李淑芳，劉繼紅，尹海燕，劉冬梅，郭曉萌，楊亞琴，王會鋒，于永杰

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，河南 鄭州 450002；2.寧夏醫(yī)科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004）

茶樹（Camellia sinensis（L）O.Kamtze.）作為一種特色經(jīng)濟作物，在信陽地區(qū)農(nóng)業(yè)中占據(jù)重要地位。信陽地屬江北茶區(qū)，有10個縣區(qū)產(chǎn)茶，茶園面積廣闊。茶樹品種是茶葉生產(chǎn)中最重要的生產(chǎn)資料，是茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎。受原有茶園面臨老化更新、新建茶園面積不斷增大、采茶機械化需求等因素影響，選育與推廣優(yōu)良無性系茶樹品種成為當前信陽地區(qū)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的緊迫需求［1］。烏牛早、白毫早、舒茶早、平陽特早等茶樹品種因具有出芽早、產(chǎn)量高，以及適制信陽毛尖等特點，近年來在信陽地區(qū)無性系茶園推廣面積不斷擴大［2］。研究這些品種在相同農(nóng)藝措施下的成分差異，對于品種的選育推廣與綜合利用均具有積極意義。

目前已有不少關于信陽茶區(qū)不同茶樹品種的比較研究，主要集中在依據(jù)茶葉中兒茶素、茶多酚、氨基酸、咖啡堿、葉綠素等少數(shù)主要成分的含量與感官鑒定相結合進行茶葉品質(zhì)和適制性的評價與比較［3-6］。然而，茶葉中經(jīng)分離鑒定的已知化合物有700 多種［7］，僅依賴主要成分和感官鑒定評價茶樹品種的優(yōu)劣，缺乏科學全面的量化依據(jù)和精確描述。因此，有待開展能夠全面反映茶葉中化學物質(zhì)信息的茶樹品種差異評價方法的研究。

非靶向代謝組學通過分析盡可能多的代謝物，能夠從整體上反映生物的狀態(tài)。目前，代謝組學主要基于核磁共振和質(zhì)譜分析平臺并結合化學計量學進行代謝差異研究［7-9］。其中，超高效液相色譜聯(lián)用高分辨質(zhì)譜分析（UHPLC-HRMS）平臺在非靶向代謝分析中扮演著重要角色。該平臺通過高精度質(zhì)量數(shù)、保留時間、二級質(zhì)譜等作為定性判據(jù)，為分析海量代謝信息提供了高分辨工具平臺?；赨HPLC-HRMS 的非靶向代謝組學技術為茶葉品種研究提供了新的解決方案［10-14］，如Chen 等［10］采用UPLC-QTOF/MS 及UPLC-QqQ MS 結合化學計量學方法對14 個武夷山巖茶品種進行代謝輪廓分析，完成49 種主要代謝物的相對定量，討論了其在不同茶品種中的分布。Li 等［11］采用基于UHPLC-QTOF/MS 的非靶向代謝組學研究了13 個中國茶樹品種的代謝物差異，將不同茶樹品種分為綠茶適制性品種和兼具綠茶、黑茶適制性品種兩類。Wang 等［13］采用UPLC-Q-TOF/MS 與化學計量學結合分析了信陽毛尖綠茶因品種、種植海拔及加工方式等因素造成的代謝物差異，研究發(fā)現(xiàn)茶樹品種和種植海拔對代謝物差異影響顯著，而機械或手工等加工方式無明顯影響。

