薛亞鵬，李元陽，陳凌，王海崗，王瑞云，*，喬治軍*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031）

糜子（Panicum miliaceumL.）是禾本科黍?qū)俨荼局参?，又稱為稷、黍和糜黍［1］。糜子籽粒沒有黏性，糜穗長且細(xì)，長粒，可制作炒米，而黍籽粒有黏性，黍穗為條狀，圓形粒，葉片細(xì)長且尖，可用于釀酒［2］。糜子起源于中國［3］，主要種植在年降水量低于400 mm 的北方貧瘠旱地農(nóng)業(yè)區(qū)［4］，我國主要的糜子的生態(tài)栽培區(qū)有7 個，分別為黃土高原春夏糜子栽培區(qū)、南方秋冬糜子栽培區(qū)、北方春糜子栽培區(qū)、青藏高原春糜子栽培區(qū)、華北夏糜子栽培區(qū)、西北春夏糜子栽培區(qū)和東北春糜子栽培區(qū)［5］，黃土高原地區(qū)水分蒸發(fā)強(qiáng)、干旱缺水且氣溫較低，適宜糜子生長［6-7］。由于地區(qū)和氣候等諸多因素影響，異源四倍體糜子不同資源的DNA 信息繁雜［8］，不同種質(zhì)DNA 基因片段的差異有助于其種質(zhì)的準(zhǔn)確識別。

2003 年加拿大動物學(xué)家首次提出DNA 條形碼，將特定專有的條形碼及其代表的特定數(shù)字信息關(guān)聯(lián)種質(zhì)資源，直觀呈現(xiàn)種質(zhì)基因組信息，形成在特定領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用的信息庫［9］。SSR 標(biāo)記技術(shù)具有分布廣泛、操作簡單、多態(tài)性豐富等特點［10］?；贒NA 片段上的遺傳密碼差異，采用SSR 標(biāo)記技術(shù)，可以構(gòu)建該種質(zhì)特定的DNA 身份證。李清等［11］通過6 對SSR 引物，對大豆種質(zhì)的多態(tài)性DNA 片段進(jìn)行排序，構(gòu)建了廣東省96 份大豆種質(zhì)的DNA 身份證；武志江等［12］使用20 對核心引物，創(chuàng)建了145 份火龍果種質(zhì)的DNA 身份證；孫梟等［13］利用14 對SSR 引物對山楂資源進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建了48 份山楂種質(zhì)資源的DNA 身份證。

糜子種質(zhì)資源方面的研究較多。Hu 等［14］和王瑞云等［15］研究發(fā)現(xiàn)黃土高原糜子栽培區(qū)基因組的遺傳多樣性豐富，黃土高原可能是糜子起源地［16］。連帥等［17］通過5 個特異性SSR 標(biāo)記，對5 個不同生態(tài)區(qū)的糜子種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，表明糜子資源的多態(tài)性具有很強(qiáng)的地域性。雖然糜子基因組與遺傳多樣性的研究較多，但基于SSR標(biāo)記的分子身份證相關(guān)研究很少。為探索糜子起源地，保護(hù)山西省糜子的種質(zhì)資源，加強(qiáng)對品種的認(rèn)定和辨別，本試驗采用14 對高基元SSR 引物，對來自山西省糜子栽培區(qū)的20 份糜子種質(zhì)進(jìn)行糜子DNA 分子身份證的構(gòu)建，為準(zhǔn)確鑒定山西省的糜子種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取山西省地區(qū)的20 份糜子種質(zhì)作為試驗材料，詳情見表1。

表1 試驗用20 份糜子材料明細(xì)表Table 1 The detail of 20 broomcorn millet accessions used in the experiment

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取

室內(nèi)穴盤種植至三葉期，用CTAB 改良法［18］提取目標(biāo)DNA，然后檢驗DNA 的完整性和DNA濃度［15］。

1.2.2 SSR 引物篩選、PCR 擴(kuò)增和檢測

隨機(jī)選取代表性糜子材料6 份（表2），利用王瑞云等［15］構(gòu)建的五、六堿基引物共14 對進(jìn)行篩選，選擇條帶圖像清晰、多態(tài)性好的引物用于DNA 分子身份證的構(gòu)建。

表2 6 份代表性糜子材料明細(xì)表Table 2 List of 6 representative broomcorn millet materials selected in the experiment

PCR 擴(kuò)增體系為2×MasterMix10 μL（共20 μL）、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL（上下游引物的終濃度都0.4 μmoL·L-1）、蒸餾水7.4 μL 左右、試 驗 所 提 取 出 的DNA 模 板1 μL（30~80 ng·μL-1）。PCR 儀器程序設(shè)定數(shù)值為：預(yù)熱，94 ℃4 min；變性，94 ℃40 s，退火，72 ℃40 s；反應(yīng)總時長為8 min。

