魏 丹，張 菊，國 明

（1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061；2.浙江省化工研究院有限公司分析測試中心，浙江 杭州 310023）

抗生素作為一種基礎(chǔ)用藥，在各種常見的細(xì)菌性疾病治療中發(fā)揮了重要作用［1］，已廣泛應(yīng)用于臨床、畜牧和水產(chǎn)等領(lǐng)域［2］。但由于長期不合理使用并不斷排放進(jìn)入環(huán)境，大多數(shù)抗生素會沉積或遷移到水體、沉積物和土壤等環(huán)境介質(zhì)形成污染，影響環(huán)境中微生物的生態(tài)平衡。目前，抗生素在我國河流、地下水、湖泊和海洋等天然水體中均有不同程度的檢出［3］。該類藥物進(jìn)入環(huán)境后難分解，可通過飲用水、食物鏈等方式進(jìn)入人體，對人體健康造成潛在的風(fēng)險。因此，建立準(zhǔn)確、靈敏、可靠的檢測該類抗生素殘留含量的分析方法十分必要。

水體中抗生素殘留常用的檢測方法主要有毛細(xì)管電泳法（CE）［4］、高效液相色譜法（HPLC）［5］、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）［6］等。其中HPLC-MS 法具有靈敏高效、快速準(zhǔn)確和專屬性強(qiáng)等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于抗生素殘留分析［7］。由于水體中抗生素的濃度極低，且存在大量干擾物，在儀器檢測前通常需對待測物進(jìn)行分離和富集。目前用于環(huán)境水體中抗生素的樣品前處理技術(shù)主要有固相萃?。⊿PE）［7］、磁性固相萃取（MSPE）［8］、QuEChERS［9］等。QuEChERS適用于多種抗生素的檢測，操作簡便，分析快速，但其選擇性吸附效果和凈化效果比SPE 差。MSPE 是以磁性材料為吸附劑的一種新型SPE，與傳統(tǒng)SPE相比，MSPE具有前處理步驟簡單、有機(jī)溶劑消耗少、目標(biāo)物回收率較高、樣品不易損失等優(yōu)點(diǎn)，已被用于抗生素的檢測中［10-11］。目前關(guān)于抗生素藥物MSPE 萃取的研究報道通常采用一種磁性材料，與目標(biāo)物相互作用的活性位點(diǎn)較為單一，很難滿足多種類目標(biāo)物同時測定的檢測要求［12-15］。采用混合吸附劑進(jìn)行萃取可有效提高對不同種類待測物的萃取能力［16］，但基于混合吸附劑的樣品前處理方法在抗生素檢測中的應(yīng)用鮮有報道。

為滿足水中多種類抗生素的同時測定需求，提高對不同目標(biāo)物的萃取能力，本研究通過制備磁性大孔有機(jī)共聚物材料（Fe3O4@SiO2@PLS）和磁性金屬有機(jī)骨架材料（Fe3O4@ZIF-8），將兩種材料共同作為磁性吸附劑，通過優(yōu)化磁性萃取劑用量、吸附時間、樣品pH 值、洗脫劑種類和洗脫時間等實(shí)驗(yàn)條件，建立了檢測實(shí)際水樣中常見的4種磺胺類和8種喹諾酮類抗生素的MSPE/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 infinity 高效液相色譜-6460 Triple Quad 質(zhì)譜儀（帶自動進(jìn)樣器，美國Agilent 公司）；ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm × 3.0 mm，1.8 μm，美國Agilent 公司）；Milli-Q 超純水器（美國Millipore 公司）；0.22 μm 微孔濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；KQ-100DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；S-4700型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，日本Hitachi公司）；傅里葉變換紅外光譜分析儀（FT-IR，德國Bruker公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：磺胺吡啶、馬波沙星、磺胺二甲基嘧啶、氟羅沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、奧比沙星、磺胺異唑、磺胺多辛、喹酸、萘啶酸（純度均≥95%，北京迪馬科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司）；其他試劑均為分析純；乙二醇、二氯甲烷、甲酸、乙酸、氨水等（分析純，杭州雙林化工試劑廠）；三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、2-甲基咪唑、硝酸鋅（Zn（NO3）2）、正硅酸乙酯（TEOS）、二乙烯基苯（DVB）、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）、偶氮二異丁腈（AIBN）、甲基丙烯酸3-（三甲氧基硅基）丙酯（MPS）（Sigma Aldrich 試劑公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm），由Millipore 超純水發(fā)生器制備。

