馬天成 馬玉坤 孫珈 張金玲 郭麗娜 劉琦 孫宇

中圖分類(lèi)號(hào) R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）04-0465-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.04.14

摘 要 目的 研究狼毒大戟中4種二萜類(lèi)成分在大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物并探討其代謝規(guī)律。方法 運(yùn)用大鼠肝微粒體體外孵育法，將巖大戟內(nèi)酯A、巖大戟內(nèi)酯B、17-羥基巖大戟內(nèi)酯A、17-羥基巖大戟內(nèi)酯B加至由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸啟動(dòng)的大鼠肝微粒體孵育體系中，于37 ℃條件下孵育30 min，再用乙腈終止反應(yīng)。以陰性組（先加乙腈再啟動(dòng)孵育30 min）為參考，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，利用Analyst? TF 1.7.1、PeakView?2.2、MetabolitePilot 1.5、MasterView 1.2軟件對(duì)其質(zhì)譜裂解規(guī)律和代謝產(chǎn)物進(jìn)行推測(cè)與鑒定。結(jié)果 4種二萜類(lèi)成分在二級(jí)質(zhì)譜中均易丟失H2O和CO等中性碎片。巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯A在肝微粒中的代謝反應(yīng)主要為二羥基化、脫氫和一羥基化反應(yīng)，分別鑒定出6、5個(gè)代謝產(chǎn)物。巖大戟內(nèi)酯B和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B在肝微粒體中的代謝反應(yīng)主要為一羥基化、水合和同分異構(gòu)化反應(yīng)，均鑒定出5個(gè)代謝產(chǎn)物。結(jié)論 巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯A在大鼠肝微粒體中均產(chǎn)生了羥基化及脫氫代謝產(chǎn)物，巖大戟內(nèi)酯B和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B在大鼠肝微粒體中均產(chǎn)生了羥基化、水合及同分異構(gòu)化代謝產(chǎn)物。4種二萜類(lèi)成分的代謝產(chǎn)物均是Ⅰ相代謝產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞 狼毒大戟;二萜類(lèi)成分;超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);大鼠肝微粒體;體外代謝

Metabolism of four diterpenoids of Euphorbia fischeriana in liver microsomes of rats

MA Tiancheng1，2，MA Yukun1，SUN Jia1，ZHANG Jinling1，GUO Lina1，LIU Qi1，SUN Yu1（1. Academy of Medical Sciences， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 2. College of Traditional Chinese Medicine， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the metabolites of four diterpenoids of Euphorbia fischeriana in liver microsomes of rats and to investigate its metabolic regularity. METHODS In vitro incubation system of liver microsomes of rats was built. The jolkinolide A， jolkinolide B， 17-hydroxyl jolkinolide A and 17-hydroxyl jolkinolide B were added into incubation system of liver microsomes in rats activated by reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， incubated at 37 ℃ for 30 min， and then terminated the reaction with acetonitrile. Taking the negative group （adding acetonitrile firstly and then starting incubation for 30 min） as the reference， the ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry was used; Anaylyst? TF 1.7.1、PeakView? 2.2， MetabolitePilot 1.5 and MasterView 1.2 software were used to speculate and identify the fragmentation law of mass spectrometry and metabolites. RESULTS Four diterpenoids were easy to lose neutral fragments such as H2O and CO in secondary mass spectrometry. Jolkinolide A and 17-hydroxyl jolkinolide A showed similar metabolism pathway， including dihydroxylation， dehydrogenation， and monohydroxylation; six and five metabolites were identified respectively. Jolkinolide B and 17-hydroxyl jolkinolide B showed similar metabolism pathway， including monohydroxylation， hydration and isomerization. Five metabolites were identified. CONCLUSIONS Both jolkinolide A and 17-hydroxyl jolkinolide A produce the metabolites of hydroxylation and dehydrogenation in liver microsomes of rats; both jolkinolide B and 17-hydroxyl jolkinolide B produce the metabolites of hydroxylation， hydration and isomerization in liver microsomes of rats. The metabolites of four diterpenoids are phase Ⅰ metabolites.

