賈利強(qiáng)，趙秋芳，陳 曙，丁 波，*

(1.貴州師范學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550018；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091)

堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)蛋白家族是眾多轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的家族之一，廣泛分布于真核生物中。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族都含有典型的bZIP結(jié)構(gòu)域，由60～80個氨基酸殘基組成，一般包含N端和C端2部分。N端為含有N-x7-R/K蛋白基序高度保守的堿性區(qū)域，功能為識別和結(jié)合下游基因啟動子區(qū)域的DNA序列。C端為2個或2個以上的a-螺旋組成的亮氨酸拉鏈區(qū)域，該區(qū)域一般有7個氨基酸殘基組成，第7位為亮氨酸(或者被異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸替代)，可形成二聚體結(jié)構(gòu)調(diào)控bZIP蛋白與下游基因DNA的結(jié)合。隨著植物基因組計劃的實施，越來越多的植物基因組序列得以報道，植物眾多轉(zhuǎn)錄因子家族的研究也開始加速。自2002年Jakoby報道第1個擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族以來，相繼在水稻、大豆、玉米、蓖麻、黃瓜、葡萄、蘋果、番茄、薺麥、辣椒等植物中發(fā)現(xiàn)了bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，植物的bZIP蛋白可以進(jìn)一步劃分為多個亞家族。擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子可以劃分為10個亞家族，水稻和玉米bZIP家族分別有11個亞家族。眾多研究表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生長發(fā)育與逆境脅迫進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族影響植物生長發(fā)育進(jìn)程，如細(xì)胞伸長、組織器官發(fā)育、胚形態(tài)建成和花器官發(fā)育、種子成熟。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物應(yīng)答逆境脅迫信號途徑的中樞位置已在許多研究中體現(xiàn)。它們通過調(diào)控下游基因網(wǎng)絡(luò)途徑，影響植物各種生理生化代謝過程，抵御不利的環(huán)境因子，如干旱和鹽脅迫、高滲脅迫和低溫脅迫。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族還參與調(diào)控激素和糖信號通路、碳氮代謝平衡、病原菌響應(yīng)和光信號通路。各類植物bZIP家族基因的組織與應(yīng)答逆境脅迫表達(dá)模式研究報道日益增多，這些也加快了植物bZIP家族基因功能研究進(jìn)程。

玉米作為世界和我國重要的糧經(jīng)飼三位一體的大宗作物，在世界糧食和飼料安全方面發(fā)揮著重要作用。玉米生長中經(jīng)常遭受各類逆境脅迫因子的影響，造成玉米產(chǎn)量減產(chǎn)，導(dǎo)致種植者經(jīng)濟(jì)收入遭受損失。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育與抗逆性等方面發(fā)揮多種作用，其中bZIP家族基因報道的相對較多。玉米自交系鄭58是我國重要的骨干自交系，其bZIP家族基因應(yīng)答逆境脅迫的表達(dá)模式還未見報道。本研究選取bZIP家族G類亞家族的20個基因成員，通過人為模擬高鹽、干旱、低溫和氮缺乏等非生物逆境脅迫條件，系統(tǒng)地研究了bZIP G亞家族成員的表達(dá)模式，可為進(jìn)一步深入研究這些基因的生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以玉米自交系鄭58為試驗材料。在授粉揚花期上午10：00左右，采集成熟根系、莖、第12片葉、雄花和授粉15 d的嫩穗，快速液氮處理，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

75個擬南芥和20個玉米基因及其蛋白序列來自于Phytozome v9.1數(shù)據(jù)庫(http://www.phytozome.net/)、MaizeGDB(Maize Genetics and Genomics Database)數(shù)據(jù)庫(http://www.maizedb.org/)和TAIR(https://www.arabidopsis.org/)。依據(jù)基因的物理距離，利用Mapinspect軟件進(jìn)行染色體定位分析。依據(jù)的CDS和基因組序列，利用在線軟件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)進(jìn)行序列比對，確定的基因結(jié)構(gòu)。75個AtbZIP和20個ZmbZIP蛋白序列組成的共計95個蛋白數(shù)據(jù)矩陣，利用在線軟件MAFFT的L-ISN-i方法進(jìn)行序列比對分析，去除非保守蛋白區(qū)域，保守的bZIP蛋白序列導(dǎo)入MEGA X軟件，利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，參數(shù)設(shè)置為-distance，bootstrap值設(shè)為1 000，其他為默認(rèn)值。

