陳 浩，張 貞，王 寧，董雙雙，連小娟，梁偉華，蔣金芳，龐麗娟，齊 妍

滑膜肉瘤(synovial sarcoma, SS)是一種較少見的具有雙相分化、高侵襲性的軟組織腫瘤，約占軟組織肉瘤的10%；特征是存在特異性t (X;18)(p11;q11)易位產(chǎn)生SYT(18q11.2)-SSX(Xp11.2)融合基因，是SS主要致瘤因素且在臨床病理診斷中發(fā)揮重要作用。SS的組織形態(tài)學(xué)主要有BSS和MFSS兩種類型，前者在梭形細(xì)胞背景下表現(xiàn)為腺體或巣團(tuán)上皮樣細(xì)胞，后者以梭形細(xì)胞為主[1]。課題組前期研究[2-3]表明，上皮間葉轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)相關(guān)因子在SS的上皮和間葉成分中表達(dá)水平存在的差異，提示SS與EMT密切相關(guān)；通過外顯子芯片方法在SS中的上皮和間葉成分篩選出差異基因23個(gè)，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)通路下游基因P300。該文通過檢測SS不同組織成分中P300及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討P300在滑膜肉瘤EMT中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例材料收集自1968-2015年石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科和新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科SS石蠟包埋組織40例，根據(jù)WHO軟組織最新分類標(biāo)準(zhǔn)(第五版)和Enzinger&Weiss軟組織腫瘤進(jìn)行分型和分類，病理組織學(xué)分級參照法國癌癥中心聯(lián)盟軟組織肉瘤分級系統(tǒng)；TNM分期參照國際抗癌協(xié)會與美國癌癥聯(lián)合委員會制定的TNM分期系統(tǒng)。所有病例均進(jìn)行免疫組化及一步法RT-PCR技術(shù)檢測SYT-SSX融合基因檢測進(jìn)行最終確診，其中包括雙相型30例，單相纖維型10例。所有樣本由資深病理醫(yī)師復(fù)診。40例SS患者中隨訪例數(shù)為25例，因聯(lián)系方式或住址更換等原因?qū)е?5例失訪，隨訪率為62.5%。

1.2 融合基因檢測提取樣本組織中的RNA(石蠟TRIzol法，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司)，用一步法RT-PCR(試劑盒來自QIAGEN公司)擴(kuò)增融合基因SYT-SSXl和SYT-SSX2(引物由Sangon合成，引物序列及退火溫度見表1)，經(jīng)1.5%瓊脂糖(BBI)凝膠電泳分析結(jié)果。

表1 PCR所用引物序列、引物對、退火溫度及擴(kuò)增片段大小

1.3 免疫組織化學(xué)及結(jié)果判讀實(shí)驗(yàn)采用Envision二步法試劑盒(北京中杉公司)，設(shè)立空白、陽性及陰性對照。檢測P300(1 ∶500，英國Abcam公司)及31例SS中E-cadherin(1 ∶200， 丹麥DAKO公司)，N-cadherin、β-catenin(1 ∶400)、Snail(1 ∶800)、Slug(1 ∶200)(英國Abcam公司)蛋白表達(dá)情況。判定染色結(jié)果采用統(tǒng)一評分標(biāo)準(zhǔn)，由兩位高年資病理醫(yī)師獨(dú)立雙盲閱片，結(jié)果取平均值。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度評分，結(jié)合陽性細(xì)胞及著色強(qiáng)度相乘分級，積分0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性()，9～12分為強(qiáng)陽性()。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 26.0分析軟件，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法對實(shí)驗(yàn)所得P300、SYT-SSX表達(dá)情況數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析P300與滑膜肉瘤臨床與病理資料之間的關(guān)系以及P300與E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug的相關(guān)性。運(yùn)用 Cox 回歸模型對 SS 患者總生存時(shí)間進(jìn)行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P300表達(dá)與SS臨床病理信息的相關(guān)性在40例SS中P300表達(dá)率為95%(38/40)。結(jié)果表明P300的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、發(fā)生部位、融合基因分型、組織學(xué)分級、TNM分期以及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 P300與滑膜肉瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