1.2 溶液配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.100 0 g 于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到1 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。使用時，用水稀釋至所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 磁性凈化材料的制備

首先，采用溶劑熱法制備Fe3O4納米顆粒［17］，用于后續(xù)制備Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8。

1.3.1 Fe3O4@SiO2@PLS 的制備參照文獻(xiàn)［18］方法，使用硅烷化試劑TEOS 在Fe3O4表面形成硅層得到Fe3O4@SiO2，然后加入MPS，通過溶膠-凝膠法與Fe3O4@SiO2表面形成雙鍵基團(tuán)，得到Fe3O4@SiO2@MPS。

稱取3 g Fe3O4@SiO2@MPS 置于1 000 mL 三口燒瓶中，加入500 mL 乙腈，超聲10 min，依次加入6.3 mL DVB、7.5 mL NVP 和0.18 g AIBN，超聲5 min 分散均勻，將燒瓶轉(zhuǎn)移至蒸餾裝置中，收集乙腈，于75 ℃預(yù)聚合反應(yīng)20 min，115 ℃聚合反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后靜置冷卻至室溫，加入蒸餾收集到的乙腈（約150～200 mL），超聲分散后，在外加磁場作用下收集沉淀物，依次用乙腈和乙醇清洗3次，于室溫（25 ℃）干燥，即得核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@SiO2@PLS。

1.3.2 Fe3O4@ZIF-8 的制備通過低溫水熱法制備Fe3O4@ZIF-8［19］。具體步驟為：稱取0.5 g Fe3O4納米粒子置于燒杯中，加入50 mL 甲醇，攪拌至分散均勻，加入50 mL 2-甲基咪唑甲醇（0.609 mmol·L-1），攪拌至混合均勻。加入50 mL Zn（NO3）2·6H2O 甲醇溶液（0.084 mmol·L-1），轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，70 ℃下水熱反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，使用磁鐵分離收集沉淀物，用水和乙醇交替沖洗3次至近中性，所得黑色粉末于60 ℃真空條件下干燥6 h。

1.4 混合吸附劑MSPE萃取

采集的水樣經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾去除懸浮顆粒物，加入HAc 和NH3·H2O 調(diào)至pH 7.0。稱取磁性材料Fe3O4@SiO2@PLS（35 mg）和Fe3O4@ZIF-8（15 mg）置于50 mL 燒杯中，依次用甲醇、去離子水清洗和活化，然后加入10 mL水樣或混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/L），超聲10 min加速對目標(biāo)物的吸附；用磁鐵將磁性吸附劑分離收集在燒杯底部，棄去上清液。加入10 mL 5%（體積分?jǐn)?shù)）氨水甲醇溶液超聲5 min，分3次重復(fù)進(jìn)行洗脫，合并洗脫溶液在N2下吹至近干，然后溶于1 mL 水中，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，待HPLC-MS/MS分析。萃取流程如圖1所示。

圖1 混合模式MSPE示意圖Fig.1 Schematic illustration for mixed mode magnetic solid phase extraction

1.5 儀器條件

液相色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm × 3.0 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃，流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：2 μL；流動相為甲醇（A）和0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～1 min，10% A；1～7 min，10%～40% A；7～10 min，40%～60% A；10～11 min，60%～90%A；11～12 min，90%～10%A，分析時間15 min。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子化源（ESI），采用正離子檢測模式；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行定量分析。干燥氣（N2）溫度為300 ℃，干燥氣流速為5 L·min-1；霧化氣（N2）壓力為310 kPa；鞘氣（N2）溫度為250 ℃，鞘氣流速為10 L·min-1；毛細(xì)管電壓為4 500 V，噴嘴電壓為0 V。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 12種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the 12 antibiotics residues