茶葉中初級代謝物及二級代謝物化學物質(zhì)構成極為復雜，利用UHPLC-HRMS 對其分析面臨如何高通量、智能化地提取與識別其中的化合物信息等實際難題［15］。于永杰課題組發(fā)展的自動化數(shù)據(jù)分析策略軟件平臺AntDAS［16］集總離子流峰（TIC）讀取、提取離子色譜（EIC）提取、EIC 峰解析、化合物鑒定、多組樣本批處理、化學計量學建模等于一體，能夠?qū)崿F(xiàn)復雜植物樣品中UHPLC-HRMS 數(shù)據(jù)的自動化解析。本研究在該自動化數(shù)據(jù)分析平臺的基礎上，利用基于超高效液相色譜串聯(lián)Q Exactive-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜的非靶向代謝組學技術，結合化學計量學方法，分析了信陽地區(qū)相同農(nóng)藝措施下的烏牛早、舒茶早、白毫早、平陽特早、陜茶一號等5 個茶樹品種鮮葉（一芽一葉）樣本中的化學成分差異。使用層次聚類分析（HCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、熱圖分析等方法評價了不同茶樹品種的化學物質(zhì)基礎差異。研究結果可為茶樹品種的品質(zhì)評價與選育推廣提供理論指導。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000超高效液相色譜串聯(lián)Q Exactive-Orbitrap 靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（UHPLCHRMS，美國賽默飛世爾科技公司）；賽多利斯BS224S 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；艾本森MixOne 漩渦振蕩器（合肥艾本森科學儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；艾本德5810 R 型臺式高速大容量冷凍離心機（德國艾本德股份公司）；5 mL離心管（合肥白鯊生物科技有限公司），2 mL離心管（愛思進生物技術（杭州）有限公司）；Retsch MM400混合冷凍混合球磨儀（德國萊馳公司）。

甲醇（質(zhì)譜級，德國默克股份兩合公司）；乙腈（色譜純，德國默克股份兩合公司）；甲酸（98% ~100%，質(zhì)譜級，德國默克股份兩合公司）。高純水通過Milli-Q凈水系統(tǒng)獲得。

1.2 樣本采集與制備

烏牛早、舒茶早、白毫早、平陽特早、陜茶一號等茶樹品種的一芽一葉鮮葉采摘于信陽市農(nóng)業(yè)科學院五里店茶葉示范園（東經(jīng)114°17′60″，北緯32°9′8″，海拔60 m），5個茶樹品種的栽種時間、生長環(huán)境及管理措施一致。分別于2019 年4 月3 日（清明前）、2019 年4 月16 日（谷雨前）、2019 年5 月6 日（立夏）3 個時間采樣，每次采樣各品種的樣品均設有3 個生物學重復。新鮮茶葉經(jīng)液氮處理后使用Retsch MM400球磨儀磨碎，經(jīng)低溫凍干后研磨成粉并于-80 ℃環(huán)境避光保存?zhèn)溆?。?5份茶葉粉末樣本中各取出0.5 g混合均勻制備成質(zhì)量控制樣品（QC）。

1.3 樣本分析

在張茜等［14］研究工作的基礎上建立了基于UHPLC-Q Exactive 高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴模式（DDA）的新鮮茶葉分析方法。

1.3.1 樣本前處理精密稱量茶葉樣品60.0 mg，置于5 mL 離心管中，加入4.5 mL 甲醇-水（1∶9，體積比）混合提取溶劑，充分渦旋2 min 后，在室溫下超聲提取30 min，隨后于4 500 r/min 下高速離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至2 mL EP管重復離心1次，在12 000 r/min下高速離心10 min。最后吸取EP管中上清液0.8 mL于進樣色譜瓶中，待高分辨質(zhì)譜上機分析。

1.3.2 UHPLC-HRMS儀器分析條件液相色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；進樣體積為1 μL；流動相A：高純水（含0.1%甲酸），流動相B：乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.2 mL/min，梯度洗脫程序：0 ~ 10 min，0% ~ 30% B；10~ 15 min，30%~90%B；15~17 min，90%~100%B；17~20 min，100%B；20.5~25.5 min，0%B。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源，選擇正離子掃描模式（ESI+），噴霧電壓為3 500 V，離子傳輸毛細管溫度為320 ℃，鞘氣（氮氣）氣體流量為30 arb，輔助氣（氮氣）氣體流量為10 arb。采用FULL MS/DD-MS2（TOP4）模式完成數(shù)據(jù)采集。一級質(zhì)譜分辨率為35 000 FWHM（半峰寬），自動增益控制（AGC）為5×106，最大注入時間為100 ms，掃描范圍為120~1 000 Da；二級碎裂方式選擇高能碰撞誘導裂解模式（HCD），碰撞能量為20 eV，分辨率為17 500 FWHM，自動增益控制（AGC）為5×106，最大注入時間為25 ms，隔離窗口為0.4 Da，動態(tài)排除時間為4.5 s。

