帥文苑，何慶華，鐘引鳳，黃云祥，張 航，劉傳勇，張樂(lè)平，涂 追*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031；4.江西省現(xiàn)代分析科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330031）

黃曲霉毒素B1（AFB1）是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物［1-2］，主要存在于發(fā)霉的花生、玉米、大米等農(nóng)產(chǎn)品中［3-4］，AFB1具有致癌性、致突變性、致毒性等，已被世界衛(wèi)生組織的癌癥機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類(lèi)致癌物。目前，檢測(cè)農(nóng)作物中AFB1的方法包括高效液相色譜法（HPLC）［5-6］、免疫傳感器法［7］、免疫層析法（ICA）［8-9］、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［10-11］等。免疫學(xué)檢測(cè)方法基于抗體與抗原特異性結(jié)合，具有簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度及高通量等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有的AFB1免疫學(xué)檢測(cè)方法采用的抗體主要有單克隆抗體、單鏈抗體等，然而單克隆抗體的制備較為繁瑣，細(xì)胞培養(yǎng)及儲(chǔ)存環(huán)境要求嚴(yán)格；單鏈抗體表達(dá)量低且常以包涵體的形式存在，應(yīng)用受到一定的限制［12］。納米抗體是通過(guò)克隆重鏈抗體的可變區(qū)并表達(dá)得到由一個(gè)重鏈抗體可變區(qū)構(gòu)成的單域抗體（Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，VHH）［13］，具有與原重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及抗原結(jié)合活性，是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位，具有水溶性高，溫度及pH耐受性好等優(yōu)點(diǎn)。納米抗體由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，適合于原核（如大腸桿菌）和真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)，易于獲得，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療［14］、診斷［15］、免疫分析［16］等領(lǐng)域。

增加免疫學(xué)檢測(cè)方法中識(shí)別元件對(duì)待檢物的親和活性是提高檢測(cè)靈敏度的主要途徑之一［17］。已有研究表明，相比于單價(jià)納米抗體，多價(jià)抗體形式具有更高的表觀親和力，有望建立靈敏度更高的免疫學(xué)檢測(cè)方法［18-19］。本課題組前期從羊駝免疫庫(kù)中篩選獲得了針對(duì)黃曲霉毒素B1的納米抗體（命名為G8），并將其應(yīng)用于黃曲霉毒素的ELISA 檢測(cè)以及樣品前處理［20］。本研究以前期獲得的抗AFB1納米抗體G8為研究對(duì)象，利用納米抗體分子量小，易于基因操作、原核表達(dá)的特點(diǎn)，通過(guò)串聯(lián)融合表達(dá)的方法，構(gòu)建了單價(jià)以及多價(jià)納米抗體串聯(lián)體，并分別與綠色熒光蛋白（GFP）編碼片段融合，研究了多價(jià)化及融合表達(dá)對(duì)重組蛋白生物活性的影響，為后續(xù)建立基于熒光信號(hào)的免疫學(xué)檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也可為優(yōu)化免疫學(xué)檢測(cè)中納米抗體親和活性提供了借鑒和思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varioskan LUX 多功能讀數(shù)儀（美國(guó)Thermo 公司）；ZHWY-2102C 恒溫?fù)u床（中科院武漢科學(xué)儀器廠）；JY92-ⅡDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；LAS 500 凝膠成像儀（BIO-RAD公司）；DYY-8C 電泳儀（北京六一儀器廠）；Nanodrop 1000 超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo 公司）；DHG-9101·DSA 恒溫培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；T100TMPCR 擴(kuò)增儀（BIO-RAD 公司）；NK-420 電熱恒溫水箱（常州諾基儀器有限公司）；YLC-100 干式恒溫器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；Sorvall Stratos低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）。

