陸 林， 代 楊， 王曉群， 吳立群， 張瑞巖， 沈衛(wèi)峰

（上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科 上海交通大學醫(yī)學院心血管病研究所，上海 200025）

轉化研究一詞演化自20世紀90年代的轉化醫(yī)學，其含義是針對臨床科學問題，通過多學科交叉合作，深入開展基礎研究，并促進研究成果得到快速應用，實現(xiàn)從“實驗室到床邊”的轉化。繼而，從臨床應用中發(fā)現(xiàn)新問題，提出新設想、新思路，再回到實驗室開展更為深入的研究，使后續(xù)研究不斷向徹底解決疾病的目標靠攏。轉化研究即倡導實驗室與臨床研究的雙向轉化，解決臨床實際需求。轉化研究概念一經(jīng)提出，就引起基礎醫(yī)學、臨床醫(yī)學、預防醫(yī)學和生物制藥界，以及醫(yī)學科技規(guī)劃與管理等領域的極大關注。如今，轉化研究已從概念轉化為熱門研究模式。在心血管疾病領域，轉化研究取得了顯著成果，不少研究結果被運用于臨床實踐，或處于臨床試驗階段。本文就其中代表性方面進行論述。

蛋白質(zhì)組學運用于心血管疾病生物標志物和干預靶點的發(fā)現(xiàn)

許多心腦血管疾病和代謝性疾病的心腦血管并發(fā)癥等都由遺傳和環(huán)境因素長期共同作用導致。近數(shù)十年來，隨著蛋白質(zhì)組學理論和檢測技術的不斷成熟，其在這些疾病的發(fā)病機制、發(fā)病相關蛋白質(zhì)檢測和干預研究中起重要作用[1]。如發(fā)現(xiàn)對臨床診斷心力衰竭（心衰）有重要意義的N末端腦鈉肽前 體 （N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NTproBNP）和可溶性腫瘤發(fā)生抑制蛋白2（soluble suppression of tumorigenicity 2,sST2）等[2]，以及反映心血管炎癥和損傷指標C-反應蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin）和肌鈣蛋白等[3]。蛋白質(zhì)組學在轉化研究中被廣泛運用的緣由在于：①蛋白質(zhì)是疾病病理生理發(fā)展的主體，其水平改變與基因轉錄本水平間相關性并不強（10%～30%）[1]，蛋白水平較多受到翻譯后調(diào)控的影響；②疾病機制中許多重要蛋白質(zhì)分泌入血發(fā)揮致病效應，因此更便于蛋白組學檢測；③疾病過程中蛋白質(zhì)翻譯后修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的交互作用及蛋白質(zhì)降解也可通過蛋白質(zhì)組學技術檢測。但是，其也有不足之處，由于血漿3 000余種蛋白質(zhì)成分中存在眾多高峰度蛋白，如白蛋白、免疫球蛋白和纖維蛋白原等，使許多低峰度而有研究價值蛋白質(zhì)的檢測較為困難。

目前常用的蛋白質(zhì)組學檢測策略有全體檢測（global discovery）、靶點鑒定（targeted proteomics）、靶向檢測（targeted discovery）。非靶向全體檢測方法是對疾病和對照蛋白質(zhì)樣本進行酶學降解后，用質(zhì)譜檢測樣本內(nèi)所有肽段并定量，如shortgun法。該方法能盡可能多地發(fā)現(xiàn)所有蛋白肽段，但缺乏敏感性，在檢測低峰度蛋白質(zhì)肽段時有一定困難。靶點鑒定是高敏感性和高特異性的質(zhì)譜檢測手段，主要檢測預知蛋白質(zhì)肽段的有限位點或片段信息，如蛋白質(zhì)位點的翻譯后修飾等。靶向檢測則是居于靶向和非靶向之間的策略，目的是以一定通量檢測一組靶向蛋白質(zhì)成分的信息，如基于抗體富集的芯片陣蛋白質(zhì)肽段檢測等[1]。

近年來，得益于蛋白質(zhì)組學和RNA測序等聯(lián)合運用來針對不同組織和細胞樣本進行檢測。發(fā)現(xiàn)不少與心血管疾病發(fā)生有密切關系的重要基因突變，以及蛋白質(zhì)表達水平、交互作用、翻譯后修飾等方面的異常，為心血管疾病檢測、預警和干預研究提供了重要幫助。