KEYWORDS? ?Euphorbia fischeriana; diterpenoids; ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry;liver microsomes in rats; in vitro metabolism

狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.主要生長(zhǎng)于我國(guó)內(nèi)蒙古、東北及河北等地區(qū)。其以根入藥，味苦、辛，性平，有毒，具有泄水逐飲、破積殺蟲(chóng)的功效，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，狼毒大戟具有抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗癲癇等多種活性[2-3]。狼毒大戟的主要成分包括二萜類(lèi)、三萜類(lèi)、香豆素類(lèi)、酚酸類(lèi)、甾醇類(lèi)等，其中二萜類(lèi)成分為其主要的活性成分[4]。巖大戟內(nèi)酯A、巖大戟內(nèi)酯B、17-羥基巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B是狼毒大戟中含量較高且活性較強(qiáng)的二萜類(lèi)成分[5]。

在早期的藥物-藥物相互作用研究中，體外肝微粒體孵育體系是探討藥物代謝的重要模型[6]。體外代謝研究可在新藥研發(fā)早期利用體外代謝參數(shù)合理預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，指導(dǎo)其后期藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)研究以及安全性評(píng)價(jià)模型的選擇[7]。本研究擬采用大鼠肝微粒體體外孵育法結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究狼毒大戟中巖大戟內(nèi)酯A、巖大戟內(nèi)酯B、17-羥基巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B的代謝產(chǎn)物，并對(duì)其可能的裂解途徑進(jìn)行推測(cè)，探討其代謝規(guī)律，旨在為這4種二萜類(lèi)活性成分的代謝途徑及在體藥動(dòng)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括30A型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）、Triple TOF 4600型質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）、AB135-S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Elix Essential 5 UV型純水儀（美國(guó)Merck Millipore公司）、B8800型超聲波清洗器（美國(guó)Branson公司）、Centrifuge 5417R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、HYQ-2121A型渦旋混勻器（美國(guó)Crystal公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

巖大戟內(nèi)酯A、巖大戟內(nèi)酯B、17-羥基巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B對(duì)照品（批號(hào)分別為EF-1、EF-2、EF-3、EF-4，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)純度均大于98%）均由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心制備;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購(gòu)自美國(guó)Merck公司;甲酸（質(zhì)譜純）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鎂均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純化水。

1.3 肝微粒體

大鼠肝微粒體（批號(hào)M10011，質(zhì)量濃度20 mg/mL）購(gòu)自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

以Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～0.01 min，20%B，0.01～1.00 min，20%B→30%B;1.00～7.00 min，30%B→50%B，7.00～10.00 min，50%B→70%B;10.00～15.00 min，70%B→100%B;15.00～16.00 min，100%B;16.00～16.10 min，100%B→20%B;16.10～18.00 min，20%B）;柱溫為40 ℃;流速為0.3 mL/min;進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源;離子噴霧電壓為5.5 kV;離子源溫度為600 ℃;去簇電壓為100 V;碰撞能量為10 eV。霧化氣、輔助氣和氣簾氣均為氮?dú)猓鋲毫Ψ謩e為55、55、35 psi。在正離子模式下進(jìn)行全掃描，累計(jì)時(shí)間為250 ms。采用數(shù)據(jù)依賴(lài)采集模式進(jìn)行分析，即對(duì)每個(gè)分析物中質(zhì)譜響應(yīng)超過(guò)100 cps的15個(gè)最強(qiáng)碎片離子進(jìn)行子離子掃描，掃描范圍為100～1 200 amu，累計(jì)掃描時(shí)間為100 ms。碰撞能量差為15 eV，并開(kāi)啟動(dòng)態(tài)背景扣除。采用自動(dòng)校準(zhǔn)系統(tǒng)對(duì)質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜自動(dòng)進(jìn)行調(diào)諧和校正。數(shù)據(jù)獲取和處理分析采用Analyst?TF 1.7.1和PeakView?2.2軟件，利用MetabolitePilot 1.5和MasterView 1.2軟件對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行推測(cè)與鑒定。