含單價(jià)以及二價(jià)、三價(jià)抗AFB1納米抗體的質(zhì)粒pET30-G8、pET30-DiG8、pET30-TriG8，含綠色熒光蛋白的質(zhì)粒PMCSG18hRahs-GFP，大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；人工抗原AFB1-BSA 由本實(shí)驗(yàn)室制備［21］；氯化鈉（NaCl）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、氯化鉀（KCl）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）均為分析純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技公司；Lysis 平衡緩沖液（LE Buffer：50 mmol/L Na2HPO4，0.3 mol/L NaCl，pH 8.0）；磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mmol/L PBS：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4）；含0.05%吐溫-20 的0.01 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBST）；卡那霉素（Kana）、異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自索萊寶公司；限制性?xún)?nèi)切酶SfiⅠ、NotⅠ、NdeⅠ，T4DNA 連接酶（TakaRa 公司）；HRP 標(biāo)記His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體（Proteintech）、Ni2+-NTA 親和層析（金斯瑞生物科技）；DNA 片段純化試劑盒（MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0）（貨號(hào)9716）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）（貨號(hào)9762）（TakaRa 公司）；質(zhì)粒產(chǎn)物小提試劑盒（DP103-02，天根公司）；經(jīng)PAGE 純化的引物由金斯瑞生物科技公司合成（見(jiàn)表1）。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30-G8-GFP、pET30-DiG8-GFP、pET30-TriG8-GFP 的構(gòu)建方法如圖1 所示。經(jīng)引物（G8-F0、G8-R0）獲得G8 編碼片段，限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ和SfiⅠ將編碼G8的基因克隆至載體pET30以獲得載體pET30-G8。DiG8、TriG8通過(guò)含有編碼柔性linker（GGSGG）的引物（G8-F1、G8-R1）及引物G8-F0、G8-R0 進(jìn)行重疊延伸PCR（overlap PCR）而得，同樣經(jīng)由限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ和SfiⅠ構(gòu)建得到載體pET30-DiG8、pET30-TriG8。pET30-G8、pET30-DiG8、pET30-TriG8和由引物（F0、R0）擴(kuò)增得到的GFP編碼片段，用SfiⅠ和NotⅠ分別進(jìn)行雙酶切，試劑盒回收上述酶切片段。將純化得到的載體與目的片段按1∶3的摩爾比用T4DNA連接酶于16 ℃孵育過(guò)夜，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL 卡那霉素的LB（LBKana）平板，37 ℃培養(yǎng)12 h。采用引物T7 prom和T7 term對(duì)單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后再進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，雙酶切與預(yù)期相符的克隆送至南京金斯瑞生物科技公司測(cè)序。

圖1 抗AFB1納米抗體融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic of construction of anti-aflatoxin B1 nanobody fusion protein expression vector

1.2.2 納米抗體的融合表達(dá)及純化經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確的重組表達(dá)載體pET30-G8-GFP、pET30-DiG8-GFP、pET30-TriG8-GFP，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB（LB-Kana）平板，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取平板中的單菌落接種于含卡那霉素的5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床220 r/min 培養(yǎng)12 h；上述菌液按1%的比例接種于1 L LB-Kana 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床220 r/min 培養(yǎng)至OD600值為0.6 ~ 0.8（約2~3 h）；上述培養(yǎng)液中加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol/L，18 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)培養(yǎng)。將誘導(dǎo)培養(yǎng)物6 500 r/min離心15 min，棄上清，收集菌體；1/10體積的LE 緩沖液重懸菌體，冰浴中超聲波破碎菌體至澄清，破碎后的菌體于6 500 r/min 條件下離心20 min，分別收集破碎上清和沉淀。采用Ni2+-NTA 親和層析純化融合蛋白，SDS-PAGE 分析蛋白表達(dá)及純化情況。

1.2.3 未融合、單價(jià)及多價(jià)納米抗體的活性分析采用間接ELISA 分析重組蛋白與人工抗原的結(jié)合活性。將溶于PBS（pH 7.4）的人工抗原AFB1-BSA 以100 μL/孔加至酶標(biāo)孔中，4 ℃包被過(guò)夜；PBST 洗板3次，加入5%脫脂牛奶，300 μL/孔，37 ℃封閉2 h；PBST 洗板3次，加入100 μL/孔重組蛋白G8（未融合、單價(jià)及多價(jià)），37 ℃孵育1 h；PBST 洗板3 次，加入100 μL/孔HRP 標(biāo)記His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體，37 ℃孵育1 h；PBST 洗板3 次，加入100 μL/孔TMB 底物顯色液，37 ℃孵育10 min；加入50 μL/孔2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀中測(cè)定OD450值。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 與間接ELISA 步驟基本相同，但在加入重組蛋白G8 時(shí)，應(yīng)同時(shí)加入50 μL/孔重組蛋白G8（未融合、單價(jià)及多價(jià)）及50 μL/孔AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.20、0 ng/mL）進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。