心肌纖維化的檢測和治療

心衰發(fā)生的病理生理過程中，纖維化起關鍵作用。廣義心肌纖維化是指心肌細胞間質(zhì)中基質(zhì)過度積累，按病理生理機制劃分為修復性纖維化和反應性纖維化。修復性纖維化發(fā)生在心肌梗死（心梗）的壞死組織區(qū)域。當炎性細胞清除壞死組織后，在促纖維化因子的作用下啟動纖維化過程，成纖維細胞增殖，遷移、轉變?yōu)榧±w維細胞，用以替代壞死的心肌，心梗3～6周后梗死區(qū)膠原含量達到最高。反應性纖維化發(fā)生在非缺血性心肌間質(zhì)或血管周圍，如高血壓、衰老和射血分數(shù)保留性心衰（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）中，由 于受炎性、氧化應激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system，RAS）及其旁分泌、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等因素作用而發(fā)生的一種長期適應性病理過程，也是心肌重構的表現(xiàn)之一。疾病進程中，纖維化處于動態(tài)轉變過程，受下述因素影響：①成纖維細胞動員并向肌纖維細胞轉變；②細胞間質(zhì)纖維化參與蛋白的翻譯后修飾等[4]。

心衰中，心肌纖維化病理過程不會自行終止，反而持續(xù)進展。這與病因和誘因的復雜性和持續(xù)性有關，從而造成全身和局部炎癥持續(xù)存在，成纖維細胞持續(xù)增殖和激活，心肌纖維細胞凋亡降低。目前，關于心肌纖維化有3個問題有待進一步探究：①對不同心衰病理機制下心肌纖維化進行定義，概念及基本病理生理機制有待進一步深化。②需要有與纖維化特點相關聯(lián)的生物標志物和影像學技術。血清學指標如Ⅲ型前膠原N端前肽（N-terminal procollagenⅢpropeptide，PⅢNP）、半乳凝素3（galectin-3）、Ⅰ型前膠原C-端前肽（procollagen typeⅠC-terminal propeptide，CITP）、ST2、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）等。研究顯示除PⅢNP和CITP外，循環(huán)血中纖維化標志物與組織中纖維化程度并不平行。對心肌纖維化的影像學檢測主要依靠超聲心動圖和心臟磁共振。磁共振T1掃描可對心肌細胞外容積（extracellular volume，ECV）進行定量，這對細胞間隙纖維化、水腫、蛋白降解或聚集、脂質(zhì)積累、鐵或淀粉沉積等均有反映。③對心肌纖維化病理過程的干預手段[4]。

以往研究和轉化研究發(fā)現(xiàn)，RAS抑制劑、醛固酮受體拮抗劑可減少纖維化。TIMP對纖維化的療效有限。在干預上游元素的臨床試驗中，如TGF-β抑制劑吡非尼酮（pirfenidone）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）抑制劑、內(nèi)皮素受體阻斷劑、胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）抑制劑等。吡非尼酮能降低TGF-β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等促纖維化因子，對心臟負荷過重或高血壓等纖維化有效，可降低心律失常發(fā)生。CTGF具有上調(diào)TGF-β、骨形態(tài)生成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、Wnt、血管生長因子、細胞因子和整合素等作用。CTGF單抗pamrevlumab（FG-3019）對400例糖尿病腎病、胰腺癌、原發(fā)性肺纖維化和肝纖維化患者使用后安全。半乳凝素-3與固有免疫炎癥有關，心衰時受炎性細胞誘導后增高，促進心肌纖維化。用干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）或小分子抑制半乳凝素-3能有效抑制組織器官纖維化。半乳凝素-3抑制劑在臨床試驗中。

非編碼RNA中，微RNA（microRNA，miRNA）-21抑制劑在Ⅱ期臨床試驗中顯示能夠干預腎纖維化，miRA-29b更具心臟特異性，其抑制劑對心衰心肌纖維化的影響正在臨床試驗中。

