沈悅，談美霞，范姝姝，高浩竣，武文娟，王敏，杜維俊，趙晉忠，岳愛琴*

（1.山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801；2.山西農業(yè)大學 基礎部，山西 太谷 030801）

大豆皂苷是大豆生長發(fā)育過程中形成的一類重要次生代謝產物，根、莖、葉和種子等中均有分布。國內外研究表明，大豆皂苷不僅在植物中可引起植物自身的防御反應，使植物體具有抗菌、抗病毒和抗蟲等抗性［1-3］；而且具有抑癌［4］、抗氧化［5］等多種對人體有益的生理功能，可開發(fā)成藥品或保健品。

大豆皂苷屬于三萜類齊墩果酸型皂苷，由2 種皂苷元（大豆皂醇A 和大豆皂醇B）和β-D-葡萄糖、β-D-半乳糖等6 種糖基以及其乙?；腔冉M成［6］。大豆皂苷根據(jù)其苷元不同分為A 類、DD?MP 類、B 類和E 類4 類［7-8］。其中A 類具有苦澀味，而且其生理活性低于DDMP 類、B 類和E 類皂苷［9-10］。因此，進一步解析A 類皂苷的代謝機制有利于改進大豆食品的口感和提高皂苷生物活性。大豆皂苷通過異戊二烯途徑合成［11］，首先通過甲羥戊酸途徑合成大豆皂苷的結構單元異戊烯二磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），然后在環(huán)化酶、細胞色素P450、尿苷二磷酸糖基轉移酶的催化作用下生成大豆皂苷［12］。其中細胞色素P450 多催化羥化反應，大豆皂苷元骨架β-香樹脂醇在細胞色素P450 家族成員CYP72A61 和CYP93E1 的催化下，分別將β-香樹脂醇C-22、C-24 位羥基化，形成大豆皂醇B［13-14］。大豆皂醇B 進一步在GmSg-5基因編碼的CYP72A69 酶的催化作用下將C-21位羥基化從而形成大豆皂醇A［15］。因此，對大豆皂醇A 合成的關鍵酶基因GmSg-5的啟動子序列和表達模式進行研究，可以為今后有目的改變大豆皂苷的組成提供理論基礎。

目前對于大豆GmSg-5基因在大豆A 類皂苷合成途徑中的序列分析及表達模式研究較少，因此，本文以晉遺30 為試驗材料，利用生物信息學手段對大豆GmSg-5基因蛋白理化性質和啟動子序列進行分析；采用熒光定量PCR 方法對GmSg-5基因組織表達模式、激素和脅迫誘導表達模式進行分析，為今后深入研究A 類大豆皂苷的合成及大豆品質改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由山西農業(yè)大學大豆遺傳育種課題組提供的大豆材料晉遺30 為研究對象。

2018 年種植大豆材料晉遺30 于山西農業(yè)大學農作站，開花期開花時間相同且在同一部位的花進行掛牌標記，分別取開花后25、32、40、50、60、70 d 籽粒，立即置于液氮，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中（光照16 h，黑暗8 h）水培養(yǎng)大豆材料15 d 至三葉完全展開，分別取根、莖、葉各2 份，1 份迅速置于液氮，?80 ℃保存用于組織表達分析，另1 份冷凍干燥用于測定A 類皂苷含量。

選取生長狀態(tài)一致的大豆幼苗進行茉莉酸甲酯（MeJA）（450 μmol·L-1）、ABA（200 μmol·L-1）、NaCl（150 mmol·L-1）、H2O2（330 mmol·L-1）、PEG-6000（100 mmol·L-1）脅迫處理，同時以相同培養(yǎng)條件不進行脅迫處理的幼苗作為對照。MJ、ABA、H2O2、PEG 分別在處理后0、3、6、9、12、24、36、48 h取幼苗根、葉；NaCl 處理參照孫雪麗等［16］方法在0、4、8、12、24、48、72 h 取根、葉。每個樣品3 次生物學重復。取樣后立即置于液氮速凍，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1GmSg-5基因克隆

