郭建勇，楊波，梁長梅，張鵬飛，溫鵬飛*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

WD40 重復(fù)蛋白（WD-repeat），又稱WD40 結(jié)構(gòu)域蛋白，核心區(qū)域由一個簡短的、約40 個氨基酸所構(gòu)成，N 端從甘氨酸和組氨酸的二肽開始，C 端由色氨酸和天冬氨酸終止［1］，作為真核生物中一個重 要 基 因 家 族［2］，參 與 細(xì) 胞 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo)［3］、RNA 修飾［4］、細(xì)胞凋亡［5］、免疫反應(yīng)［6］、基因轉(zhuǎn)錄［7］和花青苷合成［8］等代謝，具有重要作用。

目前，擬南芥中已經(jīng)鑒定出230 個WD40 蛋白成員［9］，也在其它植物中鑒定出不同類型的WD40蛋白，例如谷子［10］、棉花（陸地棉）［11］、水稻［12］，小麥［13］等。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtTTG1參與調(diào)控?cái)M南芥種皮中原花青素、根毛和表皮毛形成以及種子粘液和花青素生物合成［14］，且過表達(dá)MdTTG1［15］、VcTTG1［16］、VvWDR1［17］的擬南芥植株AtDFR等基因表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)花青苷積累，過表達(dá)MiTTG1促進(jìn)擬南芥的根生長及非生物脅迫［18］。InWDR1過表達(dá)可增強(qiáng)日本牽?；ㄋ{(lán)色花朵、紅色莖中的花青素及深棕色種子色素沉積［19］。柿子中DkWD40 蛋白被證實(shí)參與柿果實(shí)單寧積累和可溶性單寧向不溶性單寧的轉(zhuǎn)化［20］。

原花青素和花青苷是葡萄中含量最豐富的2種類黃酮類化合物［21］，其代謝調(diào)控受到諸如遺傳（如結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因等）和環(huán)境（如光照、溫度等）的調(diào)控。前人證實(shí)，WD40 蛋白參與形成MBW（MYB-bHLH-WD40）蛋 白 復(fù) 合 體，與DFR、UFGT等花青苷合成關(guān)鍵酶基因的啟動子相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控花青苷的合成［22-23］。在擬南芥中，TT2-TT8-TTG1 復(fù)合體通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶基因DFR、LDOX、BAN的表達(dá)來調(diào)節(jié)其原花青素的 合 成［24］；在 草 莓 中，F(xiàn)aTTG1 可 與FaMYB9/FaMYB11、FabHLH3 形成一種復(fù)合物，該復(fù)合物可通過上調(diào)ANS和LAR表達(dá)從而增加原花色素物 質(zhì) 積 累［25］；Zhao 等［26］發(fā) 現(xiàn)VcWDL2 與VcMY?BL1 和VcbHLHL1 相互作用進(jìn)而參與藍(lán)莓果實(shí)花青苷積累和顏色發(fā)育；Liu 等［27］發(fā)現(xiàn)MrWD40-1 與MrMYB1 和MrbHLH1 互作促進(jìn)楊梅花青苷積累；An 等［28］發(fā)現(xiàn)MdTTG1基因與bHLH 轉(zhuǎn)錄因子可形成復(fù)合物，進(jìn)而啟動下游花青苷合成基因MdDFR和MdUFGT轉(zhuǎn) 錄；葡 萄 中［29］WDR1 通 過與MYBA1 的蛋白相互作用，激活VvCHI3、VvOMT和VvGST4的啟動子進(jìn)而正向調(diào)節(jié)葡萄漿果的顏色。

前人研究表明，VvMYBPA2參與調(diào)控葡萄原花色素的積累［30］，且VvMYC2參與調(diào)控葡萄花青苷的積累和茉莉酸合成［31］，VvWDR1異源表達(dá)誘導(dǎo)花青苷積累。但葡萄WDR1 蛋白與VvMYB?PA2和VvMYC2編碼的蛋白是否存在互作，抑或其互作機(jī)理尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在獲得VvWDR1基因CDS 區(qū)基礎(chǔ)上，首先通過生物信息學(xué)分析其特征和預(yù)測其功能，進(jìn)而通過酵母雙雜交技術(shù)揭示W(wǎng)DR1 與MYBPA2 或MYC2 蛋白的體外相互作用，對于闡明葡萄原花青素與花色苷代謝調(diào)控機(jī)理具有重要理論意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生長健壯且無病蟲害的7 年生‘早黑寶’葡萄（Vitis viniferaL.cv.Zaoheibao），籬架栽培，株行距1.5 m×2.5 m，常規(guī)管理。大腸桿菌（E.coli Trans5α）化學(xué)感受態(tài)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，酵母菌株AH109、載體pGBKT7、pGADT7 保存自本 實(shí)驗(yàn)室，SD/-Trp、SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade 培養(yǎng)基、X-α-Gal、限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、pMD-19T 購于北京TaKaRa 公司，DNA marker 購于中科瑞泰（北京）生物科技有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購于天根生化科技（北京）公司，所需引物合成和測序均由華大科技有限公司（北京）完成。MYBPA2相關(guān)載體由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.2 VvWDR1 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy 網(wǎng)站在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn) 行 蛋 白基本理化特性分析，使用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列親疏水性，利用在線軟件SignalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，利用在線軟件SPOMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對其編碼氨基酸序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，通過SWISS MODEL（https：//swiss?model.expasy.org/interactive）網(wǎng)站對其三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，利用CDD 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn) 行 蛋 白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析，通過NCBI 官網(wǎng)進(jìn)行blastp 比對，下載高相似度的序列并結(jié)合MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增