心房顫動機制的認識和干預

心房顫動（房顫）是老年人群和心血管疾病患者中常見的合并疾病，陣發(fā)性、持續(xù)性或永久性房顫的發(fā)病機制有顯著差別。射頻消融進行肺靜脈隔離手術治療房顫的療效和長期預后差別很大[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)促發(fā)房顫的一些病理生理方面重要因素，如Ca2+介導的異位興奮性增高使心電沖動產(chǎn)生異常，基礎疾病或心外膜脂肪代謝異常引起的心肌纖維化、心房重構，細胞間傳導的離子連接蛋白（connexin）功能失調(diào)和Na+通道功能異常等導致基質(zhì)病變，導致興奮沖動傳導異常，心電不應期異常等，這些均有利于房顫發(fā)生和折返環(huán)的建立。另外，還發(fā)現(xiàn)不少房顫的促進因素，包括Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin-dependent protein kinase-Ⅱ，Ca2+/CaMKⅡ）和NLRP3（NACHT、LRR、PYD domain-containing protein 3）-炎性小體途徑促發(fā)和維持折返機制與慢性房顫發(fā)生和持續(xù)有重要關系。此外，運用全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）和候選基因策略發(fā)現(xiàn)與房顫有關的致病相關轉錄因子基因（PRRX1、ZFHX3、GATA、TBX5、Pitx2、NFAT等），以及miRNA（miR-1、miR-26、miR-133等）經(jīng)改變Ca2+處理，降低傳導、縮短有效不應期誘發(fā)促發(fā)和折返[6]。

基于上述發(fā)現(xiàn)，臨床轉化方向在于抑制全身/局部組織炎癥和氧化應激；降低心肌細胞和成纖維細胞中Ca2+水平；尋找異位沖動產(chǎn)生、傳導異常機制中的重要致病基因和通路，并進行干預；抑制RAS、PDGF、CTGF、TGF和各種促進心血管纖維化的危險因素；糾正引發(fā)傳導異常有關的遺傳異常和重構的連接蛋白等。

高脂血癥強效抑制劑：基礎研究到臨床轉化的范例

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）是低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）代謝過程中的重要調(diào)節(jié)元素。LDL是動脈粥樣硬化的重要病因。生理情況下，LDL與肝臟細胞表面的LDL受體（LDL receptor，LDLR）結合，內(nèi)吞入細胞中，與溶酶體融合后LDL被降解。而LDLR則再循環(huán)返回肝臟細胞表面繼續(xù)實施結合LDL功能，即血清LDL的生理性代謝過程。生理情況下，PCSK9在肝臟、小腸和腎臟細胞中合成后分泌入細胞間質(zhì)和循環(huán)中，其功能在于與肝臟細胞表面LDLR結合后，一起內(nèi)吞，在溶酶體中降解LDLR，調(diào)節(jié)LDLR水平，從而維系血脂穩(wěn)態(tài)。

轉化研究在家族性高膽固醇血癥研究中發(fā)現(xiàn)，PCSK9功能獲得性突變患者存在高脂血癥，而功能缺失性突變則終身低膽固醇血癥，動脈粥樣硬化性心腦血管病的風險低。動脈粥樣硬化研究認為，循環(huán)血PCSK9是反映動脈粥樣硬化發(fā)病和冠狀動脈病變危重度的生物學標志物。在一項161例遺傳性家族性高脂血癥研究中，發(fā)現(xiàn)血清PCSK9水平與冠狀動脈鈣化積分顯著相關[7]。在另一項經(jīng)冠狀動脈造影確診冠心病的研究中發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血中PCSK9水平與冠狀動脈內(nèi)超聲檢測脂質(zhì)斑塊核心容量組分呈正相關。在挪威開展的一項隨訪11年的人群研究中發(fā)現(xiàn)，1 488例心?；颊吆?1 819例非冠心病對照中PCSK9最高四分位水平組較最低四分位水平組的心梗危險高47%[8]。另外，在2 030例造影證實的急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者中，血漿PCSK9水平與炎癥水平、調(diào)脂療效和臨床ACS表現(xiàn)相關[9]。

正因為PCSK9與高脂血癥和動脈粥樣硬化的關系，臨床轉化中運用PCSK9單抗[如依洛尤單抗（evolocumab）、阿利西尤單抗（alirocumab）]、siRNA（如inclisiran）、反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、PCSK9疫苗（AT04A）等策略來下調(diào)或抑制PCSK9。PCSK9單抗臨床使用起步最早，在已服用他汀類藥物的純合子和雜合子家族性高脂血癥患者中約降低50% LDL水平[10]。PCSK9 siRNA通過抑制PCSK9的mRNA翻譯來降低蛋白水平，其作用時間明顯長于PCSK9單抗，一次用藥180 d后LDL水平平均降低53%[11]。此外，相對于單抗僅結合并干預循環(huán)中PCSK9的作用機制，PCSK9 siRNA能降低肝臟組織和循環(huán)中PCSK9水平。PCSK9疫苗AT04A已研制成功。小鼠實驗中，AT04A能降低53% LDL水平，抑制炎癥，動脈粥樣硬化斑塊面積下降64%[12]。以上措施在抑制PCSK9同時還能下調(diào)25%～30%脂蛋白（a）水平達，并升高HDL水平[7]。

