賀海輝 沈洪

摘要 目的：從炎癥反應探討徐長卿治療潰瘍性結腸炎（UC）的機制。方法：將60只雄性SD大鼠隨機分為6組：正常組，模型組，柳氮磺吡啶組，徐長卿低、中、高劑量組。除正常組外，其余5組大鼠均以三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸造模。灌腸24 h后，徐長卿低中高劑量組分別每天給予徐長卿0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg體質量灌胃，柳氮磺吡啶組給予柳氮磺吡啶0.6 g/kg體質量灌胃，連續(xù)10 d。給藥結束后，檢測結腸組織髓過氧化物酶（MPO）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）活性，Western Blotting法檢測磷酸化核因子κB抑制蛋白（p-IκBα）、胞質核因子κB（NF-κB）、胞核核因子κB蛋白水平。結果：徐長卿組較模型組MPO、iNOS活性顯著降低（P<0.01），且隨徐長卿劑量升高MPO、iNOS活性有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。徐長卿組與模型組比較p-IκBα、胞核核因子水平顯著降低（P<0.01），且隨徐長卿劑量升高p-IκBα、胞核核因子κB水平有降低趨勢（P>0.05）。徐長卿組與模型組比較胞質核因子κB水平顯著升高（P<0.01），且隨徐長卿劑量升高胞質核因子κB水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：徐長卿通過抑制核因子κB信號通路的激活，減少炎癥介質的生成，是其治療潰瘍性結腸炎的可能機制。

關鍵詞 徐長卿;2，4，6-三硝基苯磺酸;潰瘍性結腸炎;炎癥反應;核因子κB;核因子κB抑制蛋白;髓過氧化物酶;誘導型一氧化氮合酶

Effects of Cynanchum Paniculatum on NF-κB Signaling Pathway in Ulcerative Colitis Model Rats

HE Haihui1，SHEN Hong2

（1 Hunan Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital，Zhuzhou 412000，China; 2 Jiangsu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Cynanchum paniculatum in the treatment of ulcerative colitis.Methods：A total of 60 male SD rats were randomly divided into 6 groups：a normal group，a model group，a sulfasalazine group，a low，a medium and a high dose of Cynanchum paniculatum group.Except the normal group，TNBS enema was used in the other 5 groups.After 24 h of enema，the low，medium and high dose groups were given 0.4 g/kg，0.8 g/kg and 1.6 g/kg of Cynanchum paniculatum by gavage every day，and the sulfasalazine group was given 0.6 g/kg of sulfasalazine by gavage for 10 days.After administration，the activities of MPO and iNOS in colon tissue were detected，and p-IκBα，Cytoplasmic NF-κB，Nuclear NF-κB protein level was detected by Western Blotting.Results：the activities of MPO and iNOS in Cynanchum paniculatum group were significantly lower than those in model group（P<0.01），and the activities of MPO and iNOS decreased with the increase of Cynanchum paniculatum dose（P>0.05）.Compared with the model group，the levels of p-IκBα and Cytoplasmic NF-κB of Cynanchum paniculatum group were significantly lower（P<0.01），and the levels of p-IκBα，Nuclear NF-κB decreased with the increase of the dosage of Cynanchum paniculatum（P>0.05）.Compared with the model group，the level of cytoplasmic NF-κB in Cynanchum paniculatum group increased significantly（P<0.01），and the level of cytoplasmic NF-κB increased with the increase of the dose of Cynanchum paniculatum（P>0.05）.Conclusion：The possible mechanism of Cynanchum paniculatum in treating ulcerative colitis is to inhibit the activation of NF-κB signaling pathway and reduce the production of inflammatory factors.

Keywords Cynanchum paniculatum; 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid; Ulcerative colitis; Inflammatory reaction; NF-κB; IκBα; MPO; iNOS

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.009

潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是重要的結腸癌前病變和難治性疾病，其病因可能與環(huán)境、遺傳、腸道菌群和免疫因素等有關，其中腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應所導致的炎癥反應在UC發(fā)病中起重要作用，而核因子κB（NF-κB）是炎癥反應的中心環(huán)節(jié)，以徐長卿為主的中藥復方能有效治療UC患者和動物模型[1-7]。我們前期動物實驗表明徐長卿能有效改善三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇法誘導的大鼠結腸炎，其機制可能與降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）水平有關[8]。為進一步闡明徐長卿治療潰瘍性結腸炎的作用機制，本研究徐長卿對潰瘍性結腸炎模型大鼠NF-κB信號通路及炎癥介質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性8周齡SD大鼠60只，體質量（202±5）g，無特定病原體（SPF級），由南京大學動物模型研究中心提供，許可證號：SYXK（蘇）2007-0017，飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院藥理實驗室，普通飼料，常規(guī)飲水，室溫控制在22 ℃左右，相對濕度約60%，在嚴格遵循動物倫理學標準的前提下進行實驗。