根據(jù)葡萄已知的WDR1、MYC2核苷酸序列及pGADT7、pGBKT7 多克隆位點(diǎn)，利用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)合成外掛酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物見表1（下劃線部分為酶切位點(diǎn)）。

表1 引物序列Table1 Primers Sequence

以‘早黑寶’葡萄葉片cDNA 為模板，加入上、下游引物、2×Taq PCR MasterMix、DEPC-H2O后PCR 擴(kuò)增目的片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后送至華大測序。

1.4 酵母載體構(gòu)建及鑒定

將測序正確的克隆載體與酵母雙雜交載體同時(shí)雙酶切，切膠回收目的片段和載體片段，用T4連接酶進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化至Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選培養(yǎng)，從平板中挑取數(shù)個菌落在30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)條件下，振蕩過夜培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.5 酵母重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

采用PEG/LiAc 法將誘餌載體pGBKT7-WDR1轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞中，參照董燕梅［32］的方法，略有修改。

1.6 重組質(zhì)粒毒性及自激活檢測

隨機(jī)各挑取5 個單克隆于5 mLSD/-Trp 液體培養(yǎng)基30 ℃震蕩培養(yǎng)，24 h 后測OD600，選取轉(zhuǎn)化成功的酵母菌陽性單克隆，接種于SD/-Trp/Xα-Gal平板上，倒置培養(yǎng)并觀察顏色變化。

1.7 共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

采用PEG/LiAc法將pGBKT7-53/pGADT7-T（陽性對照）、pGBKT7-Lam/pGADT7-T（陰性對照）、pGBKT7-WDR1/pGBKT7-MYBPA2、pGB?KT7-WDR1/pGADT7-MYC2質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞中，吸取100 μL 涂布于SD/-Trp-Leu 營養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基平板上，30 ℃倒置2~4 d，觀察菌落生長情況，待菌落長出后接種到SD/-Trp-Leu-His-Ade 選擇性培養(yǎng)基上，30 ℃倒置2~4 d，待菌落長出后接種到SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal平板上，30 ℃倒置并觀察顏色變化。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，利用DNAMAN 6.0 進(jìn)行序列比對，Photoshop CS6 進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvWDR1、VvMYC2 擴(kuò)增

以‘早黑寶’葡萄cDNA 為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示分別擴(kuò)增出分子大小為1 011 bp，1 827 bp 的條帶，與NC?BI 公布的序列大小相符（圖1）。

圖1 WDR1、MYC2 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of WDR1 and MYC2

2.2 VvWDR1 序列分析

在NCBI 官網(wǎng)查找VvWDR1基因（GenBank登錄號：ABF66625），全長cDNA 序列1011 bp，編碼336 個氨基酸。利用ExPASy 網(wǎng)站在線工具ProtParam 對VvWDR1編碼蛋白的基本理化特性分析，結(jié)果得出該蛋白分子量約為37.8 kD，等電點(diǎn)為5.07，分子式為C1671H2588N458O518S11，不穩(wěn)定系數(shù)為54.60，推測其為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白中絲氨酸最多12.8%，其次亮氨酸8.3%、異亮氨酸7.7%，最少是半胱氨酸1.2%。使用Protscale 分析氨基酸序列親疏水性，推測該蛋白為疏水性蛋白。利用在線軟件SignalP-5.0 和TMHMM 進(jìn)行信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，顯示該蛋白無信號肽且不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。通過SPOMA 網(wǎng)站對VvWDR1編碼氨基酸序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白結(jié)構(gòu)原件比例是無規(guī)則卷曲39.29%，β-折疊26.79%，α-螺旋22.02%，β-轉(zhuǎn)角11.90%。SWISS MODEL 對三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測（圖2）。

