魏立婷 賈麗麗 張軍華

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

我國楊木資源豐富，分布廣泛，多用于紙漿造紙、家具制造等行業(yè)。加工楊木時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物，為避免資源浪費(fèi)，將楊木加工廢棄物作為生物質(zhì)化學(xué)品的生產(chǎn)原料[1-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，楊木經(jīng)乙酸和乙酸-過氧化氫兩步預(yù)處理后，可脫除大量木質(zhì)素，減少木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附，有利于后續(xù)水解[4]。同時(shí)研究表明，添加適量酶水解助劑可提高水解性能[5-8]，然而目前有關(guān)酶解助劑對(duì)后續(xù)發(fā)酵過程的影響缺少深入的研究。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生長速度快且易存活[9]，將其引入動(dòng)物體內(nèi)可以改善腸道微生態(tài)平衡，抑制有害菌生長，提高動(dòng)物生長性能，可作為替代抗生素的飼料添加劑[10-13]。Wolfenden等[14]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌PHL-NP123可使肉仔雞體重增加，同時(shí)也使腸道中沙門氏菌減少了25%。Giang等[15]發(fā)現(xiàn)，多種復(fù)合微生物添加劑可提高仔豬采食量和回腸消化率，平均日增重增加5.9%。陳慧慧[16]以楊木木屑水解液為發(fā)酵基質(zhì)，通過木醋桿菌發(fā)酵進(jìn)行細(xì)菌纖維素的制備，最高產(chǎn)量可達(dá)3.14 g/L。因此若以農(nóng)林廢棄物轉(zhuǎn)化制得的單糖作為微生物發(fā)酵碳源，可以進(jìn)一步促進(jìn)廢棄物料的高值轉(zhuǎn)化。

本試驗(yàn)以乙酸-雙氧水預(yù)處理?xiàng)钅練堅(jiān)鼮榈孜?，添加?葡萄糖苷酶（BG）和表面活性劑吐溫-80、PEG-6000、木質(zhì)素磺酸鈉為輔助劑進(jìn)行酶水解，對(duì)比研究最優(yōu)水解條件，并以纖維素酶水解液中單糖為碳源，添加適量表面活性劑進(jìn)行枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，以提高活菌數(shù)，降低生產(chǎn)成本，為生物質(zhì)的高效利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

楊木屑，購自江蘇宿遷，經(jīng)粉碎過60目篩（孔徑＜0.25 mm），冷藏于-20 ℃冰箱保存?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）YS01，由南京林業(yè)大學(xué)生物工程系生物化工研究所提供。

纖維素酶Cellic Ctec2（酶活為123 U/g，蛋白含量為176.2 mg/mL）和β-葡萄糖苷酶Novozyme 188（酶活為1 714 U/mL），購自丹麥諾維信（Novozymes）公司。標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖和木糖為色譜純，購于Sigma-Aldrich公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；ZQTY-50S型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

瓊脂平板培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，酵母膏0.25%，葡萄糖0.1%，瓊脂1.5%，pH調(diào)至7.0±0.2。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉 1%，pH調(diào)至7.1±0.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酶水解液中葡萄糖和木糖總和1%，蛋白胨1%，磷酸氫二鉀0.15%，硫酸錳0.01%，硫酸鎂0.05%，無水氯化鈣0.06%，pH調(diào)至7.0±0.2。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 楊木預(yù)處理

預(yù)先用乙酸對(duì)楊木進(jìn)行第一步預(yù)處理（5%濃度乙酸，常溫處理1 h，170 ℃加熱30 min），脫除半纖維素，制備低聚木糖[4,17]，預(yù)處理殘?jiān)粗林行院笥靡宜?雙氧水進(jìn)行第二步預(yù)處理，乙酸-雙氧水濃度為80%，其中雙氧水與乙酸體積比為1∶1，60 ℃加熱2 h，第二步預(yù)處理殘?jiān)谜麴s水洗至中性，備用。