1.4 UHPLC-HRMS數(shù)據(jù)分析

UHPLC-HRMS 原始數(shù)據(jù)采集通過Xcalibar（Thermo Fisher Scientific）獲得。新鮮茶葉樣品在ESI +模式下采用UHPLC-HRMS 代謝組學分析的典型TIC 圖如圖1 所示。將原始數(shù)據(jù)導入AntDAS 分析軟件平臺中，自動執(zhí)行EIC 峰提取、峰對齊、化合物注冊等步驟，獲得化合物樣本×峰面積的注冊表，利用方差分析（ANOVA）篩查具有差異性的成分及其MS/MS 譜圖，并與標準譜庫比對實現(xiàn)化合物鑒別。利用差異性成分進行HCA、PLS-DA 及熱圖分析評價不同茶樹品種的化學成分變化。本研究中，差異化合物篩選條件為p＜0.01，HCA 分析采用歐氏距離進行距離分析。上述數(shù)據(jù)分析均在AntDAS中完成。

圖1 茶鮮葉在正離子模式下的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of a fresh tea leaves under the positive mode

2 結果與討論

2.1 AntDAS平臺中化合物色譜峰的自動化提取

將儀器采集的UHPLC-HRMS 原始數(shù)據(jù)直接導入AntDAS 進行色譜峰的自動化提取。以QC 樣本為例，經(jīng)AntDAS 解析后獲得樣本中EIC 峰為9 066 個。圖2 給出了AntDAS 提取其中一個EIC（m/z291.085 5）下所有色譜峰的示例。經(jīng)AntDAS 解析后，共提取出8 個色譜峰，包括2個信號強度較高的色譜峰（4號、6號）和6個強度較低的色譜峰（見圖2A）。圖2B 和2C 給出了強度較低的色譜峰的局部放大圖?？梢姡珹ntDAS 能夠?qū)崿F(xiàn)化合物信息和儀器背景噪聲的有效識別，完成EIC 中色譜峰的高質(zhì)量提取。

圖2 AntDAS提取EIC中色譜峰的示例Fig.2 IllustrationofEICpeakextractionintheAntDAS

2.2 不同品種茶鮮葉的HCA和PLS-DA分析

采用ANOVA 分析色譜峰注冊表，最終獲得不同品種茶樹鮮葉樣品中具有顯著差異性的色譜峰17 691 個。以篩選出來的所有差異性色譜峰為基礎，利用化學計量學方法HCA 和PLS-DA 對不同茶樹品種的鮮葉樣本進行分析，結果見圖3。HCA 分析結果（圖3A）表明，5個茶樹品種能夠各自聚成一類，其中，烏牛早、舒茶早、白毫早3 個品種更為相似。PLS-DA 分析給出了類似結果（圖3B），樣本在前兩個隱變量的得分圖顯示烏牛早、舒茶早、白毫早3個品種較為接近，平陽特早、陜茶一號與其它品種存在明顯不同。圖3結果表明，在相同的生長環(huán)境和農(nóng)藝措施下，5種茶樹品種各具特色，不同茶樹品種獲得的新鮮茶葉存在明顯差異。品種間的分析結果顯示烏牛早、舒茶早、白毫早整體上更為接近，與平陽特早和陜茶一號存在較大差異。

圖3 不同茶樹品種的HCA（A）和PLS-DA（B）分析結果Fig.3 HCA（A）and PLS-DA（B）analysis results of different tea cultivars