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性凈化材料的表征

Fe3O4、Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8的掃描電鏡圖見圖2。采用溶劑熱法制備的Fe3O4磁性納米顆粒呈規(guī)則的球形，表面相對光滑，顆粒形狀大小較為均勻，具有較大的比表面積（圖2A）。由雙層復(fù)合核殼結(jié)構(gòu)Fe3O4@SiO2@PLS 的掃描電鏡（圖2B）可見，復(fù)合物呈較規(guī)則的球形，尺寸約為500～600 nm，且未見Fe3O4納米顆粒，表明核殼結(jié)構(gòu)Fe3O4@SiO2@PLS 磁性納米材料制備成功。由圖2C 可以看出Fe3O4成功附著于正六邊形ZIF-8 晶體表面，尺寸約為200 nm，表明Fe3O4@ZIF-8 磁性納米材料制備成功。

圖2 Fe3O4（A）、Fe3O4@SiO2@PLS（B）和Fe3O4@ZIF-8（C）的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of Fe3O4（A），F(xiàn)e3O4@SiO2@PLS（B）and Fe3O4@ZIF-8（C）

采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）對Fe3O4@SiO2@PLS 和Fe3O4@ZIF-8 進(jìn)行表征，如圖3A 所示，580 cm-1的特征吸收峰對應(yīng)Fe3O4的Fe—O—Fe 伸縮振動［20］，1 068.0 cm-1的峰對應(yīng)Si—O—Si 基團(tuán)的面內(nèi)伸縮振動［21］，1 634.4、3 436.5 cm-1的峰分別對應(yīng)Si—OH 的彎曲振動和伸縮振動［22］。圖3A 中同時包括Fe3O4和PLS 材料的特征吸收峰，進(jìn)一步表明PLS 成功包覆于磁性粒子Fe3O4表面。如圖3B 所示，422.8 cm-1的峰對應(yīng)Zn—N 的伸縮振動，說明Zn2+與2-甲基咪唑結(jié)合，588.9 cm-1的特征吸收峰對應(yīng)磁核的Fe—O—Fe 伸縮振動，1 384.1 cm-1的特征吸收峰對應(yīng)ZIF-8 中咪唑環(huán)的伸縮振動，1 569.8 cm-1的吸收峰是由于ZIF-8 結(jié)構(gòu)中咪唑分子C===== N 的伸縮振動引起［23］，3 434.0 cm-1的吸收峰是由于Fe3O4的—OH 伸縮振動引起［24］，圖3B 中同時包括Fe3O4和ZIF-8 材料的特征吸收峰，進(jìn)一步表明ZIF-8 成功負(fù)載在Fe3O4的表面。

圖3 Fe3O4@SiO2@PLS（A）和Fe3O4@ZIF-8（B）的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of Fe3O4@SiO2@PLS（A）and Fe3O4@ZIF-8（B）

Fe3O4、Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8的X-射線衍射圖如圖4 所示，30.12°、35.47°、43.11°、53.49°、57.06°和62.62°處 的 特 征 峰 對 應(yīng) 于Fe3O4的（222）、（331）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面［25］，12.7°、14.7°、16.4°、18.0°、22.1°、24.5°、26.7°、29.6°和30.6°處的特征峰對應(yīng)于ZIF-8的（112）、（113）、（022）、（222）、（114）、（223）、（134）、（044）和（244）晶面［26］。上述Fe3O4和ZIF-8 特征峰在Fe3O4@ZIF-8 的XRD 圖中出現(xiàn)，由于無定型結(jié)構(gòu)PLS 無尖峰，F(xiàn)e3O4@SiO2@PLS 中的峰與Fe3O4特征峰相對應(yīng)，以上結(jié)果說明Fe3O4@ZIF-8和Fe3O4@SiO2@PLS成功制備。

圖4 Fe3O4、Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF?8的X-射線衍射圖Fig.4 XRD images of Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2@PLS and Fe3O4@ZIF?8