對所有患者進(jìn)行隨訪，僅獲得25例患者隨訪資料，隨訪時(shí)間約為3～69個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為26個(gè)月，其中10例存活，15例死亡。通過 Cox 回歸模型探討SS患者臨床病理參數(shù)對患者總生存時(shí)間的影響顯示，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移(P=0.019)和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(P=0.003)是患者總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表3)，而患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、融合基因分型以及組織學(xué)分級與患者生存時(shí)間沒有明顯相關(guān)性。

表3 SS患者生存時(shí)間多因素Cox回歸分析

2.2 SYT-SSX融合基因與組織學(xué)分型的相關(guān)性40例SS患者中SYT-SSX融合基因陽性率為92.5%(37/40)，其中BSS和MFSS分別為90%(27/30)、100%(10/10)。用一步法RT-PCR分別檢測SYT-SSXl型和SYT-SSX2型，擴(kuò)增產(chǎn)物為118 bp (圖1)。30例BSS中，SYT-SSX1型的陽性率為66.7%(18/27)，SYT-SSX2型為33.3%(9/27)；10例MFSS中，SYT-SSX1型為80%(8/10)，SYT-SSX2型為20%(2/10)。融合基因類型與SS組織學(xué)類型間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.688)，可能與樣本數(shù)量較少有關(guān)。

圖1 滑膜肉瘤SYT-SSX融合基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(118bp)電泳圖

2.3 P300在BSS及MFSS中的表達(dá)P300在腫瘤細(xì)胞呈胞核著色。BSS中P300表達(dá)率為93.3%(28/30)，強(qiáng)陽性率為33.3%(10/30)，在上皮樣區(qū)表達(dá)明顯高于梭形細(xì)胞區(qū)(圖2A)。MFSS中P300表達(dá)率為100%(10/10)，強(qiáng)陽性率為60.0%(6/10)(圖2B)。P300在MFSS中的表達(dá)陽性強(qiáng)度高于BSS，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 P300在滑膜肉瘤不同組織學(xué)亞型中的表達(dá)

2.4 P300與EMT相關(guān)蛋白在SS中表達(dá)的相關(guān)性

2.4.1P300與EMT相關(guān)蛋白在SS不同組織學(xué)類型中的表達(dá) 分析P300陽性表達(dá)與EMT相關(guān)分子表達(dá)的相關(guān)性(圖3、表4)。在BSS中，P300的表達(dá)與EMT相關(guān)分子E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與β-catenin的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)，P300高表達(dá)的病例中，77.8%(7/9)β-catenin不表達(dá)，反之，P300低表達(dá)的病例中，76.9%(10/13)β-catenin陽性表達(dá)。

表4 SS中P300與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系[n(%)]

在MFSS中，P300的表達(dá)與E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和Snail的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與Slug的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048)，P300高表達(dá)的病例中，80%(4/5)Slug不表達(dá)，P300低表達(dá)的病例中，100%(4/4)Slug呈陽性表達(dá)。以上結(jié)果提示P300可能在SS的EMT過程中發(fā)揮一定作用。

圖3 EMT相關(guān)蛋白在BSS和MFSS中的表達(dá) EnVision ×200

2.4.2P300與EMT相關(guān)蛋白在BSS不同細(xì)胞成分中的表達(dá) 分析BSS的上皮樣細(xì)胞成分和梭形細(xì)胞成分中P300與EMT的關(guān)系(表5)。在BSS上皮樣細(xì)胞成分中，P300的高表達(dá)率為63.3%，其中E-cadherin、N-cadherin和β-catenin高表達(dá)，Snail和Slug低表達(dá)；而P300低表達(dá)的病例中E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Slug和Snail均高表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在梭形細(xì)胞成分中，P300的高表達(dá)率為26.7%(8/30)。無論在P300高表達(dá)還是低表達(dá)的病例中，P300與EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