2.2 溶液的配制

2.2.1 磷酸鹽緩沖液

精密稱(chēng)取磷酸氫二鈉1.496 g，用水定容于50 mL量瓶中;再精密稱(chēng)取磷酸二氫鉀1.361 g，用水定容于50 mL量瓶中;將上述配制的磷酸二氫鉀溶液逐滴加入到磷酸氫二鈉溶液中，直至所得混合溶液的pH為7.4，即得。

2.2.2 氯化鎂溶液

精密稱(chēng)取氯化鎂0.953 g，用水定容于200 mL量瓶中，得5 mmol/L的氯化鎂溶液。

2.2.3 NADPH溶液

精密稱(chēng)取NADPH 10 mg，加水0.6 mL，混勻，得4 mmol/L的NADPH溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.4 樣品溶液

分別精密稱(chēng)取巖大戟內(nèi)酯A、巖大戟內(nèi)酯B、17-羥基巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B對(duì)照品適量，加入一定量的二甲基亞砜進(jìn)行溶解，使上述各成分的質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，即得。

2.3 大鼠肝微粒體體外孵育實(shí)驗(yàn)

孵育體系包含pH 7.4的磷酸鹽緩沖液100 μL、水49 μL、肝微粒體10 μL、5 mmol/L氯化鎂溶液20 μL。本研究設(shè)實(shí)驗(yàn)組（肝微粒體代謝后組）和陰性組（肝微粒體代謝前組）。兩組孵育體系中分別加入1 mg/mL的巖大戟內(nèi)酯A、巖大戟內(nèi)酯B、17-羥基巖大戟內(nèi)酯A、17-羥基巖大戟內(nèi)酯B樣品溶液各1 μL，在37 ℃下預(yù)孵育5 min。然后，實(shí)驗(yàn)組加入4 mmol/L的NADPH溶液20 μL啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃下繼續(xù)孵育30 min后，加入冰乙腈600 μL終止反應(yīng);陰性組先加入冰乙腈600 μL，再加入4 mmol/L的NADPH溶液20 μL，在37 ℃條件下繼續(xù)孵育30 min。取各組樣品，渦流混勻30 s，以14 000 r/min離心10 min，取上清液于另一EP管中，于37 ℃下以氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)蛹状?00 μL復(fù)溶，再以14 000 r/min離心10 min，取上清液2 μL按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。

2.4 4種二萜類(lèi)成分的質(zhì)譜裂解途徑及代謝產(chǎn)物分析

2.4.1 巖大戟內(nèi)酯A

（1）質(zhì)譜裂解途徑：巖大戟內(nèi)酯A的準(zhǔn)分子離子峰的m/z為315.195 2[M+H]+。在其二級(jí)質(zhì)譜圖（圖1）中，m/z 297.184 0、287.202 0[M+H]+推測(cè)是由準(zhǔn)分子離子峰分別脫去1分子H2O和1分子CO而得;m/z 287.202 0

[M+H]+繼續(xù)脫去1分子H2O得到m/z 269.191 0[M+H]+的碎片離子峰;m/z 227.105 3、191.070 4、177.054 0、163.038 6、139.038 4、121.064 3、105.069 6等[M+H]+為巖大戟內(nèi)酯A裂環(huán)后產(chǎn)生的碎片離子峰。巖大戟內(nèi)酯A可能的主要質(zhì)譜裂解途徑如圖2所示。