1.4.2 楊木酶水解

稱取6.0 g干物質(zhì)的兩步預(yù)處理?xiàng)钅練堅(jiān)?，檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 5.0）補(bǔ)足體系，配成300 mL 2%底物濃度的水解液，在10 FPU/g DM的纖維素酶CTec2 基礎(chǔ)上，分別添加β-葡萄糖苷酶和吐溫-80、PEG-6000、木質(zhì)素磺酸鈉。在50 ℃、200 r/min條件下水解72 h，反應(yīng)結(jié)束后將酶解混合物真空過濾，除去殘?jiān)妹附庖骸Ｃ看卧囼?yàn)做3 個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.4.3 楊木酶水解液發(fā)酵

以未添加酶水解助劑時(shí)酶水解液中的單糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，并向培養(yǎng)基中添加不同濃度的吐溫-80、PEG-6000、木質(zhì)素磺酸鈉，進(jìn)行枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)。本試驗(yàn)以吸光值（OD600）和活菌數(shù)作為評(píng)價(jià)飼用枯草芽孢桿菌發(fā)酵性能的主要指標(biāo)，同時(shí)還可結(jié)合單糖消耗情況，判定菌株對(duì)培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。

1.4.4 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)方法

菌株活化：將保存的枯草芽孢桿菌YS01 接種到瓊脂平板培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

種子培養(yǎng)：挑取單菌落接種到種子培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：接入5%種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。

1.4.5 糖含量測定

樣品中葡萄糖、木糖含量用高效液相色譜進(jìn)行分析。色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87P（300 mm×7.8 mm）分析柱，檢測器為示差折光檢測器，采用5 mM的H2SO4作為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，樣品稀釋后過0.22 μm的水系濾膜。

1.4.6 吸光度測定以未接種的培養(yǎng)基作空白對(duì)照，取發(fā)酵液1 mL，無菌水稀釋后測定吸光度(OD600)。

1.4.7 活菌數(shù)測定

按照GB/T 13093—2006《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》對(duì)活菌數(shù)進(jìn)行測定。取發(fā)酵液1 mL稀釋至10-6～10-8，涂布平板計(jì)數(shù)，3 個(gè)平行，倒置培養(yǎng)24 h確定活菌數(shù)。每次試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理后的楊木化學(xué)組分和結(jié)構(gòu)分析

按照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行乙酸、乙酸-過氧化氫兩步預(yù)處理，預(yù)處理前后楊木主要成分和結(jié)構(gòu)如表1。乙酸處理可脫除部分木聚糖，低木聚糖得率明顯提高，可用于制備低聚木糖。但是疏水性高于未處理?xiàng)钅?，使得木質(zhì)素更易吸附纖維素酶，影響酶水解得率。乙酸預(yù)處理殘?jiān)M(jìn)行乙酸-過氧化氫兩步預(yù)處理后，木質(zhì)素大量脫除，纖維素相對(duì)含量增加，結(jié)晶度升高到64.2%，有利于酶水解。

表1 乙酸、乙酸-雙氧水預(yù)處理對(duì)楊木化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的影響Tab.1 Chemical compositons and structure of AC and HPAC pretreated poplar

2.2 輔助劑對(duì)楊木酶水解的影響

2.2.1β-葡萄糖苷酶對(duì)酶水解的影響

乙酸-雙氧水二次預(yù)處理?xiàng)钅驹谒鈺r(shí)產(chǎn)生較高濃度的纖維二糖，抑制纖維二糖水解酶的作用，導(dǎo)致酶解得率降低[18-19]。因此，向水解液中加入適量β-葡萄糖苷酶可降低纖維二糖濃度，緩解其對(duì)酶解的抑制。

圖1 所示為β-葡萄糖苷酶的添加量對(duì)楊木酶解影響情況。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，酶水解轉(zhuǎn)化率穩(wěn)步提升，且單糖得率隨β-葡萄糖苷酶添加劑量的增加有不同幅度的增加，其中木糖得率增幅較大。加入500 nkat/g含量的β-葡萄糖苷酶水解72 h，葡萄糖和木糖得率分別從68.25%和85.85%提升到71.39%和90.57%。當(dāng)β-葡萄糖苷酶含量增加到1 000 nkat/g，葡萄糖和木糖得率均為最高，分別為74.35%和95.43%，說明添加β-葡萄糖苷酶能有效促進(jìn)纖維素酶解。

圖1 β-葡萄糖苷酶對(duì)楊木酶水解的影響Fig.1 Effect of β-glucosidase on the hydrolysis of pretreated poplar