采用TRIzol 法提取總RNA，參照TransS?cript?One-Step gDNA Removal and cDNA 試劑盒進行反轉錄獲得cDNA，參照NCBI 公布的GmSg-5基因序列（Glyma15g243300），利用Primer Pre?mier 5 設 計 引 物（GmSg-5-F1：5′-ATG?GAAGCAGCATGGGTCA-3′，GmSg-5-R1：5′-TTATTCATATTTCT-CCACCTTATGTAGA-3′）。以合成的cDNA 為模板，PCR 反應體系為總體積為15 μL，其 中2.1 μL cDNA 模 板（20 ng·μL-1），3 μL 5×buffer，引物各0.3 μL（10 μmol·L-1）、0.4 μL dNTP（10 μmol·L-1），0.3 μLTransStart FastP?fu（5 U），8.6 μL ddH2O。PCR 程 序 為95 ℃5 min；95 ℃1 min，52 ℃45 s，72 ℃2 min，32 次 循環(huán)；72 ℃10 min，15 ℃保存。在1.2%瓊脂糖凝膠中檢測擴增產物，回收目標片段，連接pEASYBlunt 載體并送生工測序。

1.2.2GmSg-5基因生物信息學分析

利 用GenBank Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行基因序列檢索；利用Ex?PASy-Protparam（https：//web.expasy.org/cgibin/protparam/protparam）分析GmSg-5 蛋白質理化性質；利用SOPMA（http：//bip.weizmann.ac.il/bio tools/faq.html）進行蛋白質二級結構分析；利 用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html）進行三級結構分析；利用Clustalw 軟件對GmSg-5基因編碼蛋白的氨基酸序列進行多序列比對；利用MG2C2.0（http：//mg2c.iask.in/mg 2c_v2.0/）進行染色體定位；利用NetPhos3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進行蛋白質磷酸位點預測分析；利用在線軟件Plant?CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webt?ools/plantcare/html/）預測啟動子的順式作用元件。

1.2.3 A 類皂苷的提取及測定

參考岳愛琴等［17］測定大豆皂苷的方法，采用HPLC-ESI-MS/MS 測定A 類皂苷各組分含量，樣品中A 類皂苷含量為Aa、Au、Ax、Ay、Ae、Ag、Ab、Ac、Ad、Az、Af、Ah、A0-αg、A0-βg、A0-αa、A0-βa、A0-γg、A0-γa 各組分含量之和。

1.2.4GmSg-5基因表達分析

利用Bio-Rad CFX96 實時熒光定量PCR 儀，采 用 全 式 金TransStart?Tip Green qPCR Super?Mix 試劑盒進行熒光定量PCR。根據(jù)GmSg-5基因的序列，利用Primer Premier 6 軟件設計實時熒光 定 量 PCR 引 物（GmSg-5-qF2：5′-TGCT?GATACTGATACTGGCTCT-3′，GmSg-5-qR2：5′-AATGTCTCC-TTCGTGTCCC-3′），Tubulin為 內參 基 因（GmTubulin-qF：5′-AACCTCCTCCT?CATCGTA-CT-3′，GmTubulin-qR：5′-GACAG?CATCAGCCATGTTCA-3′）。qRT-PCR 反應總體積為20 μL，含10 μL 2×Tip Green qPCR Super?Mix，0.4 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），引 物 各0.4 μL（10 μmol·L-1），ddH2O 6.8 μL，2 μL cDNA 模板。qRT-PCR 程 序 為94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃10 s，45 次循環(huán)，3 次重復。采用2-△△CT法計算GmSg-5的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 GmSg-5 基因的克隆

利用GmSg-5-F1/GmSg-5-R1 引物對GmSg-5基因進行擴增，電泳檢測結果在1200~2000 bp之間有1 條清晰明亮的條帶（圖1）。序列分析結果顯示，目的基因序列長度為1787 bp，包括107 bp 5′-UTR、1536 bp CDS 序列和144 bp 3′-UTR，編碼511 個氨基酸，具有ECKLFY、WQAR、EVLR和PERF 基序（圖2）。根據(jù)GmSg-5基因在染色體上的位置信息，繪制GmSg-5基因染色體分布圖（圖3），GmSg-5基因位于15 號染色體上。

圖1 大豆GmSg-5 基因的克隆Fig.1 Amplified fragment of GmSg-5 gene in soybean

圖2 大豆GmSg-5 蛋白與其他植物氨基酸序列的多序列比對Fig.2 Multiple alignment results of GmSg-5 proteins from different plant

圖3 GmSg-5 基因的染色體定位分析Fig.3 Chromosome localization analysis of GmSg-5 gene

2.2 GmSg-5 基因編碼蛋白理化性質分析

蛋白基本理化性質分析結果顯示，GmSg-5基因編碼蛋白質相對分子量為58.6 kD，理論等電點（pI）為8.95，不穩(wěn)定指數(shù)為39.97，屬于穩(wěn)定蛋白。平均親水性系數(shù)為?0.219，推測為親水性蛋白。