（2）代謝產(chǎn)物：對(duì)實(shí)驗(yàn)組和陰性組巖大戟內(nèi)酯A的提取離子流圖（圖3）進(jìn)行比較，根據(jù)保留時(shí)間（retention time，tR）共鑒定出6個(gè)代謝產(chǎn)物（記為M1～M6）。結(jié)合其精確分子量和二級(jí)質(zhì)譜信息（表1），參考巖大戟內(nèi)酯A可能的質(zhì)譜裂解途徑（圖2），推測(cè)這些化合物是巖大戟內(nèi)酯A的二羥基化代謝產(chǎn)物、二羥基化+脫氫代謝產(chǎn)物及一羥基化代謝產(chǎn)物。

其中，M1和M2的分子式皆為C20H26O5，tR分別是6.94、7.57 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 347.184 0、347.185 7[M+H]+。在M1的二級(jí)質(zhì)譜信息中，主要的碎片離子峰m/z 329.176 4、311.163 9、293.156 0[M+H]+為準(zhǔn)分子離子峰依次脫去1分子H2O而得，碎片離子峰m/z 301.176 7、283.165 6[M+H]+分別為m/z 329.176 4、311.163 9[M+H]+進(jìn)一步脫去1分子CO而得。在M2的二級(jí)質(zhì)譜信息中，主要的碎片離子峰m/z 329.171 9、311.162 8、293.152 1[M+H]+為準(zhǔn)分子離子峰依次脫去1分子H2O而得，碎片離子峰m/z 299.165 7、283.153 9[M+H]+分別為329.171 9、311.163 9[M+H]+進(jìn)一步脫去1分子CH2O和1分子CO而得。與巖大戟內(nèi)酯A相比，M1和M2的質(zhì)量數(shù)都多了32，推測(cè)其可能為巖大戟內(nèi)酯A的二羥基化代謝產(chǎn)物。

M3、M5和M6的分子式皆為C20H26O4，tR分別是8.80、9.19、11.03 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 331.190 9、331.190 8、331.191 1[M+H]+。與巖大戟內(nèi)酯A相比，質(zhì)量數(shù)都多了16，推測(cè)其可能為巖大戟內(nèi)酯A的一羥基化代謝產(chǎn)物。在二級(jí)質(zhì)譜信息中，M3、M5和M6產(chǎn)生了類(lèi)似的碎片離子。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，M6被鑒定為17-羥基巖大戟內(nèi)酯A，故可確定M6的羥基化位點(diǎn)為C17位。

M4的分子式為C20H24O5，tR為8.96 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 345.169 9[M+H]+。與M1相比，M4的質(zhì)量數(shù)少了2。在M4的二級(jí)質(zhì)譜信息中，主要的碎片離子峰m/z 299.168 9[M+H]+為準(zhǔn)分子離子峰脫去1分子H2O和CO而得;m/z 299.168 9[M+H]+再進(jìn)一步脫水，則可產(chǎn)生m/z 281.143 4[M+H]+的碎片離子峰，推測(cè)M4可能為巖大戟內(nèi)酯A的二羥基化+脫氫代謝產(chǎn)物。

2.4.2 巖大戟內(nèi)酯B

（1）質(zhì)譜裂解規(guī)律：巖大戟內(nèi)酯B的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 331.190 6[M+H]+。在其二級(jí)質(zhì)譜圖（圖4）中，m/z 313.179 6、295.195 7[M+H]+推測(cè)是由準(zhǔn)分子離子峰依次脫去1分子H2O而得;m/z 303.195 7、285.185 1[M+H]+推測(cè)是由準(zhǔn)分子離子峰依次脫去1分子CO和1分子H2O而得;此外，巖大戟內(nèi)酯B還因裂環(huán)產(chǎn)生了m/z 193.049 5、183.116 3、165.054 8、137.059 5、125.022 9[M+H]+等一系列碎片離子峰。巖大戟內(nèi)酯B可能的主要質(zhì)譜裂解途徑如圖5所示。