1.1.2 藥物 徐長卿（亳州市敬德藥業(yè)有限責任公司，批號：20100102）;柳氮磺吡啶片（上海三維制藥有限公司，批號：200805C04）。

1.1.3 試劑與儀器 5%2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma公司，美國，貨號：080M5000）;10%水合氯醛（上海國藥集團化學試劑有限公司，批號：20090922）;無水乙醇（南京寧試化學試劑有限公司，批號：20100118）;髓過氧化物酶（MPO）（南京建成生物工程研究所，批號：20161223）;一氧化氮合成酶（iNOS）（南京建成生物工程研究所，批號：20161218）;細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0028）;Western及IP細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013）;BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國，批號：PG201361）;p-IκBα抗體（Abcam公司，英國：貨號：13904）;NF-κB抗體（CST公司，美國，貨號：8242）;GAPDH抗體（Abcam公司，英國，貨號：8245）;H3抗體（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：AF0009）。電子天平（Sartorius公司，德國，型號：BT323S）;高速冷凍離心機（Beckman公司，美國，型號：GS-15R）;電泳槽（Biorad公司，美國，型號：Mini Protean 3 Cell）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 60只大鼠按體質量采用隨機數(shù)字表法分成6組：正常組、模型組、徐長卿低劑量組、徐長卿中劑量組、徐長卿高劑量組、柳氮磺吡啶組，每組10只。模型建立參照前期預實驗和相關文獻[9-10]，除正常組外，其余50只大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，用大鼠灌胃針管由肛門輕緩插入約8 cm，緩慢推入造模液（100 mg/kgTNBS+50%乙醇0.25 mL），并保持倒立30 s后，仰臥歸籠。正常組給予相應體積的生理鹽水灌腸。

1.2.2 給藥方法 分別稱取中藥飲片徐長卿8 g、16 g、32 g，用蒸餾水浸泡于500 mL燒杯中2 h后，分煎3次，合并3次煎液，加熱濃縮至200 mL，過濾去渣，密封保存在4 ℃冰箱。生藥濃度分別為0.04 g/mL、0.08 g/mL、0.16 g/mL。柳氮磺吡啶片用時用研缽研成細末，用雙蒸水配成藥物濃度為0.06 g/mL的水溶液。灌腸24 h后，正常組及模型組每天給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，徐長卿低、中、高劑量組給予相應徐長卿水煎液10 mL/kg灌胃（徐長卿人體推薦日用量為10 g，大鼠實驗分別設人體推薦量的2.5倍、5倍、10倍，大鼠給藥劑量0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg體質量，設為低、中、高劑量），柳氮磺吡啶組給予柳氮磺吡啶水溶液10 mL/kg灌胃（柳氮磺吡啶人體推薦日用量為4 g，大鼠實驗設人體推薦量的10倍，大鼠給藥劑量0.6 g/kg體質量），連續(xù)10 d。灌胃結束后，所有動物禁食24 h，脫頸椎法處死大鼠，采集大鼠結腸組織備檢。

1.2.3 檢測指標與方法

大鼠結腸組織MPO、iNOS活性檢測：將收集的大鼠結腸組織，精確稱重后，用眼科剪剪碎，使用勻漿器勻漿，轉移到EP管中4 ℃ 2 500 r/min，離心半徑10 cm，離心5 min，收集細胞并檢測MPO、iNOS活性。嚴格按照試劑盒說明書的操作方法進行操作，檢測結腸組織中的MPO、iNOS活性。