GmSg-5 蛋白質二級結構預測結果顯示，α-螺旋占得比例最大為52.25%，無規(guī)則卷曲占30.53%，延伸鏈和β-折疊分別占11.94% 和5.28%（圖4）。三級結構分析結果顯示GmSg-5蛋白質主要由HEME 和CPR 兩個結構域構成（圖5），CPR 結構域催化NAD（P）H 與H+反應失去電子生成NAD（P）+，HEME 結構域催化大豆皂醇B的C21 位R-H 與O2反應，將大豆皂醇B 的C21 位羥基化從而生成大豆皂醇B。磷酸化位點預測結果顯示，該蛋白質含有22 個絲氨酸，11 個蘇氨酸，5個酪氨酸磷酸位點（圖6）。

圖4 GmSg-5 蛋白的二級結構Fig.4 Prediction of secondary structure of GmSg-5

圖5 GmSg-5 蛋白的三級結構Fig.5 Predicted tertiary structure of GmSg-5

圖6 GmSg-5 磷酸化位點預測Fig.6 Pridiction of phosphorylation sites in GmSg-5

2.3 GmSg-5 啟動子順式作用元件分析

對GmSg-5基因起始位點ATG 上游2 000 bp的啟動子序列進行了順式作用元件的預測和分析，結果顯示GmSg-5基因啟動子有ARE、MYB、WUN-motif 等 逆 境 響 應 元 件，CGTCA-motif、TGA-element、TGACG-motif 等 激 素 響 應 元件（表1）。

表1 GmSg-5 啟動子中的順式作用元件Table 1 Cis-acting elements in GmSg-5 promoter

2.4 GmSg-5 基因的表達分析

2.4.1GmSg-5基因不同組織表達模式分析

采用HPLC-ESI-MS/MS 法對根、莖、葉不同組織A 類皂苷含量進行測定。結果顯示根中A 類皂苷含量最高為19.4 mg·g-1，顯著高于莖中A 類皂苷含量（圖7）。

圖7 不同組織中A 類皂苷含量Fig.7 The content of group A saponins in different organs

GmSg-5基因的組織表達模式結果表明GmSg-5基因在根、莖、葉中均有表達，其中根中相對表達量最高，葉次之，莖最低（圖8），與根、莖、葉中A 類皂苷含量趨勢一致。

2.4.2GmSg-5基因籽粒發(fā)育過程表達模式分析

采用HPLC-ESI-MS/MS 法對不同發(fā)育時期大豆籽粒A 類皂苷含量進行測定。結果顯示A 類皂苷含量呈先增高后降低的趨勢，開花后40 d 和50 d 籽粒中A 類皂苷含量最高（圖9）。

圖9 不同時期大豆籽粒中A 類皂苷含量Fig.9 The content of group A saponins in different periods

對GmSg-5基因在晉遺30 不同發(fā)育時期籽粒中的表達進行分析（圖10）。GmSg-5基因在籽粒不同發(fā)育時期的表達呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在開花后50 d 籽粒中GmSg-5基因表達量最高。不同發(fā)育時期GmSg-5基因表達差異與A 類皂苷含量差異趨勢一致。

圖10 GmSg-5 在籽粒不同發(fā)育時期的表達分析Fig.10 Expression analysis of GmSg-5 in seeds at different devel?opmental stages

2.4.3GmSg-5基因對脅迫的響應分析

為探究GmSg-5是否與激素和逆境響應相關，對大豆幼苗進行MJ、ABA、H2O2、PEG 和NaCl 脅迫處理，檢測處理不同時間該基因的表達情況。

MJ 處理后，根中GmSg-5基因相對表達量呈持續(xù)上調趨勢，處理3 h 和6 h 時表達量顯著高于對照，3 h 上調最顯著，6 h 達到峰值，約為對照的2.4 倍（圖11A）。葉中GmSg-5基因相對表達量呈先升后降的趨勢，3 h 顯著高于對照，6 h 和9 h 顯著低于對照（圖11B）。

ABA 激素處理條件下，根中GmSg-5基因呈持續(xù)上調趨勢，36 h 達峰值，約為對照的225.4 倍（圖11C）；而葉中相對表達量受到顯著抑制（P<0.05），48 h 達最 低值，約為對照的0.05 倍（圖11D）。

H2O2處理下，根和葉中GmSg-5基因相對表達量均呈先抑制后上調的趨勢。其中根中脅迫3 h時GmSg-5基因表達顯著下調，24 h 開始顯著上調，48 h 達到峰值，約為對照的5.7 倍；葉中H2O2脅迫呈持續(xù)上調的趨勢，24 h 達到峰值，約為對照的36.5 倍（圖11E，圖11F）。