2.3 不同品種茶鮮葉中差異性代謝物的鑒別

AntDAS對具有顯著性差異的色譜峰進行碎片離子識別后，將解析得到化合物的一級、二級質(zhì)譜與第三方公開的數(shù)據(jù)庫（http：//prime. psc. riken. jp/compms/msdial/main. htmL）中的標準譜圖進行逐一比對，從而實現(xiàn)化合物的鑒定。圖4 以表兒茶素為例給出了本研究中差異代謝物的鑒別過程。經(jīng)過AntDAS 解析后，獲得具有差異性的EIC 峰如m/z139.038 5、291.085 2 等。AntDAS 對這些離子的EIC峰形（圖4A）進行相似度計算后將其識別為可能來自同一個成分的碎片離子，并構建了化合物的一級、二級質(zhì)譜譜圖（圖4B1、B2）。分別將一級、二級質(zhì)譜譜圖與化合物數(shù)據(jù)庫中的譜圖進行比對，發(fā)現(xiàn)表兒茶素的質(zhì)譜相似度最高（圖4B1、B2）?；谏鲜龌衔镨b別流程，本研究鑒定出33種差異性化合物（見表1），包括可可堿1種生物堿類物質(zhì)，表兒茶素、表沒食子兒茶素、（-）-表阿夫兒茶精3種兒茶素類物質(zhì)，綠原酸、沒食子酸等4種酚酸類物質(zhì)，茶氨酸、精氨酸、L-苯丙氨酸等5種氨基酸類物質(zhì)，腺苷酸、5-脫氧-5-甲硫腺苷等6種核苷類物質(zhì)，牡荊素、柚皮苷、蘆丁等14種黃酮類物質(zhì)。

圖4 利用AntDAS進行代謝物鑒別過程示例Fig.4 Illustration of the compound identification process by AntDAS

表1 AntDAS鑒定出的33種差異性代謝物Table1 The identified 33 significant difference compounds by AntDAS

（續(xù)表1）

2.4 不同品種茶鮮葉的熱圖分析

根據(jù)33 種差異性化合物的相對豐度進行熱圖分析（見圖5）。結果顯示，在相同的生長環(huán)境和農(nóng)藝措施下，不同茶樹品種的代謝物含量存在明顯差異，各具特色。其中，烏牛早中表沒食子兒茶素以及異槲皮素、蘆丁、香橙素、柚皮素、柚皮苷、槲皮素-3-D-木糖苷、金絲桃苷等8 種黃酮類化合物的含量較高；舒茶早中表兒茶素、（-）-表阿夫兒茶精、酪氨酸、甲硫腺苷及S-腺苷高半胱氨酸等化合物的含量較高；白毫早中對羥基肉桂酸、3-羥基肉桂酸、色氨酸等化合物的含量較高；平陽特早中茶氨酸、精氨酸、S-腺苷蛋氨酸、牡荊素等化合物的含量較高；陜茶一號中可可堿、綠原酸、沒食子酸、紫云英苷、煙花苷、棉花皮苷等化合物的含量較高。整體上，烏牛早品種中黃酮類含量高，舒茶早品種中兒茶素及核苷含量高，白毫早品種中酚酸類含量高，陜茶一號品種中生物堿、酚酸、黃酮類含量高。本研究對差異化合物含量的比較中，部分結果與文獻報道一致，如Wang等［12］指出不同品種茶鮮葉中不僅兒茶素有明顯差異，其他如氨基酸、黃酮及其糖苷、酚酸及生物堿等不突出的植物化學物質(zhì)亦有明顯不同；王子浩等［5］對9個茶樹加工白茶的研究指出，舒茶早中兒茶素的含量高于白毫早、烏牛早、平陽特早；劉冬梅等［6］對4個信陽主栽茶樹品種的適制性研究指出烏牛早中茶氨酸的含量低于白毫早。

圖5 信陽地區(qū)5個茶樹品種差異性化合物的熱圖分析Fig.5 Heatmap of significant difference compounds in five tea cultivars planted in Xinyang the number denoted was the same as that in Table 1

3 結 論

本文采用基于UHPLC-HRMS 的非靶向代謝組學技術對信陽地區(qū)5 個茶樹品種鮮葉樣品中的差異性化合物進行了研究。將基于UHPLC-HRMS 的非靶向代謝組學技術與化學計量學數(shù)據(jù)自動化解析軟件平臺相結合，對茶鮮葉樣品中的化合物信息進行剖析，經(jīng)與標準數(shù)據(jù)庫匹配后最終鑒別出不同茶樹品種中具有顯著性差異的33種化合物，包括表兒茶素、茶氨酸、可可堿、綠原酸、腺嘌呤、金絲桃苷等。采用化學計量學方法進行聚類分析和熱圖分析，評價了在相同的生長環(huán)境和農(nóng)藝措施下不同茶樹品種的化學物質(zhì)基礎差別。本研究為不同茶樹品種的差異性分析提供了一種新的研究策略，有望為茶葉產(chǎn)區(qū)品種選育與推廣研究提供理論支撐。