趙肖儀，張艷巧，尹可函，趙 楠，夏 迪，樊 星，張亞莉*

(南通大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，南通 226001)

隨著全球氣候變化和人類活動的增加，飲用水體中藍藻水華污染在全世界范圍內(nèi)逐年增長，微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)是藍藻細胞產(chǎn)生的分布最為廣泛、毒性最強的細胞內(nèi)毒素，被國際癌癥研究機構(gòu)定義為2B 類致癌物[1-2]。由于肝細胞高表達介導(dǎo)MC-LR 吸收所必須的有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(organic anion transporting polypeptides,OATP)OATP1B1 和OATP1B3，因此肝臟被認為是最易受MC-LR 攻擊的器官[3]。MC-LR 暴露能夠?qū)е赂沃|(zhì)代謝紊亂[4]、非酒精性脂肪性肝炎[5]和肝癌[6]發(fā)生。流行病學調(diào)查[7]顯示，人血清MC-LR 的濃度和肝癌的發(fā)生明顯相關(guān)。此外，MC-LR 的暴露能夠增強乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和黃曲霉素B1(aflatoxin B1,AFB1)結(jié)合誘導(dǎo)的肝損傷程度，MC-LR和HBV、AFBs 一起被認為是引起肝臟損傷的三大危險因素[8]。因此，研究MC-LR 肝毒性機制對人類健康至關(guān)重要。

炎癥小體是一類位于胞內(nèi)的多蛋白復(fù)合體，參與人體的炎癥和免疫反應(yīng)，其中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)是目前研究最為充分的炎癥小體。NLRP3 炎癥小體被活化后，引起pro-Caspase-1 自剪切，形成有活性的Caspase-1，活化的Caspase-1 不僅將白細胞介素(interleukin,IL)-1β 和IL-18 前體轉(zhuǎn)化為有活性的IL-1β 和IL-18，發(fā)揮其生物學作用，還在細胞膜上形成孔道，釋放細胞內(nèi)容物，造成炎癥型細胞死亡，即焦亡[9-10]。越來越多研究[11-14]顯示NLRP3 炎癥小體的活化在外源物導(dǎo)致的肝損傷、非酒精性或酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化中起重要作用。然而，以往研究[15-16]大多將MC-LR 誘導(dǎo)細胞損傷的方式歸因于凋亡，NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的焦亡是否參與MC-LR 誘導(dǎo)的肝毒性很少被關(guān)注。

本課題組前期研究[17]表明，NLRP3 炎癥小體活化在MC-LR 誘導(dǎo)的小鼠肝組織炎性損傷中起重要作用。本研究在此基礎(chǔ)上，從小鼠肝組織分離原代肝實質(zhì)細胞和肝臟固有巨噬細胞——Kupffer 細胞，從NLRP3 炎癥小體活化視角分析比較MC-LR 對這兩種細胞的毒性作用，明確MC-LR 誘導(dǎo)肝組織NLRP3炎癥小體活化發(fā)生的細胞類型，旨在為MC-LR 肝毒性的機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源1.1.1 實驗動物 15 只4 周齡雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量約20 g，飼養(yǎng)于南通大學實驗動物中心無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級動物房內(nèi)。動物房室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲食，晝夜各半循環(huán)照明。動物實驗通過南通大學動物倫理委員會審查(2012-0031)。