2.2.2 吐溫-80 對(duì)酶水解的影響

隨后考察吐溫-80 對(duì)預(yù)處理?xiàng)钅久杆獾寐实挠绊?，結(jié)果如圖2 所示。添加0.5 g/L的吐溫-80 酶水解72 h，葡萄糖得率由64.10%提升至73.01%，當(dāng)添加量增加到1 g/L，葡萄糖得率進(jìn)一步提升到78.85%，然而繼續(xù)增加吐溫-80 的濃度未能顯著提高葡萄糖得率。

圖2 吐溫-80 對(duì)楊木酶水解的影響Fig.2 Effect of Tween-80 on the hydrolysis of pretreated poplar

酶水解木糖得率也得到相同結(jié)果，吐溫-80 劑量為1 g/L時(shí)，酶水解72 h木糖得率最高為95.35%。另外，酶水解時(shí)間從48 h延長至72 h，半纖維素水解效率逐漸放緩，木糖得率難以提高?？紤]到吐溫-80 含量過多不利于酶的回收，且增加生產(chǎn)成本，因此，水解過程中表面活性劑吐溫-80 的最適添加量1 g/L。

2.2.3 PEG-6000 對(duì)酶水解的影響

與添加吐溫-80 的結(jié)果相似，隨著底物中非離子表面活性劑PEG-6000 含量增加，單糖得率均較未添加PEG-6000 樣品有所提高。由圖3 可知，PEG-6000濃度從0.5 g/L增加到1 g/L，酶解72 h葡萄糖得率和木糖得率均相差不大，說明微量的PEG-6000 對(duì)酶水解促進(jìn)效果不顯著。但當(dāng)PEG-6000 添加量增加到1.5 g/L，葡萄糖和木糖得率較未添加樣相比，分別提高了25.64%和22.99%。主要原因是PEG-6000 中的親水性基團(tuán)可對(duì)纖維素酶產(chǎn)生誘導(dǎo)[20]，釋放活性，減少木質(zhì)素與纖維素酶之間的靜電吸引，同時(shí)PEG-6000 能夠改善固液傳質(zhì)，加速底物與酶運(yùn)動(dòng)[21]，從而增加底物與酶的吸附-解吸速率，提高預(yù)處理?xiàng)钅久杆庑?。因此可選用1.5 g/L濃度PEG-6000 作為化學(xué)激活劑加入到酶水解試驗(yàn)中。

圖3 PEG-6000 對(duì)楊木酶水解的影響Fig.3 Effect of PEG-6000 on the hydrolysis of pretreated poplar

2.2.4 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)酶水解的影響

考察1、5 g/L濃度木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)楊木殘?jiān)杆庑实挠绊懀Y(jié)果如圖4 所示。隨著酶水解的進(jìn)行，酶水解得率快速升高。在3 種酶水解反應(yīng)中，酶水解效率均在反應(yīng)72 h時(shí)達(dá)到最高值。另外，5 g/L濃度的木質(zhì)素磺酸鈉單糖得率最高，葡萄糖、木糖得率分別為70.18%、94.72%，說明添加木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)酶解反應(yīng)有促進(jìn)作用，酶水解后得到更多的單糖，可為木質(zhì)纖維原料的生物轉(zhuǎn)化提供能源。木質(zhì)素磺酸鈉中磺酸基團(tuán)的負(fù)電子與纖維素酶中帶正電的氨基結(jié)合，形成“水包油”型膠束[22-23]，從而使纖維素與纖維素酶連接更穩(wěn)定，阻礙酶與底物接觸，提高酶水解效率。因此，選擇木質(zhì)素磺酸鈉的適宜濃度為5 g/L。

圖4 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)楊木酶水解的影響Fig.4 Effect of sodium lignosulfonate on the hydrolysis of pretreated poplar

2.3 表面活性劑對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基的碳源來自未添加酶助劑時(shí)酶水解液中的葡萄糖和木糖，若在發(fā)酵過程中加入β-葡萄糖苷酶，則會(huì)與水解液發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而影響培養(yǎng)基碳源含量。因此，試驗(yàn)僅探究吐溫-80、PEG-6000、木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響。

