樊利虹，王之盛，左之才，*，才冬杰，易 軍，馬曉平，茍麗萍，王 巍

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川 成都 611130；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066)

皮特不動(dòng)桿菌()屬于莫拉菌科，不動(dòng)桿菌屬，不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性球桿菌，其廣泛存在于自然界，可定植在土壤、污水、蔬菜、皮膚、醫(yī)療器械等環(huán)境中。該菌的營(yíng)養(yǎng)需求不高，能夠在以乙酸為唯一碳源，氨為唯一氮源的礦物介質(zhì)中生長(zhǎng)，并且在25～41℃之間都能生長(zhǎng)；其生化特性與大部分不動(dòng)桿菌相似，嚴(yán)格好氧，氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性，葡萄糖非發(fā)酵型，吲哚陰性。近年來，皮特不動(dòng)桿菌的臨床分離率逐漸升高。在引起人類的感染中，皮特不動(dòng)桿菌被報(bào)道為院內(nèi)感染重要的條件致病菌，可導(dǎo)致院內(nèi)病人菌血癥、肺部和尿路感染等；還可引起水生動(dòng)物武昌魚、泥鰍和斑馬魚的菌血癥，也可能與犬貓呼吸道疾病(化膿性鼻炎和支氣管炎)有關(guān)。但目前關(guān)于肉牛源皮特不動(dòng)桿菌相關(guān)的報(bào)道極少。

隨著肉牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因長(zhǎng)途運(yùn)輸所致的肉牛呼吸道綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)時(shí)有發(fā)生，給肉牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因?qū)е略摬〉牟≡N類繁多，防控難度加大，深入研究其繼發(fā)或伴發(fā)感染細(xì)菌的生物特性利于提高對(duì)發(fā)生BRDC的新認(rèn)識(shí)。2018年來，我們多次從發(fā)生BRDC且病情反復(fù)的病牛鼻拭子中分離到不動(dòng)桿菌，包括有鮑曼不動(dòng)桿菌、皮特不動(dòng)桿菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌等，本文對(duì)5株皮特不動(dòng)桿菌的分離情況、生化特性、16S rDNA和基因序列同源性分析及多位點(diǎn)序列分型(MLST)進(jìn)行了研究，以期對(duì)該菌的生物特性有新的認(rèn)識(shí)，為臨床皮特不動(dòng)桿菌感染的重視和用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

皮特不動(dòng)桿菌分離自2018年7月四川南充(ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6和ZZCNC1807-7)、宜賓(ZZCJL1807-8)、什邡(ZZCSF1807-9)等地發(fā)生呼吸道疾病肉牛的鼻腔拭子。發(fā)病牛表現(xiàn)有體溫升高(達(dá)41℃)、流鼻液、呼吸困難、口有泡沫、部分牛有口腔潰瘍等癥狀，但蹄部、關(guān)節(jié)等無異常，有阿莫西林、青霉素、頭孢喹肟、氟苯尼考、替米考星、板藍(lán)根等用藥史，但病情總是反復(fù)。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、革蘭氏染色液、血液瓊脂基礎(chǔ)(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；微量生化管(杭州微生物試劑有限公司)；瓊脂粉、GoldView Ⅰ核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DL 2000 DNA Marker(天根生化科技北京有限公司)；Premix Taq(寶生物工程大連有限公司)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)[18]設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rDNA基因通用引物和引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，稀釋至10 μmol·L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)用引物序列

1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)特性

將5株皮特不動(dòng)桿菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。再分別劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、兔血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；并挑取單個(gè)菌落涂片、革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.5 生化特性

對(duì)菌株進(jìn)行氧化酶、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、側(cè)金盞花醇、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽、硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、硫化氫、吲哚、MR-VP和明膠等生化試驗(yàn)。依據(jù)細(xì)菌微量生化管說明書判定生化試驗(yàn)結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行結(jié)果分析。

1.6 16S rDNA和gyrB序列擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析

提取菌株的基因組DNA，進(jìn)行16S rDNA和基因序列擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和進(jìn)行同源性分析。

1.7 MLST分型

參照文獻(xiàn)[21-22]，根據(jù)MLST(Pasteur)數(shù)據(jù)庫公布的7個(gè)看家基因(60、、、、、、)的引物序列對(duì)分離細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將所得序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫比對(duì)，進(jìn)行序列型(sequencetype，ST)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 革蘭氏染色形態(tài)