（2）代謝產(chǎn)物：對(duì)實(shí)驗(yàn)組和陰性組巖大戟內(nèi)酯B的提取離子流圖（圖6）進(jìn)行比較，根據(jù)tR共鑒定出5個(gè)代謝產(chǎn)物（記為N1～N5）。結(jié)合其精確分子量和二級(jí)質(zhì)譜信息（表2），參考巖大戟內(nèi)酯B可能的質(zhì)譜裂解途徑（圖5），推測(cè)這些化合物為巖大戟內(nèi)酯B的一羥基化+水合代謝產(chǎn)物、一羥基化代謝產(chǎn)物、水合代謝產(chǎn)物及同分異構(gòu)化代謝產(chǎn)物。

N1和N2的分子式皆為C20H28O6，tR分別是6.53、8.17 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z為365.196 4、365.195 8

[M+H]+。與巖大戟內(nèi)酯B相比，兩者的質(zhì)量數(shù)均多了34，即多了1分子H2O2，因此推測(cè)N1、N2為巖大戟內(nèi)酯B的一羥基化+水合代謝產(chǎn)物。

N3的分子式為C20H26O5，tR為8.53 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 347.181 0[M+H]+。與巖大戟內(nèi)酯B相比，N3的質(zhì)量數(shù)多了16，因此推測(cè)N3為巖大戟內(nèi)酯B的一羥基化代謝產(chǎn)物。

N4的分子式為C20H26O4，tR為8.65 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 331.190 7[M+H]+。與巖大戟內(nèi)酯B相比，N4具有相同的分子式，因此推測(cè)N4可能為巖大戟內(nèi)酯B的同分異構(gòu)化代謝產(chǎn)物。

N5的分子式為C20H28O5，tR為9.57 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 349.202 0[M+H]+。與巖大戟內(nèi)酯B相比，N5的質(zhì)量數(shù)多了18，即1分子H2O，因此推測(cè)N5可能為巖大戟內(nèi)酯B的水合代謝產(chǎn)物。

2.4.3 17-羥基巖大戟內(nèi)酯A

（1）質(zhì)譜裂解途徑：17-羥基巖大戟內(nèi)酯A的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 331.190 3[M+H]+。在其二級(jí)質(zhì)譜圖（圖7）中，m/z 313.179 8、295.169 0[M+H]+推測(cè)是由準(zhǔn)分子離子峰依次脫去1分子H2O而得;m/z 285.185 4[M+H]+推測(cè)是由m/z 313.179 8[M+H]+脫去1分子CO而得;此外，17-羥基巖大戟內(nèi)酯A還因裂環(huán)產(chǎn)生了m/z 239.106 5、227.104 8、199.075 3、189.054 1、175.148 2、161.131 6、147.043 5、133.100 5、119.085 6、105.069 2[M+H]+等一系列碎片離子峰。17-羥基巖大戟內(nèi)酯A可能的主要質(zhì)譜裂解途徑如圖8所示。

（2）代謝產(chǎn)物：將實(shí)驗(yàn)組和陰性組17-羥基巖大戟內(nèi)酯A的提取離子流圖（圖9）進(jìn)行比較，根據(jù)tR共鑒定出5個(gè)代謝產(chǎn)物（記為P1～P5）。結(jié)合其精確分子量和二級(jí)質(zhì)譜信息（表3），參考17-羥基巖大戟內(nèi)酯A的質(zhì)譜裂解途徑（圖8），推測(cè)這些化合物可能為17-羥基巖大戟內(nèi)酯A的一羥基化代謝產(chǎn)物及二羥基化+脫氫代謝產(chǎn)物。

P1、P2、P5的分子式皆為C20H26O5，tR分別為6.88、6.94、7.59 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 347.185 7、347.185 0、347.186 4[M+H]+。與17-羥基巖大戟內(nèi)酯A相比，三者的質(zhì)量數(shù)均多了16，因此推測(cè)其可能為17-羥基巖大戟內(nèi)酯A的一羥基化代謝產(chǎn)物。