1.2.2 逆境脅迫處理

玉米自交系鄭58種子經(jīng)5%次氯酸鈉溶液表面消毒后，28 ℃黑暗催芽，挑選出芽一致的健康種子放于網(wǎng)紗上，用Holland營養(yǎng)液培養(yǎng)。營養(yǎng)液配方為：2 mmol·LNHNO，0.17 mmol·LKHPO·12HO，0.27 mmol·LKSO，0.47 mmol·LCaCl·2HO，0.37 mmol·LMgSO·7HO，45 μmol·LFe·EDTA，0.16 μmol·LCuSO·5HO，0.15 μmol·LZnSO·7HO，0.10 μmol·LNaMoO·2HO，15 μmol·LHBO，4.6 μmol·LMnSO·5HO，1 μmol·LNiSO，用HCl調(diào)節(jié)pH值為5.7～5.8。生長條件設(shè)置為長日照(16 h光照，28 ℃；8 h黑暗，25 ℃)。待玉米幼苗生長至三葉期時進(jìn)行脅迫實驗。

干旱或鹽脅迫處理：取生長一致的玉米幼苗轉(zhuǎn)移至含有20% PEG6000或200 mmol·LNaCl的營養(yǎng)液中培養(yǎng)；低溫處理：將生長一致的健康玉米幼苗置于4 ℃培養(yǎng)。這3種脅迫處理分別在0、1、6、24 h取葉片。銨態(tài)氮或硝態(tài)氮脅迫處理：取生長一致的玉米幼苗轉(zhuǎn)移至硝態(tài)氮或氨態(tài)氮缺乏的Holland營養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別在0、1、6、24 h取葉片和根系。樣品迅速液氮速凍處理，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

取0.1 g玉米葉片或根系液氮快速研磨，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，檢測其濃度和純度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成cDNA的合成和純化。依據(jù)目的基因保守性，利用Oligo 7設(shè)計特異性引物，引物信息見表1。以不同脅迫處理的cDNA為模板，以玉米基因為內(nèi)參，利用Roche Light Cycler 480 System(Roche，Basel，Switzerland)進(jìn)行定量分析。熒光染料為SYBR Premix EX Taqkit。擴(kuò)增程序為95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，45個循環(huán)。采用2法計算基因的相對表達(dá)量，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

表1 ZmbZIP基因的實時熒光定量引物

2 結(jié)果與分析

2.1 bZIP亞家族生物信息學(xué)分析

為了探測玉米bZIP家族基因的基本表達(dá)信息，根據(jù)前人的研究結(jié)果，選擇玉米bZIP家族中G亞家族基因共計20個作為研究對象，20個基因的基本信息見表2。20個基因分布于8個染色體上，其中，Chr3和Chr10上各有4個基因，Chr1、Chr2、Chr4、Chr6和Chr9上各有2個基因，Chr5和Chr7上各有1個基因(圖1-A)。20個基因內(nèi)含子數(shù)目變異較大，67和97沒有內(nèi)含子，50有14個內(nèi)含子(圖1-B)。20個ZmbZIP蛋白N端含有典型的bZIP結(jié)構(gòu)域，包括保守的堿性蛋白序列和亮氨酸拉鏈蛋白序列(圖2-A)。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，20個ZmbZIP蛋白和6個擬南芥AtbZIP蛋白聚合在一起，形成一個家族，推測這些蛋白起源于一個共同的祖先；同時，玉米的基因發(fā)生了明顯的基因復(fù)制，基因數(shù)量比擬南芥中的同源基因多(圖2-B)。

A，ZmbZIP基因的染色體定位；B，ZmbZIP的基因結(jié)構(gòu)。

A，ZmbZIP蛋白保守結(jié)構(gòu)域多重序列比對；B，ZmbZIP蛋白的進(jìn)化樹。

表2 玉米bZIP家族基因基本信息

2.2 ZmbZIP在玉米組織中的表達(dá)模式

為了研究基因在玉米不同組織部位的表達(dá)模式，利用qRT-PCR技術(shù)，分析了這些基因在玉米根系、莖、葉、雄花和嫩穗中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，15個基因在5個組織中的表達(dá)模式不同(圖3)。5個基因(26、40、73、100和140)主要在根系中表達(dá)，其表達(dá)量是其他組織器官的2倍以上。50和142主要在嫩穗中表達(dá)，分別比其他部位高70倍和3倍以上，表明這2個基因可能在玉米穗的形成過程中發(fā)揮重要作用。2主要在雄花中表達(dá)，是其他部位的2倍以上；20呈現(xiàn)組成型表達(dá)模式，在探測的5個組織器官中都有較高的表達(dá)水平。6個基因(39、51、67、96、97和138)主要在2個或2個以上的組織器官中表達(dá)，預(yù)示這些基因功能具有多樣性。