1.1.2 主要試劑 MC-LR(ENZO,ALX-350-012)，Ⅳ型膠原酶(Sigma,C5138)，Anti-NLRP3 抗體(Abcam,AB263899)，Anti-pro-Caspase1+p10+p12 抗體(Abcam,AB179515)，Anti-IL-1β(Proteintech,16806-1-AP)，Anti-Albumin 抗體(Abcam,AB207327)，Anti-F4/80 抗體(Cell signal,#30325)，F(xiàn)AM-FLICA Caspase Assay Kits(Immuno Chemistry Technologies)；DMEM/F12(Gibco,A4192001)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞的分離和培養(yǎng) 參照文獻[18]從同一只小鼠肝臟分離肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞。將4 周齡雄性C57BL/6J 小鼠麻醉，開腹暴露下腔靜脈和門靜脈，注射針刺入下腔靜脈，固定。以0.38 mL/min 的速度推注Hanks′平衡鹽溶液(Hanks′ balanced sodium solution-EGTA,HBSSEGTA)，待肝臟腫脹并變色，調(diào)節(jié)速度為1.7 mL/min，剪斷門靜脈，持續(xù)推注15～20 mL HBSS-EGTA，使肝臟保持膨大狀態(tài)，整個肝臟顏色快速變成奶油色。之后，換膠原酶繼續(xù)灌注(速度同上)。灌注完成后，游離肝臟，將肝臟轉(zhuǎn)移至盛有冰冷的15 mL HBSS-CaCl2溶液的培養(yǎng)皿中，移走膽囊，輕柔切肝葉，釋放肝細胞，用30 mL 冰冷的HBSS-CaCl2，100 μm 的細胞濾網(wǎng)過濾細胞至50 mL 離心管，50 g，5 min，4 ℃離心，肝實質(zhì)細胞在沉淀，Kupffer 細胞在上清。將含有Kupffer 細胞的上清輕柔轉(zhuǎn)入提前準備好的Percoll gradient。30 mL HBSS-CaCl2溶液重懸肝實質(zhì)細胞沉淀，50 g，3 min，4 ℃離心(重復(fù)3 次)，棄上清，用含15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)3～4 h 貼壁后，換10% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)(此為肝實質(zhì)細胞)。將轉(zhuǎn)至Percoll gradient 的Kupffer 細胞200 g，30 min，4 ℃離心，小心收集中間層，將其轉(zhuǎn)移至新的50 mL 離心管，加磷酸鹽緩沖液(phosphase buffered saline,PBS)到20 mL，離心，將沉淀用培養(yǎng)基RPMI 重懸，靜置30 min，用PBS 洗滌去除未貼壁的細胞，并加入新的培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱培養(yǎng)(此為肝Kupffer 細胞)。

1.2.2 Western Blot 檢測NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白表達 提取肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞蛋白后，采用BCA 蛋白定量法進行定量檢測。取50 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳，移至PVDF 膜，相關(guān)一抗4 °C 孵育過夜，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標志的二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，使用分子成像儀進行曝光顯影，拍照。

1.2.3 免疫熒光檢測NLRP3 在肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞的定位 分別將肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞接種于24 孔板內(nèi)(事先放入鼠尾膠原包被的玻片)，培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的MC-LR 染毒處理，之后吸棄培養(yǎng)基，PBS 洗2 次，4%多聚甲醛固定，室溫15 min。加入10%FBS/PBS，室溫封閉20 min。稀釋一抗于0.2% Triton X-100/10%FBS/PBS，4 ℃孵育過夜。10%FBS/PBS 洗3 次，二抗室溫孵育1 h，加DAPI 染細胞核，激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.4 焦亡率檢測 將接種于6 孔板的Kupffer 細胞用不同濃度MC-LR 處理24 h 后，胰酶消化收集細胞，PBS 洗滌，分別用1×FAM-FLICA(一種標志活化的Caspase-1 的熒光染色劑)和碘化丙啶(propid ium iodide,PI)(作為細胞膜孔道形成的標志)染色細胞，流式細胞儀檢測，分析細胞焦亡的情況。

2 結(jié)果

2.1 肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞的鑒定 肝實質(zhì)細胞提取4 h 后，貼壁生長，部分呈現(xiàn)雙核，表明細胞狀態(tài)良好；Kupffer 細胞提取48 h 后，細胞伸出偽足，呈梭形。為進一步明確細胞類型，用肝實質(zhì)細胞的標志蛋白Albumin 或Kupffer 細胞的標志蛋白F4/80分別對兩種細胞進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示：肝實質(zhì)細胞全部被其標志蛋白Albumin 染色，表明提取純度高；Kupffer 細胞被其標志蛋白F4/80 染色，純度尚可(圖1A)。此外，經(jīng)Western Blot 鑒定Albumin 僅標志肝實質(zhì)細胞而非Kupffer 細胞，而F4/80 正好相反(圖1B)，表明Albumin 和F4/80 對肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞的鑒定具有特異性。