5株皮特不動(dòng)桿菌菌體形態(tài)相似，均為球桿狀的革蘭氏陰性菌(圖1)。

圖示A、B、C、D、E分別代表菌株ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8、ZZCSF1807-9。下同。

2.2 菌落形態(tài)觀察

37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，5株菌在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)大小均相似。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上呈圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、微隆起、不透明的白色菌落(圖2 A1-E1)；在血平板上培養(yǎng)均無溶血現(xiàn)象，菌落呈白色圓形，邊緣半透明(圖2 A2-E2)；在麥康凱培養(yǎng)基上呈圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、微隆起、不透明的淡橘色菌落(圖2 A3-E3)；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上呈圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、微隆起、不透明的淡紫色菌落(圖2 A4-E4)。

圖示1、2、3、4分別代表各菌株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

5株菌的氧化酶、覃糖、血清菊糖、側(cè)金盞花醇、水楊素、硝酸鹽還原、苯丙氨酸、七葉苷、吲哚、硫化氫、明膠和VP試驗(yàn)均為陰性；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、DNA酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧、動(dòng)力試驗(yàn)均為陽性。各菌株間比較發(fā)現(xiàn)，部分菌株的部分生化特性與其他菌株完全不同，表現(xiàn)在ZZCNC1807-6蔗糖、甘露醇、丙二酸鹽、MR試驗(yàn)為陽性；ZZCNC1807-7的乳糖、蔗糖、丙二酸鹽、甘露醇試驗(yàn)為陽性；ZZCSF1807-9的枸櫞酸鹽、精氨酸雙水解試驗(yàn)為陽性，丙二酸鹽試驗(yàn)為陰性；ZZCNC1807-4和ZZCJL1807-8的生化特性完全一致。綜上可見，來自于牛源的5株菌表現(xiàn)出4種不同的生化類型，其中ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCSF1807-9的部分生化特性如乳糖、MR試驗(yàn)、枸櫞酸鹽、精氨酸雙水解試驗(yàn)等發(fā)生了變化(表2)。

表2 部分生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 菌株16S rDNA序列分析

5株菌的16S rDNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為1 500 bp(圖3)，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，與皮特不動(dòng)桿菌的同源性為99%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)顯示：5株菌均與皮特不動(dòng)桿菌(NR117930和NR117621)同在一個(gè)分支，表明與皮特不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系最近。16S rDNA序列同源性分析結(jié)果(圖5、表3)顯示：5株菌的同源性為100%，均與來源于血液(人)、太陽鳥泄殖腔液皮特不動(dòng)桿菌的同源性為100%，與豇豆源皮特不動(dòng)桿菌的同源性為99.9%，與痰液、城市污水、泥鰍皮特不動(dòng)桿菌的同源性達(dá)99.5%，與麥田、根際土壤、武昌魚、鰱魚、白紋伊蚊幼蟲源的同源性為90%以上，而與石油污染土壤中分離的皮特不動(dòng)桿菌同源性僅達(dá)81%。

M，DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，陰性對(duì)照；2～6，ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8、ZZCSF1807-9。下同。

圖4 16S rDNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖5 16S rDNA基因同源性分析

表3 皮特不動(dòng)桿菌的16S rDNA參考序列

2.5 菌株gyrB基因序列分析

5株菌的基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為700 bp(圖6)，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，與皮特不動(dòng)桿菌的同源性為99%。基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)顯示：5株菌均與皮特不動(dòng)桿菌(LC102633)聚類在一起，而ZZCSF1807-9與另4株菌并未完全聚集在同一分支。基因序列同源性分析結(jié)果(圖8、表4)顯示：ZZCSF1807-9與另4株菌的同源性僅為97.1%，而其余4株菌之間的同源性為100%；ZZCSF1807-9與澳大利亞(CP042364)、韓國(guó)(CP017938)、馬來西亞(CP014477)人源皮特不動(dòng)桿菌的同源性分別為99.7%、98.5%、97.4%，另4株菌與其同源性分別為97.4%、97.1%、99.7%；ZZCSF1807-9與河南魚源(CP035109)皮特不動(dòng)桿菌的同源性為97.9%，另4株菌與其同源性為99.1%；而5株菌與表中其他來源的皮特不動(dòng)桿菌的同源性均低于50%。根據(jù)上述結(jié)果，可初步將5株菌分為兩類：ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8為一類，ZZCSF1807-9為另一類。