R、S、L、T、E分別代表根、莖、葉、雄花和幼穗。柱上無相同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3 ZmbZIPs應(yīng)答鹽、干旱和低溫脅迫的表達(dá)模式

由圖4可知，玉米葉片中不同基因在3種逆境脅迫下呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。51在NaCl、PEG6000和低溫脅迫處理6 h表達(dá)量達(dá)到了最高值，分別比處理前上升了4.8倍、10.3倍和5.0倍，推測該基因參與這3種逆境脅迫響應(yīng)途徑。20、96和142只受NaCl脅迫和PEG脅迫的誘導(dǎo)，并且在脅迫處理24 h時，達(dá)到最高值，低溫脅迫卻抑制這3個基因的表達(dá)。NaCl和PEG6000脅迫24 h，20表達(dá)量分別是0 h的4.3倍和4.9倍；低溫脅迫24 h，該基因表達(dá)量下調(diào)了68%，這些數(shù)據(jù)表明這3個基因在應(yīng)對NaCl、PEG6000和低溫脅迫時具有不同的反應(yīng)機(jī)制。NaCl脅迫誘導(dǎo)39表達(dá)，低溫脅迫抑制其表達(dá)，分別是0 h的2.4倍和51%。7個(2、26、40、67、73、100、138)在應(yīng)對3種逆境脅迫時表達(dá)量變化不超過2倍，這些基因在玉米抵御逆境脅迫時的作用還有待深入研究。

圖4 不同逆境脅迫下葉片中ZmbZIP基因的相對表達(dá)量

2.4 ZmbZIP應(yīng)答氨態(tài)氮和硝態(tài)氮脅迫的表達(dá)模式

由圖5可知，在不同氮形態(tài)缺乏脅迫下，玉米葉片中基因的表達(dá)模式不同。脅迫處理24 h，20、26、73、97和100的表達(dá)同時受2種不同氮缺乏脅迫的抑制，表明這5個基因在調(diào)控不同氮形態(tài)缺乏脅迫中發(fā)揮著類似的作用。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫處理24 h，20表達(dá)量比處理前分別下降了82%和48%。39、40和138在2種脅迫處理下，表達(dá)量先上升再下降。40在銨態(tài)氮缺乏脅迫1 h時，其表達(dá)量是0 h的48倍，之后出現(xiàn)回落，脅迫24 h時，其表達(dá)量相比處理前下降了54%，表明這些基因是應(yīng)答氮脅迫的早期響應(yīng)基因，在氮脅迫的早期發(fā)揮作用。50、51、67、96和142的表達(dá)在應(yīng)答硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫時的表達(dá)模式不同。如96受銨態(tài)氮缺乏脅迫的持續(xù)強(qiáng)烈誘導(dǎo)，并在脅迫處理24 h達(dá)到最高值；在硝態(tài)氮缺乏脅迫下，該基因先受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其表達(dá)量比處理前上升了230倍，之后出現(xiàn)明顯回落，表明該基因是硝態(tài)氮缺乏脅迫的早期響應(yīng)基因，在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫中都發(fā)揮著獨特的作用。

圖5 氮缺乏脅迫下玉米葉片中ZmbZIPs的相對表達(dá)量

由圖6可知，玉米根中14個基因的表達(dá)受不同氮形態(tài)缺乏脅迫的調(diào)控。在脅迫處理24 h，2、26、40、51、73、97、100、138和142的表達(dá)同時受硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫的抑制，表明這些基因在這2種脅迫響應(yīng)途徑中可能具有類似的功能。比如151在硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫24 h時，其表達(dá)量相比處理前分別下降了90%和99%。50則同時受2種脅迫處理的誘導(dǎo)，實驗結(jié)束時，其表達(dá)量分別是處理前的12.8倍和4.1倍。67在脅迫早期同時受2種脅迫處理的誘導(dǎo)，之后出現(xiàn)回落，表明這2個基因在2種脅迫響應(yīng)途徑中也具有類似的作用。在硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫下，96的表達(dá)模式不同，硝態(tài)氮缺乏脅迫下，該基因受到持續(xù)的誘導(dǎo)，在實驗結(jié)束時，其表達(dá)量是處理前的28倍；而銨態(tài)氮缺乏脅迫則先誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，在脅迫處理1 h時，其表達(dá)量上升了10倍以上，之后回落到處理前的水平，表明該基因是銨態(tài)氮缺乏脅迫早期響應(yīng)基因，該基因在2種不同的氮形態(tài)缺乏脅迫響應(yīng)途徑中具有不同的功能。