P3和P4的分子式皆為C20H24O6，tR分別為7.38、7.44 min，準(zhǔn)分子離子峰均為m/z 361.164 9[M+H]+。與17-羥基巖大戟內(nèi)酯A相比，兩者的質(zhì)量數(shù)多了30，即分子式上多了2個(gè)O、少了2個(gè)H，因此推測(cè)其可能為17-羥基巖大戟內(nèi)酯A的二羥基化+脫氫代謝產(chǎn)物。

2.4.4 17-羥基巖大戟內(nèi)酯B

（1）質(zhì)譜裂解途徑：17-羥基巖大戟內(nèi)酯B的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 347.186 7[M+H]+。在其二級(jí)質(zhì)譜圖（圖10）中，m/z 329.174 7、311.164 9[M+H]+推測(cè)是由準(zhǔn)分子離子峰依次脫去1分子H2O而得;m/z 301.180 3、283.169 3[M+H]+推測(cè)是由m/z 329.174 7[M+H]+依次脫去1分子CO和1分子H2O而得;此外，17-羥基巖大戟內(nèi)酯B還因裂環(huán)產(chǎn)生了m/z 227.106 4、213.091 7、191.034 6、163.040 1、131.049 5、123.008 3、109.102 7[M+H]+等一系列碎片離子峰。17-羥基巖大戟內(nèi)酯B可能的主要質(zhì)譜裂解途徑如圖11所示。

（2）代謝產(chǎn)物：對(duì)實(shí)驗(yàn)組及陰性組的17-羥基巖大戟內(nèi)酯B提取離子流圖（圖12）進(jìn)行比較，根據(jù)tR共鑒定出5個(gè)代謝產(chǎn)物（記為Q1～Q5）。結(jié)合其精確分子量和二級(jí)質(zhì)譜信息（表4），參考17-羥基巖大戟內(nèi)酯B可能的質(zhì)譜裂解途徑（圖11），推測(cè)這些化合物可能為17-羥基巖大戟內(nèi)酯B的一羥基化+水合代謝產(chǎn)物、一羥基化代謝產(chǎn)物、水合代謝產(chǎn)物及同分異構(gòu)化代謝產(chǎn)物。

Q1和Q2的分子式皆為C20H28O7，tR分別為5.15、5.43 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 381.190 7、391.191 7[M+H]+。與17-羥基巖大戟內(nèi)酯B相比，兩者的質(zhì)量數(shù)多了34，即分子式多了H2O2，因此推測(cè)其可能為17-羥基巖大戟內(nèi)酯B的一羥基化+水合代謝產(chǎn)物。

Q3的分子式為C20H26O6，tR為7.01 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 363.181 6[M+H]+;Q5分子式為C20H28O6，tR為8.18 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 365.196 9[M+H]+。與17-羥基巖大戟內(nèi)酯B相比，Q3分子式多了O，Q5分子式多了H2O，因此推測(cè)Q3可能為17-羥基巖大戟內(nèi)酯B的一羥基化代謝產(chǎn)物，Q5可能為17-羥基巖大戟內(nèi)酯B的水合代謝產(chǎn)物。

Q4的分子式為C20H26O5，tR為8.00 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 347.186 2[M+H]+。與17-羥基巖大戟內(nèi)酯B相比，兩者分子量相同，因此推測(cè)Q4可能為17-羥基巖大戟內(nèi)酯B的同分異構(gòu)化代謝產(chǎn)物。

3 討論

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者同時(shí)采用了正離子和負(fù)離子兩種質(zhì)譜掃描模式對(duì)巖大戟內(nèi)酯A、巖大戟內(nèi)酯B、17-羥基巖大戟內(nèi)酯A、17-羥基巖大戟內(nèi)酯B的肝微粒體代謝產(chǎn)物進(jìn)行解析，結(jié)果顯示，正離子掃描模式可獲得更多的二級(jí)碎片信息，故最終采用正離子模式對(duì)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