2.3.1 吐溫-80 對(duì)發(fā)酵的影響

向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0～5 g/L的吐溫-80，菌株具體生長情況如表2所示。由表2可知，添加0.5 g/L吐溫-80，OD600從5.74提高到6.05，活菌數(shù)達(dá)到1.12×109CFU/mL。但隨著吐溫-80濃度持續(xù)增加，OD600和活菌數(shù)均不同程度降低，菌株生長受到抑制。這可能是因?yàn)檩^高濃度的吐溫-80產(chǎn)生大量起泡使錐形瓶中溶氧量不足，影響菌株生長[24]。值得注意的是，菌株對(duì)葡萄糖利用情況的影響不大，說明枯草芽孢桿菌優(yōu)先以葡萄糖作為碳源營養(yǎng)物質(zhì)。

2.3.2 PEG-6000 對(duì)發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中添加0～5 g/L PEG-6000，枯草芽孢桿菌生長情況如表2所示。由表2可知，添加PEG-6000對(duì)楊木酶解液發(fā)酵具有抑制作用，隨著PEG-6000濃度增加，抑制作用越強(qiáng)，PEG-6000濃度為5 g/L時(shí)，OD600降低到3.89，木糖消耗率僅有41.88%，活菌數(shù)為3.10×107CFU/mL，遠(yuǎn)低于空白樣（8.42×108CFU/mL）。添加PEG-6000的發(fā)酵液滲透壓增加，細(xì)胞液外滲，同時(shí)水解過程中產(chǎn)生的乙酸、糠醛等物質(zhì)與表面活性劑作用，抑制菌株的生長[25]。試驗(yàn)結(jié)果與羅鵬[26]的研究報(bào)道有所差異，主要原因在于原料的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)不同。

2.3.3 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)發(fā)酵的影響

木質(zhì)素磺酸鈉屬于陰離子表面活性劑，負(fù)電性極強(qiáng)。向培養(yǎng)基中添加1 g/L和5 g/L木質(zhì)素磺酸鈉，枯草芽孢桿菌生長情況如表2所示。如表2可知，與吐溫-80、PEG-6000作用效果不同，木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)水解液發(fā)酵起促進(jìn)作用，添加1 g/L木質(zhì)素磺酸鈉，OD600增加到6.79，活菌數(shù)最高，可達(dá)2.10×109CFU/mL，隨著木質(zhì)素磺酸鈉劑量增加到5 g/L，活菌數(shù)略有下降，為9.62×108CFU/mL，但仍高于空白樣。水解液發(fā)酵過程中木糖消耗明顯更多，最高消耗率可達(dá)90.93%。綜合對(duì)比3種表面活性劑可知，最好的酶解助劑是木質(zhì)素磺酸鈉，既可以提升酶水解效率，還可以促進(jìn)枯草芽孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)。

表2 化學(xué)助劑添加量對(duì)水解液發(fā)酵影響試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Effect of chemical additives on hydrolysate fermentationtest results

3 結(jié)論

本研究主要得出以下結(jié)論：

1）水解過程中添加適量輔助劑對(duì)預(yù)處理?xiàng)钅久杆庥胁煌潭鹊拇龠M(jìn)作用，且單糖得率隨著酶水解時(shí)間延長而增加。β-葡萄糖苷酶對(duì)酶水解有明顯促進(jìn)作用。與吐溫-80、木質(zhì)素磺酸鈉相比，PEG-6000 的促進(jìn)效果更加顯著；

2）表面活性劑對(duì)枯草芽孢菌發(fā)酵的影響效果不同。添加0.5 g/L吐溫-80，在一定程度上有利于菌株生長，但隨著濃度的增加，對(duì)酶水解液發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用；添加PEG-6000 會(huì)抑制菌株生長，而木質(zhì)素磺酸鈉卻對(duì)酶水解液發(fā)酵具有促進(jìn)作用；

3）化學(xué)助劑對(duì)酶水解和枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響的綜合分析結(jié)果表明，額外補(bǔ)充1.5 g/L 的PEG-6000酶水解得率提升最多，添加1 g/L木質(zhì)素磺酸鈉時(shí)菌株生長效果最好。本研究結(jié)果可為楊木酶水解液制備益生菌奠定基礎(chǔ)。