圖2 VvWDR1 蛋白三級結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Tertiary structure of VvWDR1 protein

利用NCBI-CDD 數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分 析 發(fā) 現(xiàn)，VvWDR1編 碼 的 蛋 白 有5 個WD40 蛋白基序，具有WD40 典型的保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。

圖3 WDR1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain analysis of WDR1 protein

2.3 VvWDR1 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及同源序列比對

對牽?；?、草莓等11 種植物與VvWDR1同源的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），發(fā)現(xiàn)：VvW?DR1編碼的的氨基酸與牽?；ǎ≒harbitis nil）In?WDR1：AB232779、草 莓（Fragaria ananassa）FaTTG1：JQ989287、玉 米（Zea mays）ZmPAC1：AAM76724、陸 地 棉（Gossypium hirsutum）GhTTG1：AAM95641/GhTTG2：AAM95643、越橘（Vaccinium corymbosum）VcTTG1：MH717246、蘋果（Malus domestica）MdTTG1：AAF27919、茶樹（Camellia sinensis）CsWD40：QLI42590、葡 萄（Vitis vinifera）VvWDR1：ABF66625/VvWDR2：ABF66626、紫 蘇（Perilla frutescens）PfWD40：AB059642、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）AtTTG1：NM122360、矮 牽 牛（Petunia hybrida）PhAN11：AAC18941 等相似度較高（圖4），其中與PhAN11、AtTTG1的相似度分別高達(dá)81.95%、75.95%。

圖4 VvWDR1 編碼蛋白與其它物種WD40 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis between VvWDR1 encoded pro?tein and WD40 protein from other species

2.4 克隆載體構(gòu)建與鑒定

選取測序成功的pMD-WDR1、pMD-MYC2和空載體pGADT7、pGBKT7 同時(shí)用相對應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。經(jīng)雙酶切驗(yàn)證分別出現(xiàn)1011 bp的WDR1（圖5A）、1827 bp 的MYC2（圖5B）以及空載體pGBKT7（圖5C）、pGADT7（圖5D）目的條帶，測 序 結(jié) 果 顯 示W(wǎng)DR1（99.51%）、MYC2（99.34%）均在99%以上，且沒有出現(xiàn)移碼，編碼的蛋白沒有改變，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 克隆載體及表達(dá)空載體雙酶切Fig.5 Double digestion of cloning vector and empty expression vector

2.5 酵母重組載體的構(gòu)建及鑒定

雙酶切驗(yàn)證后，分別出現(xiàn)1011 bp 的pGB?KT7-WDR1（圖6A）、1827 bp 的pGBKT7-MYC2（圖6B）和pGADT7-MYC2（圖6C）的基因目的條帶，且測序結(jié)果同源性均在99%以上，表明，酵母重組載體構(gòu)建成功。

圖6 酵母重組載體雙酶切驗(yàn)證Fig.6 Double digestion verification of yeast recombinant vector

2.6 誘餌蛋白毒性和自激活檢測

將轉(zhuǎn)化的酵母單菌落及pGBKT7 空載體接種到5 mLSD/-Trp 營養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基后培養(yǎng)24 h 的OD600值均大于0.8（表2），證實(shí)：重組質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)化至酵母AH109 細(xì)胞中且對酵母均無毒害作用。

表2 誘餌載體OD600 平均值Table2 The average OD600 of bait plasmid

將上述轉(zhuǎn)化的酵母菌落接種到SD/-Trp/Xα-Gal平板上（圖7）。陽性對照及pGBKT7-MYBPA2的轉(zhuǎn)化酵母菌均出現(xiàn)藍(lán)色菌落。而pG?BKT7-WDR1、pGBKT7-MYC2的 轉(zhuǎn) 化 子 未 變藍(lán)，表明WDR1、MYC2編碼的蛋白不具有酵母自激活功能。

圖7 轉(zhuǎn)錄自激活活性分析Fig.7 Transcriptional activation activity analysis

2.7 酵母雙雜交互作分析

將pGBKT7-WDR1分別與pGADT7-MYB?PA2、pGADT7-MYC2共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞作為試驗(yàn)組，將pGBKT7-53 與pGADT7-T 作為陽性對照，pGBKT7-Lam 與pGADT7-T 作為陰性對照，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后均涂于SD/-Trp-Leu 營養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基平板上，倒置3 d 觀察菌落生長情況。將SD/-Trp-Leu 平板上生長良好的菌落接種于SD/-Trp-Leu-His-Ade 和 SD/-Trp-Leu-His-Ade/X?α?Gal平板上，二缺平板上菌落均有生長（圖8），表明載體已成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞；陽性對照和試驗(yàn)組均可以在四缺平板上生長，表明在酵母水平WDR1蛋白可以和MYBPA2、MYC2蛋白互作。在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal平板上，陽性對照和pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYC2共轉(zhuǎn)化酵母變藍(lán)，表明，WDR1蛋白可以和MYB?PA2、MYC2蛋白互作，且WDR1 和MYC2 蛋白在酵母中可以結(jié)合成穩(wěn)定的絡(luò)合物。

