夏 青，才冬杰，方 靜，王之盛，鄧俊良，易 軍，左之才，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川 成都 611130；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066)

放牧牦牛在草枯期會(huì)長(zhǎng)期處于饑餓狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體血糖下降，血液BHBA濃度升高，機(jī)體抵抗力下降；極易因感染細(xì)菌、病毒等造成牦牛發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率死亡率升高。而BAMs是牛肺部重要的免疫防御細(xì)胞之一，它參與病原吞噬、抗原遞呈以及炎癥反應(yīng)等過(guò)程，能有效抵御外來(lái)病原菌的侵入。BHBA在機(jī)體處于能量負(fù)平衡時(shí)可作為ATP 的替代能源供給，但近年來(lái)研究報(bào)道，BHBA除了作為能源物質(zhì)外，其濃度的升高與過(guò)渡期間奶牛發(fā)生的子宮內(nèi)膜炎和乳腺炎有一定關(guān)系，可作為信號(hào)分子激活p38MAPK、NF-κB等炎癥信號(hào)傳導(dǎo)途徑。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度BHBA通過(guò)激活中性粒細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。這些研究表明，BHBA也可能與BAMs發(fā)生炎癥反應(yīng)有關(guān)，但其潛在機(jī)制尚不清楚。因此，本次試驗(yàn)的目的就是利用BHBA誘導(dǎo)牛肺泡巨噬細(xì)胞后，探討其能否促進(jìn)IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的釋放，為深入探究BHBA與肺部免疫功能之間的關(guān)系奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

β-羥丁酸(Sigma，美國(guó))，低糖DMEM培養(yǎng)基(Solarbio，中國(guó))，胎牛血清[生工生物工程(上海)股份有限公司，中國(guó)]，CCK-8試劑盒(碧云天，中國(guó))，Premix酶、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(TaKaRa，日本)，IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司，中國(guó))，GPR109A、p38MAPK、NF-κB、PPARγ 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列[生工生物工程(上海)股份有限公司，中國(guó)]。

1.2 方法

1.2.1 BAMs的分離與分組

按照實(shí)驗(yàn)室以前的方法，采集健康牦牛帶有12 cm氣管的完整肺部，PBS(無(wú)菌并含有青霉素200 U·mL，鏈霉素200 μg·mL)洗凈肺表面，再將PBS經(jīng)氣管灌入肺部，適當(dāng)輕揉肺部，收集灌洗液。灌洗液經(jīng)200目紗布過(guò)濾，1 200×離心6 min，收集細(xì)胞沉淀。再用PBS洗滌細(xì)胞，1 200×離心6 min。加細(xì)胞培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清)重懸細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，置于5% CO、37 ℃細(xì)胞孵育箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)6 h，用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，胰酶消化并重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算細(xì)胞存活率。將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10mL，分裝于細(xì)胞板中，置于細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3 h。加4 mmol·L終濃度BHBA進(jìn)行誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)后的0、3、6、12、24 h收集上清液和下層細(xì)胞(每組設(shè)置3個(gè)平行)，以及使用0、1、2、4 mmol·LBHBA分別誘導(dǎo)BAMs 12 h后收集上清液和下層細(xì)胞(每組設(shè)置3個(gè)平行)。

1.2.2 BHBA的配制

用無(wú)菌去離子水(ddHO)溶解BHBA，分別配制1、2、4、8、16、32 mmol·L6個(gè)濃度梯度，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 BHBA對(duì)牛肺泡巨噬細(xì)胞活力的影響

使用CCK-8法檢測(cè)BAMs在不同濃度的BHBA處理不同時(shí)間后的細(xì)胞活力。將1×10mL的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，置于5% CO、37 ℃細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)6 h。細(xì)胞完全貼壁后，分別加入濃度為0、1、2、4、8、16、32 mmol·L的 BHBA(每種處理濃度做6個(gè)平行)，再分別孵育12、24 h。最后，將10 μL CCK-8溶液添加到每個(gè)孔中，并將96孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞在450 nm處的吸光度，再計(jì)算出細(xì)胞活力。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BAMs109、38、-、mRNA表達(dá)水平

采用Trizol法提取培養(yǎng)BAMs總RNA，并測(cè)定總RNA濃度及純度。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA保存于-20 ℃。以cDNA為模板，檢測(cè)109、38、-、基因的mRNA表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。cDNA進(jìn)行10～10的10倍系列稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Premix6 μL，模板5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)后檢測(cè)熒光。

表1 各基因?qū)崟r(shí)熒光定量引物序列

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定BAMs上清1L-1β、IL-6、TNF-α水平

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞上清中1L-1β、IL-6、TNF-α促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

用CCK-8法檢測(cè)不同濃度BHBA對(duì)BAMs的細(xì)胞活力影響可見(jiàn)，在添加BHBA培養(yǎng)12 h后，1、2、4 mmol·L三組與對(duì)照組差異不顯著，8 mmol·L組差異顯著(<0.05)，16、32 mmol·L組差異極顯著(<0.01)(圖1-A)。添加BHBA培養(yǎng)24 h后的結(jié)果與12 h的結(jié)果相似，1、2、4 mmol·L三組與對(duì)照組差異不顯著，8、16、32 mmol·L組差異極顯著(<0.01)(圖1-B)。結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，用1、2、4 mmol·L的BHBA刺激BAMs 12、24 h后，其細(xì)胞活力沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，選擇該3個(gè)濃度做后續(xù)試驗(yàn)。

*，表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；**，表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.2 BHBA對(duì)BAMs GPR109A、p38MAPK、NF-κB、PPARγ mRNA表達(dá)量的影響