利用銀染檢測技術(shù)，檢測DNA 所對應(yīng)的酸性蛋白，檢測PCR 產(chǎn)物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)所獲得電泳凝膠的擴(kuò)增條帶的位置，在Excel 表中記錄整理基因型數(shù)據(jù)（若同一位置存在擴(kuò)增條帶記錄數(shù)據(jù)為1，同一位置不存在擴(kuò)增條帶記錄數(shù)據(jù)為0），并將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成為不同格式，以適應(yīng)不同的軟件計算實驗參數(shù)。用PowerMarker 3.25［19］和PopGen 1.32［20］軟件，計算SSR 遺傳多樣性參數(shù)；用ID Analysis 4.0 軟件創(chuàng)建字符串DNA分子身份證，再應(yīng)用條形碼生成器（http：//barcode.tec-it.com/zh）和在線二維碼生成軟件（https：//cli.im/）生產(chǎn)成條形碼和二維碼DNA身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性SSR 引物的篩選

從山西省選取共20 份糜子材料，從中隨機(jī)選取6 份材料，用五、六堿基引物共14 對SSR 引物篩選，結(jié)果表明，10 對引物能夠擴(kuò)增出條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的引物（表3），可作為分子身份證構(gòu)建的核心引物。其中，RYW1、2、3 為六堿基引物，RYW5、6、7、8、10、12、14 為五堿基引物。

表3 試驗篩選出的SSR 引物的序列及退火溫度Table 3 Sequence of SSR primers and annealing temperature

2.2 多態(tài)性引物遺傳參數(shù)的分析

用篩選出的10 對多態(tài)性堿基引物擴(kuò)增20 份糜子資源，由表4 可見，20 份材料在10 個位點共檢測出等位變異10 個，每個位點檢測到3 個（平均值為3.000 0）；其 中 有 效 等 位 變 異（Na）2.541 2（RYW2）~2.986 2（RYW1），平均值為2.808 8；Shannon 多樣性指數(shù)（I）1.011 5（RYW2）~1.096 3（RYW1），平均值為1.063 3；觀測雜合度（Ho）0.294 1（RYW7）~0.833 3（RYW2），平 均 值 為0.682 6；期望觀測雜合度（He）0.623 8（RYW2）~0.684 1（RYW1），平 均 值 為0.662 4；Nei′s 基 因 多樣 性 指 數(shù)（Nei）0.606 5（RYW2）~0.665 1（RYW1），平均值為0.643 3；多態(tài)性信息含量（PIC）0.571 1（RYW1）~0.796 2（RYW6），平均值為0.696 2。結(jié)果說明，10 對引物均具高度多態(tài)性（PIC>0.5）。

表4 10 個SSR 的遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Genetic parameters of the 10 polymorphic SSR markers used in the study

2.3 糜子DNA 分子身份證的構(gòu)建

高度多態(tài)性的10 對堿基引物RYW1、RYW2、RYW3、RYW5、RYW6、RYW7、RYW8、RYW10、RYW12、和RYW14 可用于區(qū)分糜子材料，通過排列組合方式，構(gòu)建與糜子種質(zhì)資源相應(yīng)的字符串，進(jìn)而編排成糜子DNA 分子身份證，得到山西省糜子分子ID（表5）。將糜子資源字符串輸入條形碼生成器中，生成相應(yīng)的條形碼分子ID。將糜子信息錄入，利用二維碼生成軟件系統(tǒng)，生成糜子的二維碼DNA 分子身份證（圖1）。

表5 20 份糜子資源的字符串DNA 分子身份證Table 5 Character string molecular ID of 20 common mil?let germplasms

圖1 20 份糜子材料條形碼與二維碼DNA 分子身份證Fig.1 Barcode and QR code DNA molecular ID cards of 20 common millet accessions

3 討論

前人研究表明，國內(nèi)不同生態(tài)區(qū)糜子資源的遺傳多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量分別為0.859 9和0.457 3，國外糜子資源的遺傳多樣性指數(shù)和多態(tài) 性 信 息 含 量 則 分 別 為0.841 5 和0.427 9［21-22］。本研究的遺傳多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量分別為1.063 3 和0.696 2，均高于前人研究結(jié)果，這可能與本研究使用的高基元SSR 有關(guān)，高基元SSR能夠檢測到低基元SSR 檢測不到的變異，相較低基元SSR，高基元SSR 更為準(zhǔn)確。