圖6 分離菌株gyrB序列PCR擴(kuò)增

圖7 gyrB基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖8 gyrB基因同源性分析

表4 皮特不動(dòng)桿菌的gyrB參考序列

2.6 MLST分型

將上述7個(gè)管家基因PCR產(chǎn)物交由上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)整理后上傳MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，再將5株菌與其他ST型菌株進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示(圖9)，菌株ZZCSF1807-9為ST214型，其余4株菌分型結(jié)果一致，與ST321型最為接近。

圖9 MLST聚類分析結(jié)果

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，不動(dòng)桿菌感染發(fā)病率呈一個(gè)全球季節(jié)性模式，發(fā)病率峰值出現(xiàn)在夏季/溫暖月份，而低谷出現(xiàn)在冬季/寒冷月份。本實(shí)驗(yàn)中的皮特不動(dòng)桿菌來源于高溫多雨的夏季從患有呼吸道疾病的肉牛鼻拭子中分離得到。通過對(duì)5株菌進(jìn)行菌體形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化特性研究，以及16S rDNA和基因序列聚類等研究發(fā)現(xiàn)，該5株菌的菌體形態(tài)和培養(yǎng)特性與大部分不動(dòng)桿菌一致。將生化結(jié)果與不同來源菌株之間比較顯示，來自患呼吸道疾病肉牛的5株皮特不動(dòng)桿菌和印度淡水魚源皮特不動(dòng)桿菌均可以利用葡萄糖和阿拉伯糖，而Li等報(bào)道的3株武昌魚源皮特不動(dòng)桿菌的葡萄糖和阿拉伯糖試驗(yàn)均為陰性；5株來自肉牛呼吸道的皮特不動(dòng)桿菌與武昌魚源菌株的賴氨酸脫羧酶均為陽性，而印度淡水魚源皮特不動(dòng)桿菌為陰性。同時(shí)，5株分離菌之間比較發(fā)現(xiàn)，ZZCSF1807-9與其余4株菌的部分生化特性存在不同。其中，ZZCSF1807-9的枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果為陽性、丙二酸鹽為陰性，而另4株菌枸櫞酸鹽為陰性、丙二酸鹽為陽性；且菌株ZZCSF1807-9的精氨酸雙水解試驗(yàn)結(jié)果與引起武昌魚發(fā)生敗血癥死亡的皮特不動(dòng)桿菌一致，為陰性，而另4株菌為陽性。這可能因生活環(huán)境的不同，部分菌株為增強(qiáng)其環(huán)境適應(yīng)力而導(dǎo)致細(xì)胞壁增厚，阻礙了某些酶的分泌，使其生化反應(yīng)發(fā)生改變。

因皮特不動(dòng)桿菌與醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體中的其他成員的基因組和表型特征非常接近，16S rDNA基因序列的多態(tài)性不足以將其完全區(qū)分開，因此進(jìn)一步對(duì)5株菌進(jìn)行了基因序列分析和MLST分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZZCSF1807-9與其余4株菌存在進(jìn)化距離，同源性僅為97.1%。同時(shí)，將5株菌與其它來源的皮特不動(dòng)桿菌進(jìn)行同源性分析顯示，ZZCSF1807-9與人源皮特不動(dòng)桿菌之間的同源性較高，為99.7%；而其余4株菌與分離自患病魚類皮特不動(dòng)桿菌的同源性較高，為99.1%。MLST分型結(jié)果顯示，ZZCSF1807-9為ST214型，與2012年和2017年院內(nèi)病人痰液、尿液分離株為同一型；其余4株與ST321型最為接近，而目前報(bào)道的ST321型分離株主要來自院內(nèi)病人的血液和下呼吸道。但該5株菌的MLST型均與被報(bào)道可能為引起魚類感染的優(yōu)勢(shì)菌株ST839型皮特不動(dòng)桿菌不同。上述情況發(fā)生可能因宿主不同或地域環(huán)境差異，以及抗菌藥物的大量使用，而導(dǎo)致不同來源菌株的基因發(fā)生改變。

綜上可見，牛源皮特不動(dòng)桿菌在部分生化特性表型(如葡萄糖、阿拉伯糖、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽和精氨酸雙水解等)和基因以及MLST分型出現(xiàn)了變化；揭示了在不同地域或養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境的影響下，皮特不動(dòng)桿菌的生化特性以及毒力強(qiáng)弱會(huì)發(fā)生一些適應(yīng)性的變化。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為探究該養(yǎng)殖場(chǎng)皮特不動(dòng)桿菌的感染來源及其傳播途徑提供一定的參考，然而關(guān)于該菌是否與肉牛呼吸道疾病的發(fā)生有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。