2.2 混合吸附劑MSPE條件的優(yōu)化

吸附條件和洗脫條件是影響MSPE 的關(guān)鍵因素?？疾炝宋綏l件和洗脫條件對12 種抗生素萃取效率的影響，每組試驗(yàn)平行測定3次。

2.2.1 吸附條件的選擇2種磁性材料的組合使用增加了官能團(tuán)活性位點(diǎn)，增強(qiáng)了其與目標(biāo)物之間的相互作用，如范德華力（Fe3O4@ZIF-8）、孔徑選擇性（Fe3O4@ZIF-8和Fe3O4@SiO2@PLS）、π-π共軛相互作用（Fe3O4@ZIF-8和Fe3O4@SiO2@PLS）和親水親脂作用（Fe3O4@SiO2@PLS）。因此，2種磁性吸附劑的用量決定了萃取效率。固定磁性吸附劑的總用量為50 mg，考察了Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8不同用量組合（50+0 mg、15+35 mg、25+25 mg、35+15 mg和0+50 mg）對水樣中12種抗生素萃取回收率的影響。結(jié)果顯示，單獨(dú)使用Fe3O4@SiO2@PLS（50 mg）時，馬波沙星、氟羅沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、奧比沙星和磺胺異唑的回收率僅為30.5%～60.3%，單獨(dú)使用Fe3O4@ZIF-8（50 mg）時，8種喹諾酮類藥物的回收率僅為28.2%～41.6%。組合使用2種磁性吸附劑的回收率優(yōu)于單一磁性吸附劑，當(dāng)Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8的組合用量為35+15 mg時，回收率大于75%的目標(biāo)物個數(shù)最多，12種目標(biāo)物的回收率為75.1%～103%。因此，選擇最佳組合用量為35 mg Fe3O4@SiO2@PLS和15 mg Fe3O4@ZIF-8。

合適的吸附方式和充足的吸附時間可保證目標(biāo)物與磁性吸附劑充分的相互作用，達(dá)到吸附平衡，有效提升萃取效率?？疾炝藴u旋振蕩和超聲萃取2 種方式對目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明，磁性吸附劑用量為35 mg Fe3O4@SiO2@PLS 和15 mg Fe3O4@ZIF-8，吸附時間為10 min 時，采用渦旋振蕩和超聲萃取對12 種目標(biāo)物的回收率分別為70.3%～90.4%和72.9%～96.9%，實(shí)驗(yàn)最終選擇超聲萃取方式。進(jìn)一步考察了不同超聲吸附時間（1、2、5、10、15 min）對目標(biāo)物回收率的影響（如圖5A），當(dāng)吸附時間為1～10 min 時，12 種目標(biāo)物的萃取回收率隨吸附時間的增加而增大，超聲吸附10 min 達(dá)到最優(yōu)吸附效果，繼續(xù)增加吸附時間，萃取回收率基本保持不變。因此，選擇超聲吸附時間為10 min。

由于磺胺類和喹諾酮類藥物多為兩性化合物，磺胺類具有芳氨基和磺酰胺基，喹諾酮類含有氨基和羧基，樣品溶液pH 值會影響兩性目標(biāo)物的存在狀態(tài)以及磁性吸附劑的官能團(tuán)活性，使得目標(biāo)物與2種磁性材料之間形成氫鍵作用、靜電作用等進(jìn)而影響萃取回收率?？疾炝藰悠啡芤簆H 值對目標(biāo)物回收率的影響（如圖5B），當(dāng)樣品溶液pH 值為4～7 時，12種目標(biāo)物的萃取回收率隨pH 值的增加而增大，繼續(xù)增加pH值至9，萃取回收率反而下降。因此，最終選擇樣品溶液pH值為7。

圖5 超聲吸附時間（A）和樣品溶液pH值（B）對12種抗生素萃取效率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic adsorption time（A）and the pH of sample solution（B）on the extraction efficiencies of 12 antibiotics