圖6 氮缺乏脅迫下玉米根系中ZmbZIPs的相對表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

植物bZIP成員眾多，生物學(xué)功能多樣，一般情況下，根據(jù)植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點和功能劃分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S共10個亞家族。玉米bZIP家族G亞家族可以進(jìn)一步分化為3個亞組，這與前人的研究結(jié)果基本一致，表明了這20個基因在玉米進(jìn)化過程中，基因序列發(fā)生了明顯的分化，這也體現(xiàn)在這些基因在組織表達(dá)模式或逆境響應(yīng)表達(dá)模式上有明顯差異。例如39、51、142、50和96的序列進(jìn)化關(guān)系比較近，組成一個亞組，但這5個基因的組織表達(dá)模式發(fā)生明顯分化，其中，39、51和142的組織表達(dá)模式類似，在幼穗中的表達(dá)量最高，其次是根系，體現(xiàn)了基因進(jìn)化進(jìn)程中的保守性，50則呈現(xiàn)為幼穗特異性表達(dá)模式，96在根系中表達(dá)量最高，出現(xiàn)了基因表達(dá)的分化；這5個基因都顯著受高鹽脅迫誘導(dǎo)，而在PEG6000和低溫脅迫下，表達(dá)模式發(fā)生了變化，142、96和51都受干旱脅迫的誘導(dǎo)，39的表達(dá)變化不明顯；39、96和142都受低溫脅迫的抑制，而51在低溫脅迫下則明顯受到誘導(dǎo)。其他亞組的基因應(yīng)答不同逆境脅迫時也表現(xiàn)出這一特點，這種表達(dá)模式體現(xiàn)了基因進(jìn)化過程中的保守性和分化性。

bZIP家族成員在不同植物中的組織表達(dá)模式差異非常大，顯示了其進(jìn)化過程中的功能分化。7個馬鈴薯基因呈現(xiàn)組成型表達(dá)模式，其中，同屬G亞家族的16和55在根系中表達(dá)量比較高，而辣椒G亞家族基因在根系中表達(dá)量普遍不高。本研究中，大部分G亞家族成員在根系中表達(dá)量比較高，可能和G亞家族基因參與脫落酸(abscisic acid，ABA)響應(yīng)途徑有關(guān)，41、54和55顯著受干旱脅迫誘導(dǎo)，而受鹽脅迫誘導(dǎo)不顯著；本研究中鹽脅迫對基因表達(dá)的影響大于干旱脅迫，反映了不同植物功能的進(jìn)化差異。玉米51基因參與調(diào)控ABA信號途徑，在胚胎發(fā)育進(jìn)程中表達(dá)量比較高；本研究中，該基因在幼穗中的表達(dá)量比較高，并且受干旱、高鹽和低溫脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，與前人的研究結(jié)果基本一致，顯示了該基因功能在不同種質(zhì)中的保守性。玉米自交系Yu882中，20、39和96明顯受到高鹽脅迫的誘導(dǎo)，本研究結(jié)果與此一致，體現(xiàn)了基因功能的保守性。本研究中，26、67、73和100在逆境脅迫下表達(dá)量變化不顯著，說明這些基因在不同玉米種質(zhì)中功能的分化，這在其他研究中也有報道。

植物根系主要依靠硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運體或銨態(tài)氮轉(zhuǎn)移體從土壤中吸收養(yǎng)分，這一過程受一系列精密的分子生理調(diào)控，其中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著多樣而又重要的作用。本研究中，玉米根系或葉片的bZIP家族基因廣泛受到硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫的調(diào)控，同時還存在組織器官表達(dá)差異。在硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫下，根系或葉片中97同時受2種脅迫處理的抑制，而其他基因的表達(dá)模式在葉片或根系中存在明顯差異，預(yù)示在調(diào)控氮代謝平衡體系中不同器官的基因存在生物學(xué)功能差異。