PCSK9抑制劑的效應得到臨床試驗的有力支持。在入選27 564例動脈粥樣硬化性心臟病患者的隨機對照試驗FOURIER中，依洛尤單抗使用后48周時LDL水平降低59%，由2.39 mmol/L（92 mg/dL）降至0.78 mmol/L（30 mg/dL）。隨訪26個月后發(fā)現(xiàn)，非致死性心梗、腦卒中和再血管化手術等一級終點事件下降1.5%[13]。亞組分析顯示，以往心?；颊吆屯庵苎芗膊』颊呓?jīng)PCSK9抑制治療后終點事件的發(fā)生率均明顯降低。另外，OSLER1、OSLER2和ODYSSEY研究也證實PCSK9抑制劑對LDL水平的降低和心血管預后的改善[13]。

非編碼RNA與心血管疾病

人類基因組中99%核苷酸序列都不編碼蛋白質(zhì)，其中相當部分非編碼RNA的主要功能是調(diào)控蛋白質(zhì)的結構和功能。非編碼RNA包括miRNA、siRNA和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LnRNA）。研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA與心血管系統(tǒng)的生理學調(diào)節(jié)及疾病發(fā)生有密切關系，其中一些可被轉化用于疾病診斷和干預手段[14]。

miRNA調(diào)控心梗后心肌損傷和重構。心肌缺血后miR-15家族成員水平上調(diào)，誘導心肌細胞凋亡，而用抗miRNA來抑制miR-15成員可下調(diào)Bcl-2、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silence information regulator 1，SIRT1），從而降低小鼠心臟梗死面積。心梗后miR-34家族成員表達升高，抑制miR-34家族能增強心梗后心臟恢復。抑制miR-15和miR-92a能增加心梗后血管新生，改善心臟功能。另外，發(fā)現(xiàn)一些miRNA與小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生有關。miR-126能保護血管內(nèi)皮，剔除miR-126-5p削弱血管內(nèi)皮對高脂血癥的抵抗，促進動脈粥樣硬化發(fā)生。巨噬細胞在動脈粥樣硬化發(fā)生中起重要作用，miR-155能促進炎癥，誘導巨噬細胞向M1極化，下調(diào)膽固醇逆轉運，促進動脈粥樣硬化發(fā)生[15]。血漿中高密度脂質(zhì)白（high density lipoprotein，HDL）通過ABCA1和ABCG1這2個原件實施脂質(zhì)逆轉運，保護血管，抑制動脈粥樣硬化。miR-33a/b、miR-19b、miR-144、miR-148a均能結合ABCA1的3’非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’UTR），干擾該脂質(zhì)逆轉運原件[14]。

與miRNA相似，LnRNA失調(diào)與心功能不全有關，LnRNA中的心臟肥大相關因子（cardiac hypertrophy-associated transcript，CHAST）與小鼠和人心肌肥厚有關，抑制CHAST可減少心肌重構和心衰。另外，INK4位點反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL）調(diào)控與細胞增加黏附基因表達有關，也與動脈粥樣硬化嚴重度相關[16]。

目前，已運用于臨床或處于轉化前期試驗中的非編碼RNA眾多。如納米攜帶siRNA抑制PCSK9下調(diào)LDL水平，從而干預動脈粥樣硬化；miR-92a抑制心肌缺血后損傷及促進血管內(nèi)膜損害后再內(nèi)皮化；siRNA抑制Ca2+調(diào)節(jié)因子受磷蛋白（phospholamban），干預心衰；siRNA抑制單核細胞趨化因子受體2（chemokine C-C motif receptor 2,CCR2），干預動脈粥樣硬化等。

綜上，近數(shù)十年來，心血管疾病的轉化研究受到極大關注。本文所論述的這些熱點涉及蛋白質(zhì)組學在心血管疾病診斷和干預中的運用，心肌纖維化的檢測和治療，房顫機制的認識和干預，高脂血癥的強效抑制劑，非編碼RNA與心血管疾病發(fā)生與干預等。相信隨著研究深入和轉化的不斷推進，基礎研究成果將被更多地運用于臨床實踐，造福患者。