圖8 酵母雙雜交結(jié)果Fig.8 Result of yeast two-hybrid

3 討論

WD40 蛋白序列以N 端11-24 個殘基處GH（Gly-His）二肽開始，C 末端以WD（Trp-Asp）氨基酸結(jié)尾，因此稱為WD40 蛋白。這一類古老的蛋白家族結(jié)構(gòu)高度保守，一般含有4~16 個WD40 重復(fù)基序，序列在不同植物中也十分保守。本試驗(yàn)中從‘早黑寶’葡萄中分離的VvWDR1基因所編碼的蛋白具有5 個WD40 重復(fù)基序，與嚴(yán)莉等［33］的結(jié) 果 一 致。Matus［17］于2010 年 首 次 從 葡 萄 中 分 離出WDR1基因，并通過亞細(xì)胞定位確定其位于細(xì)胞核，異源表達(dá)WDR1基因可以促進(jìn)擬南芥花青素的積累。AtTTG1、PhAN11已被證實(shí)可參與植物花青素和原花青素等的生物合成［24］，本試驗(yàn)的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，葡萄WDR1 與AtTTG1，PhAN11 等聚為一類，這與Matus［17］的結(jié)果一致。

本試驗(yàn)中通過構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGB?KT7-WDR1，且通過試驗(yàn)證明其對酵母AH109 無細(xì)胞毒性。通過檢測AH109 報(bào)告基因MEL1的活性，證明誘餌載體pGBKT7-WDR1在酵母AH109中無自激活作用，該誘餌載體可用于篩選酵母雙雜交系統(tǒng)中與WDR1 互作的蛋白，這與王懷琴等［34］的結(jié)果相似。

WD40 為MYB-bHLH 相互作用提供了一個對接平臺，使MYB-WD40-bHLH 可以形成三元復(fù)合物從而調(diào)節(jié)花青苷等的生物合成［22］。前人研究證實(shí)擬南芥中的WD40 蛋白AtTTG1 可與TT2（MYB）、TT8（bHLH）相互作用從而調(diào)控其原花色素積累［28］。而對于葡萄中的WDR1 蛋白，在擬南芥中的異源表達(dá)研究證實(shí)了其可以調(diào)控?cái)M南芥花青素的合成［23］，并通過互作研究證明了WDR1可與一些MYB 和bHLH 蛋白互作從而調(diào)控花青素的合成，例如Xie 等［29］研究發(fā)現(xiàn)WDR1 蛋白可與MYBA1 蛋白互作正向調(diào)控葡萄漿果的顏色。酵母雙雜交結(jié)果表明，陽性對照pGBKT7-53與pGADT7-T和試驗(yàn)組pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYC2、pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYBPA2共轉(zhuǎn)化酵母在SD/-Trp-Leu-His-Ade 四缺平板上均正常生長，證實(shí)了葡萄WDR1 蛋白與MYB?PA2、MYC2 蛋白之間存在互作。這與前人在擬南芥［24］、草莓［25］、蘋果［28］中研究結(jié)果相似。此外，研究 表 明 ：DkMYB2-DkMYC1-DkWDR1［20］、AtTT2-AtTT8-AtTTG1［24］復(fù) 合 體 調(diào) 控 下 游 類 黃酮生物合成關(guān)鍵基因ANR、DFR等表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控原花色素合成；VcWDL2-VcMYBC1-Vcb?HLH［26］、MrWD40-1-MrMYB1-MrbHLH1［27］復(fù) 合體正向調(diào)控花青苷合成。因而，WD40 蛋白參與形成MBW 復(fù)合體，進(jìn)而調(diào)控類黃酮代謝。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)葡萄WDR1 與MYBPA2、MYC2 蛋白存在互作，推測葡萄WDR1 蛋白可能與MYBPA2、MYC2蛋白互作進(jìn)而調(diào)控原花色素和花青苷的積累。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)克隆得到葡萄WDR1基因，對其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；并在構(gòu)建酵母雙雜交表達(dá)載體pGBKT7-WDR1、pGADT7-MYC2、pGB?KT7-MYC2的基礎(chǔ)上，證實(shí)了VvWDR1在酵母體系中不具有轉(zhuǎn)錄自激活功能，且葡萄WDR1 與VvMYBPA2、VvMYC2編碼的蛋白存在互作。