幾乎所有的SS都具有特征性融合基因SYT-SSX，其不僅可以作為臨床病理診斷有效的檢測指標(biāo)，而且在致瘤過程中具有重要作用[4]。SS的發(fā)生發(fā)展可能與EMT相關(guān)，且融合基因有一定的調(diào)控作用。Ladanyi et al[5]對243例SS病例分析發(fā)現(xiàn)，98%的患者表達(dá)SYT-SSX基因，其中61%為SYT-SSX1，37%為SYT-SSX2；BSS中SYT-SSX1的表達(dá)高于SYT-SSX2，MFSS中SYT-SSX1的表達(dá)低于SYT-SSX2，認(rèn)為SYT-SSX1基因可能更容易促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮分化。Wei et al[6]對37例SS研究發(fā)現(xiàn)，SYT-SSX的表達(dá)率為89.2%，BSS均為SYT-SSX1型，MFSS均為SYT-SSX2型；表明SYT-SSX與SS的組織學(xué)分型可能有關(guān)。本研究中66.7%的BSS存在SYT-SSX1，33.3%為SYT-SSX2 ，1型明顯高于2型，與文獻(xiàn)報(bào)道相符合；但在MFSS中80.0%為SYT-SSX1，20.0%為SYT-SSX2，和文獻(xiàn)報(bào)道略有差異，可能與樣本量少有關(guān)。

表5 BSS不同細(xì)胞成分中P300與EMT相關(guān)蛋白的相關(guān)性[n(%)]

SYT-SSX可通過干擾Snail、Slug對E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制作用，進(jìn)而影響EMT過程[1]。EMT與間葉性腫瘤和肉瘤的生物學(xué)和臨床過程相關(guān)，該過程中上皮細(xì)胞溶解細(xì)胞間連接，獲得具有增強(qiáng)遷移能力的間充質(zhì)特性，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。EMT過程受轉(zhuǎn)錄因子、信號通路和miRNA等很多因素的影響，相關(guān)的信號通路有TGF-β、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、Src、Ras-MAPK等。TGF-β作為EMT發(fā)展中的一個(gè)重要的通路，在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要的促癌作用[7-8]。課題組前期通過分析BSS上皮和間葉兩種細(xì)胞成分基因組SNP的改變，顯示兩種成分之間存在23個(gè)顯著差異基因(包括P300)，而P300是TGF-β通路中的一個(gè)下游基因[3, 9]。P300在TGF-β信號通路中起到關(guān)鍵作用，它作為Smad3的轉(zhuǎn)錄輔活化因子，通過與Smad3的相互作用或介導(dǎo)組蛋白乙?；龠M(jìn)了TGF-β通路的激活[10]。

P300是轉(zhuǎn)錄共激活因子組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移家族中的一員,參與多種細(xì)胞過程如增殖，分化，凋亡，細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷應(yīng)答的調(diào)節(jié)[11]。de Bruijn et al[12]研究發(fā)現(xiàn)，SS相關(guān)蛋白SS18(也稱SYT或SSXT)作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，其活性可能是由P300等因子介導(dǎo)的。Krubasik et al[13]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中P300的缺乏導(dǎo)致癌細(xì)胞的黏附性降低和遷徙能力增加，暗示P300的缺乏可能促進(jìn)EMT過程。在乳腺癌中的研究中[14]，P300的高表達(dá)與病理組織分型、臨床分期和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，縮短了患者的生存期及無疾病進(jìn)展生存期，提示P300的表達(dá)是預(yù)測和評估乳腺癌預(yù)后的重要獨(dú)立因素。P300在肉瘤方面的研究甚少，主要涉及P300作為肉瘤癌蛋白的轉(zhuǎn)錄輔活化因子[12]，但關(guān)于滑膜肉瘤臨床預(yù)后及EMT方面的研究甚少。本研究表明，BSS中P300的表達(dá)與E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug的表達(dá)均無關(guān)，但其表達(dá)強(qiáng)度與β-catenin密切相關(guān)；而在MFSS中P300的表達(dá)強(qiáng)度與Slug密切相關(guān)。在腫瘤中，Smad依賴性TGF-β通路能夠誘導(dǎo)Snail、Slug等因子的表達(dá)，Wnt/β-catenin通路會使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的β-catenin過度表達(dá)，從而導(dǎo)致EMT的發(fā)生以及腫瘤的轉(zhuǎn)移[8]，以上提示P300可能參與SS的上皮樣細(xì)胞分化以及EMT過程，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，P300作為TGF-β信號通路的下游基因可能參與SS上皮分化及EMT過程，在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，從而影響SS的侵襲轉(zhuǎn)移。