本研究結(jié)果顯示，巖大戟內(nèi)酯A、巖大戟內(nèi)酯B、17-羥基巖大戟內(nèi)酯A、17-羥基巖大戟內(nèi)酯B在正離子檢測(cè)條件下的二級(jí)質(zhì)譜裂解方式存在共性。經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)[8-10]和本文結(jié)果可知，上述4種二萜類(lèi)化合物的二級(jí)質(zhì)譜均易丟失H2O和CO等中性碎片，并產(chǎn)生一系列碎片離子。隨后，本研究通過(guò)解析原型藥物及其代謝產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律、tR、精確分子量等數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯A在肝微粒中的代謝途徑相似，主要為二羥基化、脫氫和一羥基化反應(yīng);巖大戟內(nèi)酯B和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B在肝微粒體中的代謝途徑相似，主要為一羥基化、水合及同分異構(gòu)化反應(yīng)。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)發(fā)現(xiàn)，巖大戟內(nèi)酯A可在肝微粒體中經(jīng)一羥基化反應(yīng)生成17-羥基巖大戟內(nèi)酯A，進(jìn)而推斷出巖大戟內(nèi)酯A在肝微粒體中可在C17位發(fā)生甲基羥基化。在結(jié)構(gòu)上，與巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯A相比，巖大戟內(nèi)酯B和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B的C11、C12位多了1個(gè)三元氧環(huán)，由此推測(cè)這兩個(gè)成分可能在肝微粒體中發(fā)生C11與C12的氧環(huán)開(kāi)裂，再進(jìn)一步進(jìn)行水合反應(yīng)，然后經(jīng)羥基脫水生成原型藥物的同分異構(gòu)化代謝產(chǎn)物。巖大戟內(nèi)酯A、巖大戟內(nèi)酯B、17-羥基巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B在二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生了大量的裂環(huán)碎片離子，由于二萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可能存在多種裂環(huán)方式，暫無(wú)法對(duì)各裂解碎片進(jìn)行逐一歸屬。因此，在沒(méi)有對(duì)照品的情況下，較難推測(cè)各化合物羥基化代謝產(chǎn)物的羥基結(jié)合位點(diǎn)。在今后的研究中，可在大量富集代謝產(chǎn)物后進(jìn)行分離，得到單體代謝產(chǎn)物，再通過(guò)核磁共振等手段對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

通過(guò)對(duì)比筆者前期對(duì)巖大戟內(nèi)酯B體內(nèi)代謝的研究結(jié)果[9]發(fā)現(xiàn)，該成分體內(nèi)外代謝途徑有相似之處，但也存在一定差異。在體內(nèi)與體外代謝中，巖大戟內(nèi)酯B均產(chǎn)生了氧化代謝產(chǎn)物，并且推測(cè)其C11、C12位的三元氧環(huán)在代謝中都發(fā)生了開(kāi)裂現(xiàn)象;不同的是，巖大戟內(nèi)酯B在體內(nèi)代謝中產(chǎn)生了脫水代謝產(chǎn)物，而在體外肝微粒體代謝中產(chǎn)生了水合代謝產(chǎn)物。

綜上所述，巖大戟內(nèi)酯A和17-羥基巖大戟內(nèi)酯A在大鼠肝微粒體中均產(chǎn)生了羥基化及脫氫代謝產(chǎn)物，巖大戟內(nèi)酯B和17-羥基巖大戟內(nèi)酯B在大鼠肝微粒體中均產(chǎn)生了羥基化、水合及同分異構(gòu)化代謝產(chǎn)物。4種二萜類(lèi)成分在大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物均是Ⅰ相代謝產(chǎn)物，未發(fā)現(xiàn)Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

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（收稿日期：2021-11-12 修回日期：2022-01-20）

（編輯：鄒麗娟）