Western Blotting法檢測p-IκBα、胞質核因子κB、胞核核因子κB蛋白：取結腸組織充分研磨，根據(jù)Western及IP細胞裂解液說明書的操作步驟提取組織總蛋白，根據(jù)細胞核和細胞質蛋白提取試劑盒說明書的操作步驟提取細胞的胞質、胞核蛋白，BCA法測定蛋白濃度。各孔取40 μg的蛋白上樣，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳進行蛋白分離，采用電轉法將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，用TBST洗膜，加入一抗孵育，4 ℃反應過夜。次日先以TBST洗膜，加入二抗孵育，室溫反應1 h，再用TBST洗膜，顯色，采集圖片。采用Image J圖像分析管理系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進行分析，以p-IκBα、胞質核因子κB與內參GAPDH條帶灰度值之比及胞核核因子κB與內參H3條帶灰度值之比作為各自目的蛋白相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布者，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布者，組間比較采用獨立樣本的Wilcoxon秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸組織MPO、iNOS活性 與正常組比較，模型組大鼠結腸組織MPO、iNOS活性顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，4個觀察組大鼠結腸組織MPO、iNOS活性顯著降低（P<0.01）。與柳氮磺吡啶組比較，徐長卿3種劑量組大鼠結腸組織MPO、iNOS活性差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。徐長卿3種劑量組間大鼠結腸組織MPO、iNOS活性差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但隨徐長卿劑量升高大鼠結腸組織MPO、iNOS活性有降低趨勢。見表1。

2.2 結腸組織p-IκBα、胞質核因子κB、胞核核因子κB水平 與正常組比較，模型組大鼠結腸組織p-IκBα、胞核核因子κB水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，4個觀察組大鼠結腸組織p-IκBα、胞核核因子κB水平顯著降低（P<0.01）。與柳氮磺吡啶組比較，徐長卿3種劑量組大鼠結腸組織p-IκBα、胞核核因子κB水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。徐長卿三劑量組間大鼠結腸組織p-IκBα、胞核核因子κB水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但隨徐長卿劑量升高大鼠結腸組織p-IκBα、胞核核因子κB水平有降低趨勢。與正常組比較，模型組大鼠結腸組織胞質核因子κB水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，4個觀察組大鼠結腸組織胞質核因子κB水平顯著升高（P<0.01）。與柳氮磺吡啶組比較，徐長卿3種劑量組大鼠結腸組織胞質核因子κB水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。徐長卿3種劑量組間大鼠結腸組織胞質核因子κB水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但隨徐長卿劑量升高大鼠結腸組織胞質核因子κB水平有升高趨勢。見表2。

3 討論

《沈氏尊生書》有云：“大抵痢之瘍根，皆由濕蒸熱壅，以至氣血凝滯，漸至腸胃之病。”UC濕熱蘊結腸道，胃腸腑氣不利，氣血運行受阻，氣血凝滯，血瘀夾濕夾熱，傷及腸絡出血，而致腹痛、里急后重、痢下血性黏液便。因此，濕熱蘊腸、氣滯血瘀為UC基本病機[11]。UC風邪傷中，運化失司，風水相作發(fā)為腸鳴、泄瀉;腸腑之風居無定所，傷及腸絡，則間歇性發(fā)作，腹痛綿綿，痛無定處;風木壅滯，氣機失調，升降失常，中焦氣阻，風氣相求而生腹脹腹痛;外風化熱侵及腸脂，熱盛則肉腐，肉腐則有膿;風入血，則血隨風走竄，妄行下血。因此，UC屬于中醫(yī)“腸風”等范疇[12]。

關于徐長卿的功效，廣州部隊《常用中草藥手冊》曰：“祛風止痛，解毒消腫，溫經通絡……”《吉林中草藥》曰：“鎮(zhèn)靜止痛，驅寒散瘀，通絡和血……”徐長卿具有祛風化濕、活血通絡止痛之功[1，13]，正切合UC的病機，故可用來治療UC。