圖1 小鼠肝臟提取肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞的鑒定

2.2 MC-LR 對肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞中NLRP3 炎癥小體活性的影響 由于MC-LR 可以通過共價結(jié)合蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的催化C 亞基從而在細胞中進行生物積累，因此本實驗用抗MC-LR 抗體檢測MC-LR(1 ku)和PP2Ac(36 ku)形成的復(fù)合物(約37 ku)來鑒定MC-LR是否進入細胞。如圖2A 所示，在10 nmol/L 組就可發(fā)現(xiàn)MC-LR 在肝實質(zhì)細胞中聚集，并隨濃度增加MC-LR 的聚集量增加。NLRP3 炎癥小體活化后可剪切pro-Caspase-1 形成有活性的Caspase-1(p10)，活化的Caspase-1 切割pro-IL-1β 為有活性的IL-1β(p17)。因此，通常用裂解的Caspase-1(p10)和IL-1β(p17)的表達來檢測NLRP3 炎癥小體的活性。在30、50 nmol/L MC-LR 處理3 h 后，肝實質(zhì)細胞中NLRP3及裂解的Caspase-1(p10)表達明顯增加，在50 nmol/L處理組出現(xiàn)IL-1β(p17)，同時pro-Caspase1 和pro-IL-1β 表達減少(圖2A～B)。同樣，本研究也檢測了MC-LR 在Kupffer 細胞中的聚集以及MC-LR 對Kupffer 細胞中NLRP3 表達和活性的影響。結(jié)果表明，MC-LR 可以進入Kupffer 細胞，但是相比肝實質(zhì)細胞，Kupffer 細胞對MC-LR 的敏感度下降，直到10 μmol/L MC-LR 處理24 h 方可檢測到代表NLRP3 炎癥小體活化的Caspase-1(p10)和IL-1β(p17)表達增加(圖2C～D)。

圖2 MC-LR 對肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞中NLRP3 炎癥小體活性相關(guān)蛋白的影響

2.3 NLRP3 在肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞中的定位表達 用免疫熒光雙標法檢測NLRP3 分別與肝實質(zhì)細胞標志蛋白Albumin、Kupffer 細胞標志蛋白F4/80 的共定位，結(jié)果顯示，在30、50 nmol/L MC-LR 處理組，NLRP3(綠色)的熒光強度依次增強，且和Albumin(紅色)的熒光融合(黃色)，表明經(jīng)MC-LR 處理后NLRP3 在肝實質(zhì)細胞中表達升高(圖3A，見封二)。同樣，NLRP3 和F4/80 共定位檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MC-LR處理后，相比對照組，NLRP3(綠色)的熒光強度增高，更重要的是NLRP3 主要表達于F4/80 標志(紅色)的Kupffer 細胞(黃色)，而在未被F4/80 標志的細胞中表達較弱(圖3B，見封二)。

圖3 NLRP3 在肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞中的定位研究

2.4 MC-LR 誘導(dǎo)Kupffer 細胞焦亡率升高 流式細胞術(shù)檢測細胞焦亡率(FAM-FLICA 和PI 雙陽性表示焦亡細胞)，結(jié)果顯示：在5 μmol/L 和10 μmol/L MC-LR 處理組，Kupffer 細胞的焦亡率相比對照組(15.6%)明顯增加，分別為33.9%和49.5%，同時用NLRP3 激活劑nigericin 作為焦亡率檢測的陽性對照(圖4A～B)。