1.2.4 重組蛋白的熒光檢測(cè)在酶標(biāo)板中分別加入相同濃度重組蛋白（G8-GFP、DiG8-GFP、TriG8-GFP）200 μL，放入多功能讀數(shù)儀中，于熒光光譜模式下先設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為472 nm，掃描490~650 nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜；再設(shè)定發(fā)射波長(zhǎng)為507 nm，掃描350~490 nm范圍內(nèi)的激發(fā)光譜，繪制激發(fā)及發(fā)射光譜圖，并分別記錄其最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，及對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用通用引物分別進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果顯示獲得了符合預(yù)期大小的基因片段（圖2A）。將菌落PCR陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒，pET30-G8-GFP、pET30-DiG8-GFP和pET30-TriG8-GFP 三種重組質(zhì)粒經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切驗(yàn)證后均出現(xiàn)兩條帶，酶切后的3種載體片段5 633 bp、6 026 bp、6 419 bp和GFP基因片段745 bp與預(yù)期相符（圖2B），經(jīng)DNA測(cè)序證明三種表達(dá)載體構(gòu)建正確。

圖2 菌落PCR驗(yàn)證及重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of colony PCR and double digestion of recombinant plasmid by agarose gel electrophoresis

2.2 融合蛋白的表達(dá)與純化

將三種重組質(zhì)粒pET30-G8-GFP、pET30-DiG8-GFP、pET30-TriG8-GFP 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3），經(jīng)終濃度為0.5 mmol/L IPTG于18 ℃條件誘導(dǎo)表達(dá)12 h，分別收集誘導(dǎo)前后的菌體。SDS-PAGE顯示，三種蛋白均可在大腸桿菌BL21（DE3）中可溶性表達(dá)，且經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化得到的蛋白G8-GFP、DiG8-GFP、TriG8-GFP 的條帶位置與預(yù)期分子量42.87、57.24、70.57 kDa大小保持一致。經(jīng)試劑盒定量，三種蛋白的表達(dá)量分別為6.0、7.5、4.0 mg/L，且本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件如誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG 濃度等有望進(jìn)一步提高表達(dá)量［20］。三種蛋白在表達(dá)過(guò)程中，融合蛋白G8-GFP 與DiG8-GFP 可溶性表達(dá)較多，易于破碎；而融合蛋白TriG8-GFP 包涵體表達(dá)占多數(shù)，較難破碎，推測(cè)由于該融合蛋白的分子量較大，蛋白在折疊過(guò)程中易以聚集形式表達(dá)形成包涵體，可溶性表達(dá)低，由此可以推測(cè)多價(jià)納米抗體串聯(lián)數(shù)目較多時(shí)，較難獲得可溶性蛋白。

圖3 三種融合蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression and purifi?cation of three fusion proteins

2.3 單價(jià)及多價(jià)納米抗體的活性分析

采用間接ELISA對(duì)三種融合蛋白的結(jié)合活性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示三種融合蛋白（G8-GFP，DiG8-GFP，TriG8-GFP）均能特異性結(jié)合人工抗原AFB1-BSA，說(shuō)明納米抗體在多價(jià)化后仍然保持抗原識(shí)別活性（圖4）。經(jīng)方陣滴定，確定人工抗原AFB1-BSA的工作濃度為2.5 μg/mL，融合蛋白G8、G8-GFP、DiG8-GFP 以及TriG8-GFP 的最佳工作濃度分別為0.5、2.125、3.125、8.90 μg/mL。