隨著種質(zhì)資源的頻繁交流，種質(zhì)混雜現(xiàn)象層出不窮，同時隨著新品種的選育推廣，種質(zhì)資源準(zhǔn)確鑒定和保護(hù)問題逐漸凸顯。分子身份證能夠有效區(qū)分地區(qū)和品種，且結(jié)果簡單明了，能夠廣泛應(yīng)用于大規(guī)模品種比對中［23］。分子身份證通過計算機(jī)進(jìn)行自動比對，高效、準(zhǔn)確。基于DNA 的分子身份證，是對種質(zhì)資源在遺傳分子層面上的區(qū)分鑒定，為種質(zhì)資源鑒定提供了更加精準(zhǔn)、科學(xué)的方法，同時為種質(zhì)相關(guān)的知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)及利用提供了重要保障。分子身份證構(gòu)建方法眾多，除SSR 標(biāo)記法外，常見的還有指紋圖譜法，指紋圖譜法通過對比電泳圖判斷物種個體差異，進(jìn)而構(gòu)建物種分子身份證。馬琳等［24］用DNA 指紋圖譜法構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜的分子身份證，樊曉靜等［25］通過SNP 標(biāo)記構(gòu)建茶樹品種資源指紋圖譜，構(gòu)建了103 份茶樹品種資源的分子身份證。指紋圖譜雖然在檢索種質(zhì)資源時更加快速便捷，但指紋圖譜法所得結(jié)果的條帶多、數(shù)據(jù)統(tǒng)計及結(jié)果分析困難，在大規(guī)模鑒定品種上十分不便?；诖饲叭瞬粩喔倪M(jìn)指紋圖譜方法，如高源等［26］用基于TP-M13-SSR 指紋圖譜的SSR 標(biāo)記法構(gòu)建了蘋果的分子身份證，TP-M13-SSR 指紋圖譜法雖改進(jìn)了傳統(tǒng)的指紋圖譜法，但是此法所需試驗儀器昂貴，對試驗人員的專業(yè)能力要求較高，試驗操作也更困難。SSR 標(biāo)記法構(gòu)建分子身份證技術(shù)成熟，操作簡便。同時SSR 標(biāo)記構(gòu)建DNA 分子身份證編碼方法多樣，常見的有以下3 種類型：0/1 代碼型根據(jù)凝膠電泳結(jié)果形成0、1 字符串［27］；等位基因編碼型根據(jù)擴(kuò)增的等位基因進(jìn)行DNA 編碼［28］；基因型編碼型根據(jù)引物擴(kuò)增的帶型進(jìn)行DNA 編碼［29］。本試驗采用0/1 代碼型SSR 標(biāo)記法編碼，該方法變于統(tǒng)計、字符串長短適中。

SSR 是一類由1~6 個堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù) 而 成 的DNA 序 列，如（GC）n、（ATT）n 等 重復(fù)［30］。SSR 標(biāo) 記 是 基 于PCR 技 術(shù) 的 一 種 分 子 標(biāo)記［31］，其中引物則根據(jù)不同的SSR 標(biāo)記而設(shè)計。前人選用不同的堿基引物構(gòu)建了品種分子身份證，董翔等［32］用3 對二堿基引物構(gòu)建莼菜的分子身份 證，張 嘉 等［33］利 用4 對 二 堿 基 引 物 構(gòu) 建66 個 芍藥品種的分子身份證。此外，部分研究將不同堿基相結(jié)合來構(gòu)建品種分子身份證，郭艷春等［34］用1對單堿基、4 對二堿基、4 對三堿基、1 對四堿基和2對五堿基構(gòu)建了61 份黃麻分子身份證，劉冠群等［35］用1 對二堿基、2 對三堿基、1 對五堿基和3 對六堿基對茶樹品種進(jìn)行分子身份證的構(gòu)建。本研究用10 對五、六堿基引物（7 對五堿基、3 對六堿基）進(jìn)行分子身份證的構(gòu)建，篩選出的引物符合分子身份證構(gòu)建所需要的堿基引物特征，同時高基元的堿基引物相較于低基元堿基引物，其試驗檢測效果好、多態(tài)性含量高，使得遺傳差異的精確度大幅度提高。本研究所構(gòu)建的分子身份證結(jié)合了先進(jìn)條碼技術(shù)，可用于商品包裝，進(jìn)而更好地管理種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

篩選出的10 對擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性好的堿基SSR 引物對山西省的20 份糜子種質(zhì)進(jìn)行鑒定，將山西省的糜子種質(zhì)品種及其近緣野生種和育成品種的信息資料進(jìn)行分類匯總，構(gòu)建了20 份糜子種質(zhì)的條形碼DNA 分子身份證和二維碼DNA 分子身份證。