采用qRT-PCR檢測(cè)BAMs中109、38、-、mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，4 mmol·L的BHBA處理BAMs 0、3、6、12、24 h后，109mRNA表達(dá)量在6 h時(shí)顯著上調(diào)(<0.05)，且呈時(shí)間依賴效應(yīng)上調(diào)；38mRNA表達(dá)量于12 h達(dá)到最高；-mRNA表達(dá)量在6、12、24 h極顯著上調(diào)(<0.01)；mRNA表達(dá)量在3、6 h極顯著上調(diào)(<0.01)，但隨后12、24 h呈下調(diào)趨勢(shì)(圖2)。

圖2 BHBA誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)牛肺泡巨噬細(xì)胞GPR109A、p38MAPK、NF-κB、PPARγ基因表達(dá)的影響

不同濃度的BHBA作用于BAMs 12 h后，與對(duì)照組相比，109、38、-mRNA表達(dá)量均隨濃度的增加而上調(diào)，在4 mmol·L時(shí)均達(dá)到極顯著(<0.01)；mRNA表達(dá)量則在2 mmol·L組呈顯著上調(diào)(<0.05)，1、4 mmol·L組mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 不同濃度BHBA誘導(dǎo)牛肺泡巨噬細(xì)胞12 h對(duì)GPR109A、p38MAPK、NF-κB、PPARγ基因表達(dá)的影響

2.3 BHBA對(duì)BAMs 釋放IL-1β，IL-6，TNF-α促炎細(xì)胞因子的影響

采用ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量。結(jié)果顯示，4 mmol·L的BHBA處理BAMs 0、3、6、12、24 h后，與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α促炎細(xì)胞因子表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且均在6 h極顯著上調(diào)(<0.01)(圖4-A、B、C)。

不同濃度的BHBA作用于BAMs 12 h后，與對(duì)照組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α促炎細(xì)胞因子表達(dá)量隨BHBA濃度的增加而增加，且與對(duì)照組相比，1、2、4 mmol·L組的IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均極顯著上調(diào)(<0.01)(圖4-D、E、F)。

圖4 BHBA誘導(dǎo)時(shí)間和濃度對(duì)牛肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)影響

3 討論

BHBA是脂肪酸在肝線粒體基質(zhì)中氧化產(chǎn)生的一種代謝中間產(chǎn)物，長(zhǎng)期饑餓、糖尿病、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)等情況會(huì)升高機(jī)體BHBA水平。但當(dāng)血液循環(huán)中BHBA濃度的過(guò)度升高往往會(huì)通過(guò)激活氧化應(yīng)激等途徑觸發(fā)促炎反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞炎性損傷從而導(dǎo)致糖尿病酮癥酸中毒等各種病理并發(fā)癥的發(fā)生。還有研究報(bào)道，BHBA能增加牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞、犢牛肝細(xì)胞、奶牛中性粒細(xì)胞中IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎細(xì)胞因子的釋放，參與其炎性損傷過(guò)程。本次試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，即BHBA也能促進(jìn)BAMs促炎細(xì)胞因子的釋放，且呈時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)增加。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)1、2、4 mmol·LBHBA不影響B(tài)AMs存活率，但隨著BHBA濃度的增加細(xì)胞存活率隨之降低。

G蛋白偶聯(lián)受體109A(GPR109A)，能在巨噬細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，BHBA是其內(nèi)源性配體，能通過(guò)激活該受體進(jìn)而抑制脂肪分解，以及釋放游離脂肪酸和促炎或抗炎細(xì)胞因子來(lái)作出響應(yīng)。脂多糖、TNF-α等多種炎性刺激物都能激活巨噬細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)使GPR109A表達(dá)上調(diào)。NF-κB通路在免疫和炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，NF-κB與BHBA密切相關(guān)，是BHBA發(fā)揮炎癥效應(yīng)的關(guān)鍵分子。Shi等發(fā)現(xiàn)，BHBA會(huì)增加牛肝細(xì)胞中IκBa磷酸化水平，TNF-α、IL-6和IL-1β等濃度也顯著增加。在本次試驗(yàn)中，4 mmol·LBHBA作用于BAMs，109、-mRNA表達(dá)量上調(diào)，且此過(guò)程中IL-1β、IL-6、TNF-α促炎細(xì)胞因子的釋放量也呈時(shí)間依賴效應(yīng)增加。表明BHBA促進(jìn)BAMs釋放IL-1β、IL-6、TNF-α，可能與GPR109A/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

此外，p38MAPK被認(rèn)為是NF-κB的上游調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。在本次試驗(yàn)中，38mRNA表達(dá)量隨濃度和時(shí)間的增加而增加。PPARγ是屬于配體激活的核受體家族的轉(zhuǎn)錄因子，除了具有調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用以外，其抑炎機(jī)制也被廣泛研究。在本次試驗(yàn)中，mRNA表達(dá)量在3、6 h極顯著上調(diào)(<0.01)，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，mRNA表達(dá)量在12、24 h下調(diào)，而-mRNA表達(dá)量、IL-1β、IL-6和TNF-α在6 h均極顯著上調(diào)(<0.01)，這提示BHBA激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放可能與mRNA表達(dá)量降低有關(guān)，進(jìn)而降低PPARγ的抑炎作用，但其具體機(jī)制尚不明確有待深入探討。明確BHBA誘導(dǎo)BAMs炎癥反應(yīng)的具體分子機(jī)制，有利于為牛肺部炎癥疾病的預(yù)防和治療提供新思路。