2.2.2 洗脫條件的選擇洗脫劑是影響MSPE萃取效率的重要因素之一。由于大多數(shù)磺胺類和喹諾酮類藥物為極性化合物，易溶于甲醇和乙腈等極性溶劑，文獻(xiàn)多選擇甲醇和乙腈作為洗脫劑［22-26］。由于甲醇的沸點(diǎn)低于乙腈，更易揮發(fā)濃縮，因此實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作洗脫劑，進(jìn)一步對比了體積均為10 mL 的甲醇、2%甲酸甲醇溶液、5%氨水甲醇溶液對12 種目標(biāo)物的洗脫效果。如圖6A 所示，以2%甲酸甲醇溶液作為洗脫劑時目標(biāo)物的回收率＜10.8%，使用5%氨水甲醇溶液時的回收率優(yōu)于2%甲酸甲醇。由于堿性條件下大多數(shù)目標(biāo)物和磁性材料表面呈負(fù)電模式，形成靜電斥力有利于洗脫，當(dāng)洗脫劑為5%氨水甲醇溶液時，12種目標(biāo)物的回收率為74.9%～118%，洗脫效果最優(yōu)。因此，最終選擇10 mL 5%氨水甲醇溶液作為洗脫劑。同時考察了不同超聲洗脫時間（2～10 min）對目標(biāo)物萃取回收率的影響。如圖6B所示，當(dāng)洗脫時間為2～5 min時，12種目標(biāo)物的萃取回收率隨洗脫時間的增加而增大，當(dāng)洗脫時間為5 min時，12種目標(biāo)物的萃取回收率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加洗脫時間，萃取回收率基本保持穩(wěn)定，因此超聲洗脫時間選擇5 min。

圖6 洗脫劑種類（A）與洗脫時間（B）對12種抗生素萃取效率的影響Fig.6 Effect of the type of elution solvent（A）and the elution time（B）on the extraction efficiencies of 12 antibiotics

2.3 方法驗(yàn)證

配制系列質(zhì)量濃度（0.5、1、2、5、10 μg/L）的12 種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)條件下進(jìn)行MSPE/HPLC-MS/MS 分析，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。以12 種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/L），以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸分析得到線性方程。結(jié)果表明，12 種抗生素在0.5～10 μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.996 1～0.999 8。分別以3 倍和10 倍信噪比（S/N）確定檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到12 種抗生素的LOD 和LOQ 分別為0.01～0.14 μg/L 和0.04～0.45 μg/L（見表2）。以1 μg/L空白加標(biāo)樣品進(jìn)行3次重復(fù)測定，以所得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為日內(nèi)精密度，以連續(xù)測定3 d所得的RSD為日間精密度。如表2所示，12種抗生素的日內(nèi)RSD為0.90%～5.2%，日間RSD為3.9%～10%，表明方法具有良好的精密度。

表2 方法的線性關(guān)系、檢出限、定量下限及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear relations，LODs，LOQs and RSDs of the developed method

2.4 實(shí)際樣品測定

采集杭州市3 類（飲用水、西溪濕地水和西湖水）9 個點(diǎn)位的水樣采用本方法進(jìn)行測定，結(jié)果表明，所采集的3 種水樣均未檢出12 種抗生素。對空白樣品進(jìn)行3 個水平（1、5、8 μg/L）的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個水平測定3 次，平均加標(biāo)回收率和RSD 見表3。加標(biāo)回收率為75.0%～107%，RSD 為0.50%～5.5%，說明所建立方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，適用于實(shí)際環(huán)境水樣中12種抗生素的檢測。

表3 實(shí)際樣品中12種抗生素的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of 12 antibiotics residues in real samples

（續(xù)表3）

3 結(jié) 論

本研究制備了具有良好性能的Fe3O4@SiO2@PLS 和Fe3O4@ZIF-8 磁性材料，2 種磁性材料共同作為吸附劑時，兼具大孔有機(jī)共聚物和金屬有機(jī)骨架的吸附優(yōu)勢。對影響MSPE 萃取效率的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，建立了混合模式MSPE/HPLC-MS/MS測定水中12種抗生素殘留的分析方法。與其他應(yīng)用于抗生素的MSPE 方法相比，具有簡便快速、有機(jī)溶劑用量少和樣品不易損失等優(yōu)點(diǎn)。本文的磁性吸附劑制備方法簡便，分析方法適用性高，通過調(diào)節(jié)2 種磁性吸附劑的組合用量，實(shí)現(xiàn)了水中8 種喹諾酮和4種磺胺類抗生素的檢測。