PEG 處理下，脅迫3、12 h 時根中GmSg-5基因表達顯著下調，6 h 后相對表達量無明顯的變化趨勢（圖11G）；葉中相對表達量呈持續(xù)上調的趨勢，12 h 顯著上調（P<0.05）并達到峰值，約為對照組的228.6 倍（圖11H）。

NaCl 處理下該基因相對表達情況顯示，根中GmSg-5基因相對表達量呈持續(xù)顯著上調趨勢，24 h 最大約為對照組的41.5 倍（圖11I）；葉中相對表達量呈先下調后上調趨勢，48 h 達最大值，約為對照組的15.4 倍（圖11J）。

圖11 激素及非生物脅迫處理下GmSg?5 基因表達分析Fig.11 Relative expression of GmSg-5 gene under hormone treatment and abiotic stress

3 討論

GmSg-5基因是大豆A 類皂苷合成的關鍵酶，Yano 等［15］通 過 遺 傳 定 位 分 析 發(fā) 現(xiàn) 大 豆15 號 染 色體上的GmSg-5基因編碼的細胞色素蛋白CYP72A69，可以將大豆皂醇B 的C21 位羥基化，合成大豆皂醇A，但未對GmSg-5基因蛋白質結構進行分析。本研究對GmSg-5基因蛋白質結構分析發(fā)現(xiàn)其二級結構主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，三級結構主要由HEME 和CPR 兩個結構域構成。張玲玲等［18］通過研究細胞色素P450 脂肪酸單加氧酶P450BM3 結構與功能的關系，也發(fā)現(xiàn)真核細胞中的細胞色素蛋白大多含有HEME 和CPR兩個結構域。GmSg-5基因蛋白質磷酸位點預測結果顯示含有38 個磷酸位點，推測該基因可能在這些磷酸化位點處發(fā)生磷酸化，從而調節(jié)該蛋白質的活性。

通過qRT-PCR 分析GmSg-5基因組織差異模式，結果顯示該基因在根中相對表達量最高，其次是葉、莖，這結果與前人的研究結果相符［19］。Rehman 等［19］分 析 了 來 自 大 豆 中 的11 個CYP72A基因在花、莖頂端分生組織、葉、根、根毛、豆莢和結節(jié)中的相對表達情況，發(fā)現(xiàn)這些基因在根中的表達量最高，在花、葉、莖頂端分生組織中的表達量最低。對GmSg-5基因籽粒不同發(fā)育時期的表達進行分析，結果顯示GmSg-5基因的表達呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在開花后50 d 籽粒中GmSg-5基因表達量達到最大。籽粒不同發(fā)育時期GmSg-5基因的表達與A 類皂苷的積累基本一致，本研究進一步說明GmSg-5基因在A 類皂苷代謝中起著關鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)植物中皂苷含量水平受外界因素影響顯著，如溫度，光照，水等［20］。Mao 等［21］在研究擬南芥中細胞色素CYP709B亞族中的CYP709B 1、CYP709B2和CYP709B3的突變體對鹽脅迫的響應時，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫誘導了CYP709B3基因的表達。Koo 等［22］研究發(fā)現(xiàn)CYP94B 和CYP94C 可被干旱、鹽脅迫等脅迫誘導。但目前還沒有關于大豆A 類皂苷合成的關鍵酶基因GmSg-5應對非生物脅迫及激素誘導下響應情況的相關研究。本研究對GmSg-5基因的啟動子序列進行了順式作用元件的預測和分析發(fā)現(xiàn)該基因的啟動子含有脅迫響應、傷害響應、激素響應等多種順式作用元件，表明GmSg-5基因可能參與調控復雜的非生物脅迫響應。進一步利用qRT-PCR 方法分析激素和脅迫誘導表達模式分析發(fā)現(xiàn)H2O2、PEG 和NaCl 脅迫處理均誘導了根和葉中GmSg-5基因的表達；激素MJ、ABA 處理誘導根中GmSg-5基因的表達，且抑制葉中該基因的表達。本研究結果表明GmSg-5基因在逆境脅迫及激素誘導中起正調節(jié)因子的作用。

4 結論

GmSg-5基因編碼蛋白主要由HEME 和CPR兩個結構域構成，共檢測到38 個磷酸位點。GmSg-5基因啟動子有ARE、MYB、CGTCA-mo?tif 等逆境響應和激素響應元件。GmSg-5基因在苗期不同組織和籽粒不同發(fā)育時期均有表達，其表達與A 類皂苷含量基本一致。GmSg-5基因參與 響 應H2O2、PEG 和NaCl 非 生 物 脅 迫 及MJ、ABA 激素誘導。