圖4 MC-LR 誘導(dǎo)Kupffer 細胞焦亡率升高

3 討論

本課題組前期研究[17]發(fā)現(xiàn)：以灌胃的方式將MCLR 暴露于小鼠后，MC-LR 主要在肝組織聚集并誘導(dǎo)肝組織發(fā)生NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的炎性損傷。NLRP3 炎癥小體在巨噬細胞高表達，以往大多數(shù)研究[19-22]將NLRP3 炎癥小體的功能分析聚焦于巨噬細胞；而肝實質(zhì)細胞占肝細胞群體的60%～80%并且高表達MC-LR 吸收所必須的有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，從小鼠肝臟分離肝實質(zhì)細胞和肝固有巨噬細胞，即Kupffer 細胞，檢測MC-LR 處理后NLRP3 以及NLRP3 炎癥小體活性相關(guān)蛋白的表達，意欲明確MC-LR 誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體活化發(fā)生的肝組織細胞類型。結(jié)果表明，MC-LR 可進入肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞，并誘導(dǎo)肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞發(fā)生NLRP3 炎癥小體活化。然而，不論從MC-LR 處理的濃度和還是從作用的時間分析，肝實質(zhì)細胞對MC-LR 的吸收和敏感程度均明顯高于Kupffer 細胞。因此，對于MC-LR而言，肝實質(zhì)細胞可能是NLRP3 炎癥小體活化發(fā)生的主體細胞。后續(xù)研究將從MC-LR 染毒小鼠中分離肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞，進一步明確MC-LR誘導(dǎo)肝損傷中NLRP3 炎癥小體活化的細胞類型。

本課題前期研究[17]在MC-LR 誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體活化的小鼠肝組織中發(fā)現(xiàn)，具有活性的炎癥因子IL-1β(P17)顯著增高。眾所周知，IL-1β 主要由Kupffer 細胞分泌，提示Kupffer 細胞的活化參與了MC-LR 誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體肝損傷。本研究從小鼠肝組織中分離肝Kupffer 細胞，雖然經(jīng)過鑒定采用本方法提取的肝Kupffer 細胞中含有其他的非實質(zhì)細胞，但是經(jīng)免疫熒光雙標法檢測發(fā)現(xiàn)，MC-LR 誘導(dǎo)后NLRP3 主要在肝Kupffer 細胞中表達增高；相反，其他未被肝Kupffer 細胞標志蛋白F4/80 染色的細胞NLRP3 表達較低。這一結(jié)果提示，MC-LR 誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體的活化發(fā)生在肝Kupffer 細胞而非其他肝臟非實質(zhì)細胞。與其他程序性死亡方式不同，焦亡主要是由炎癥小體蛋白復(fù)合物活化Caspase-1介導(dǎo)的促炎性細胞死亡。本研究在發(fā)現(xiàn)MC-LR 誘導(dǎo)肝Kupffer 細胞發(fā)生NLRP3 炎癥體活化裂解Caspase-1 的基礎(chǔ)上，進一步證實MC-LR 可誘導(dǎo)該細胞焦亡。上述結(jié)果表明NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)肝Kupffer 細胞焦亡參與了MC-LR 誘導(dǎo)的肝臟炎性損傷。

綜上所述，肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞是MC-LR誘導(dǎo)肝組織NLRP3 炎癥小體活化依賴性肝損傷的主要細胞類型。鑒于肝實質(zhì)細胞對MC-LR 的敏感性推測機制為：MC-LR 經(jīng)灌胃的方式染毒小鼠，首先誘導(dǎo)肝實質(zhì)細胞發(fā)生NLRP3 炎癥小體活化，繼而通過釋放少量炎癥因子IL-1β 激活Kupffer 細胞，活化的Kupffer 細胞釋放大量的IL-1β，進一步加重MC-LR 誘導(dǎo)肝實質(zhì)細胞的損傷，即肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞通過IL-1β 介導(dǎo)的“crosstalk”效應(yīng)，將MC-LR 誘導(dǎo)肝臟炎性損傷效應(yīng)放大。在后續(xù)實驗將從正常小鼠和MC-LR 損傷模型鼠分別提取肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞，通過建立co-culture 模型，研究肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞之間的“crosstalk”效應(yīng)以及IL-1β 對該效應(yīng)的介導(dǎo)作用。