇性。

圖 6 T4 PNK熒光檢測(cè)的選擇性

2.6 T4 PNK活性抑制評(píng)估

篩選有效的T4 PNK抑制劑對(duì)臨床治療的發(fā)展具有重要意義，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料可知硫酸銨是常用的PNK活性抑制劑，且其并不影響λexo的活性，可以作為抑制劑篩選的模型。因此，硫酸銨被選作T4 PNK的抑制劑，實(shí)驗(yàn)中一共考察了6個(gè)不同的抑制劑濃度，分別是5、10、15、20、25和30 mmol/L。如圖7所示，隨著硫酸銨濃度的不斷增大，T4 PNK的相對(duì)活性逐漸降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸銨的半抑制濃度(IC50)為17 mmol/L，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道接近[13]。

圖7 硫酸銨對(duì)T4 PNK活性的抑制作用(無(wú)抑制劑的T4 PNK活性設(shè)為1)

3 結(jié)束語(yǔ)

提出了一種基于G3MB探針的T4 PNK熒光檢測(cè)新方法。該方法基于G3與ThT結(jié)合熒光增強(qiáng)的特性，構(gòu)建無(wú)熒光基團(tuán)標(biāo)記的生物傳感器用于T4 PNK活性的高靈敏檢測(cè)，還可用于酶活性抑制作用的評(píng)估。本方法具有操作簡(jiǎn)單、低成本和高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，為構(gòu)建高效的T4 PNK檢測(cè)新方法提供了參考價(jià)值。