以AFB1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，結(jié)果表明，G8、G8-GFP 以及DiG8-GFP 建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 的IC50分別為12.10、14.10、2.19 ng/mL，提示單價(jià)融合蛋白IC50與未融合蛋白相似，雙價(jià)融合蛋白IC50較未融合蛋白提高了5.5倍（圖5）。三價(jià)融合蛋白TriG8-GFP的靈敏度降低，與標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)趨勢(shì)不明顯，未能計(jì)算得到IC50值（圖5），該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期工作相吻合［22］，推測(cè)可能是該融合方式對(duì)蛋白表達(dá)與折疊存在一定的影響。He 等［23］通過(guò)柔性連接子Linker（G4S）3共15個(gè)氨基酸構(gòu)建多價(jià)納米抗體，將其生物素化并固定在鏈霉親和素衍生的細(xì)菌磁性納米顆粒上，用于檢測(cè)四溴雙酚A，結(jié)果顯示多價(jià)納米體的結(jié)合活性由高到低依次為：三價(jià)、二價(jià)、一價(jià)。本研究構(gòu)建的多價(jià)納米體同樣采用了柔性Linker，然而長(zhǎng)度僅為前者的三分之一，提示納米抗體的連接方式對(duì)活性有較大的影響。融合GFP蛋白的ELISA 數(shù)據(jù)偏差較未融合GFP 更大，且背景吸附值較高（圖4、5），ELISA 的條件有待進(jìn)一步優(yōu)化以降低背景吸附和提高精密度。TriG8-GFP 由4 個(gè)串聯(lián)的結(jié)構(gòu)域組成，在表達(dá)過(guò)程中可能未完全正確折疊，導(dǎo)致非特異性吸附而不能被標(biāo)準(zhǔn)品阻斷。

圖4 間接ELISA分析3種融合蛋白的活性Fig.4 Bioactivity analysis of three fusion proteins by indirect ELISA

圖5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析G8、G8-GFP、DiG8-GFP及TriG8-GFP的活性Fig.5 Indirect competitive ELISA of bioactivity analysis of G8，G8-GFP，DiG8-GFP and TriG8-GFP

2.4 重組蛋白的熒光檢測(cè)

同一濃度（0.70 mg/mL）三種融合蛋白（G8-GFP、DiG8-GFP、TriG8-GFP）的熒光光譜如圖6 所示。三種融合蛋白的最大激發(fā)波長(zhǎng)均在472 nm左右，最大發(fā)射波長(zhǎng)均在507 nm左右，與GFP相比最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)未發(fā)生改變。融合蛋白G8-GFP 與DiG8-GFP 的熒光強(qiáng)度均在3 000 及以上，與GFP相當(dāng)且DiG8-GFP 表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度，而融合蛋白TriG8-GFP 的熒光強(qiáng)度僅在1 700 左右，相對(duì)熒光強(qiáng)度最弱（圖6）。在表達(dá)過(guò)程中，推測(cè)三價(jià)串聯(lián)的納米抗體的融合蛋白TriG8-GFP的分子量較大，納米抗體與熒光蛋白在表達(dá)過(guò)程中未能正確折疊，使得其熒光強(qiáng)度降低。由此推測(cè)，三價(jià)納米抗體串聯(lián)與熒光蛋白融合表達(dá)可能會(huì)影響其熒光活性，從而對(duì)基于熒光活性的免疫學(xué)檢測(cè)存在一定干擾。

圖6 三種融合蛋白的激發(fā)及發(fā)射光譜圖Fig.6 Excitation and emission spectra of three fusion proteins

3 結(jié) 論

納米抗體因其特殊結(jié)構(gòu)可在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行高效可溶性表達(dá)，且串聯(lián)后重組蛋白仍能可溶性表達(dá)。本研究以針對(duì)AFB1的納米抗體和GFP 建立了研究模型，單價(jià)融合蛋白與未融合納米抗體G8 相比結(jié)合活性并未顯示較大差異，而雙價(jià)納米抗體與重組蛋白G8相比IC50提高了5.5 倍，且融合后GFP 的熒光強(qiáng)度及最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)并未發(fā)生改變，同時(shí)二價(jià)融合蛋白熒光活性表現(xiàn)較高，表明通過(guò)串聯(lián)方式獲得的針對(duì)AFB1二價(jià)納米抗體的結(jié)合活性和熒光活性均較好。納米抗體多價(jià)化的方式主要包括聚集體形式、串聯(lián)表達(dá)等。本研究采用納米抗體直接串聯(lián)多價(jià)化方式，獲得的二價(jià)納米抗體與熒光蛋白的融合活性較好，為后續(xù)建立熒光免疫檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)，具有一定的應(yīng)用前景。