夏翔每遇UC，最喜用徐長卿，配合辨證加減，臨床效果良好[1]。陳彤君等[2]予以愈瘍湯（白頭翁、穿山龍、敗醬草、徐長卿、仙鶴草等）口服治療UC療效確切。楊杰等[3]予以“理腸湯”（黨參、薏苡仁、徐長卿、赤石脂、椿根皮、炒白術、白及、訶子、蒲黃、槐花、三七、甘草）口服及“潰瘍靈”保留灌腸治療UC有較好的臨床療效，能夠顯著改善患者的癥狀，促進病變腸道修復。趙方方[4]予以中藥（黃柏、地榆炭、生黃芪、延胡索、白及、徐長卿、三七粉、血竭）保留灌腸治療UC療效較好。宋治學和王琪[5]采用辨證分型用藥及外用灌腸方（青黛、黃柏、黨參、徐長卿、五倍子、枯礬、赤石脂、三七等）治療UC具有提高機體免疫力、恢復腸細胞功能，達到炎癥消失、潰瘍愈合、腹瀉停止的特點。康正祥等[6]用腸安沖劑（生黃芪、杭白菊、徐長卿、煨木香、紅藤）治療TNBS/乙醇法制成的UC模型大鼠，各種癥狀明顯減輕，T淋巴細胞亞群趨以正常，抗氧化能力提高，鏡檢結腸潰瘍與出血點減少。焦君良等[7]用潰結康膠囊（黃精、靈芝、忍冬藤、青黛、徐長卿、白花蛇舌草等）能改善結腸黏膜組織致敏法誘導的UC模型大鼠，療效機制與其免疫調節(jié)和抗自由基的作用有關。我們的前期實驗研究也表明，徐長卿能改善TNBS/乙醇法誘導的結腸炎大鼠體質量、疾病活動指數(shù)（DAI）、結腸大體形態(tài)損傷及組織病理學，降低結腸組織TNF-α、IL-1β水平[8]。

腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應所導致的炎癥反應對UC的發(fā)生發(fā)展起著十分重要的作用。UC腸道特異性免疫細胞、非特異性免疫細胞及非免疫細胞（如上皮細胞、血管內皮細胞等）免疫炎癥反應，釋放一系列炎癥介質和細胞因子，包括TNF、IL-1、IL-5、IL-6、IL-8、花生四烯酸、神經肽、NO、細胞黏附分子等，它們彼此誘生、增減，相互協(xié)同或拮抗，形成復雜的網絡，并逐級擴大和慢性化，使炎癥反應持續(xù)并加重，腸黏膜受損而出現(xiàn)一系列臨床表現(xiàn)[14-15]。

MPO富含于中性粒細胞中，是中性粒細胞的功能和激活標志，其水平及活性變化代表著中性粒細胞的功能和活性狀態(tài)。NOS是NO合成的限速酶，iNOS主要存在于單核/巨噬細胞系統(tǒng)，主要通過生成NO而發(fā)揮其生物學作用，檢測此酶可間接反映NO的水平。本實驗結果顯示，模型組大鼠結腸組織MPO、iNOS活性顯著高于正常組，經徐長卿治療后MPO、iNOS活性顯著降低，且隨徐長卿劑量升高大鼠結腸組織MPO、iNOS活性有降低趨勢。

核因子κB是一類能與多種基因啟動子部位κB位點發(fā)生特異性結合促進轉錄的蛋白質，在炎癥和免疫反應中具有重要作用[16]。炎癥介質、細胞因子、細菌脂多糖等可以激活核因子κB[17-18]，而多種炎癥介質的啟動子部位都有核因子κB位點，它是細胞因子、炎癥介質釋放的關鍵調控因素，是腸道免疫反應中重要的調節(jié)基因，它的激活能夠促進炎癥介質的表達，極大地影響了黏膜炎癥的發(fā)生過程，顯著地誘導了UC的發(fā)生[19-20]。

核因子κB與IκB、核因子κB抑制劑激活酶（Inhibitory Kappa B Kinase，IKK）是核因子κB信號通路的主要分子。靜息狀態(tài)的核因子κB與IκB形成復合物，存在于胞質中。當細胞被激活后，IKK促進IκB磷酸化并與核因子κB解離，釋放核因子κB，游離的核因子κB由細胞質進入細胞核中，與靶DNA結合，促進下游基因的表達。本實驗結果顯示，模型組大鼠結腸組織p-IκBα、胞核核因子κB水平顯著高于正常組，經徐長卿治療后p-IκBα、胞核核因子κB水平顯著降低，且隨徐長卿劑量升高大鼠結腸組織p-IκBα、胞核核因子κB水平有降低趨勢。模型組大鼠結腸組織胞質核因子κB水平顯著低于正常組，經徐長卿治療后胞質核因子κB水平顯著升高，且隨徐長卿劑量升高大鼠結腸組織胞質核因子κB水平有升高趨勢。

綜上所述，徐長卿通過降低TNBS誘導的大鼠結腸炎p-IκBα、胞核核因子κB水平，升高胞質核因子κB水平，抑制核因子κB信號通路的激活，從而降低MPO、iNOS活性，減少炎癥介質的生成，修復腸黏膜。

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（2021-04-25收稿 本文編輯：劉強）