陳 玥，陳 思，王 靜，羅 梅，鐘偉萍，葉宇齊，曾 錚，荀愛(ài)華***

(1 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科，南京 210028；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院)

宮頸癌是目前全球女性因癌癥死亡的第四大原因，也是20～39 歲女性因癌癥死亡的第二大原因，每年死亡人數(shù)超過(guò)300 萬(wàn)[1]。隨著人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)分型檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床及疫苗接種率的提高，本病的發(fā)病率已經(jīng)逐漸下降[2]。世界上許多國(guó)家針對(duì)本病已經(jīng)制定了不同策略的篩查計(jì)劃，大多數(shù)以宮頸細(xì)胞學(xué)的結(jié)果為依據(jù)。然而現(xiàn)有證據(jù)[3]顯示：30%的宮頸癌患者可能至少有一次細(xì)胞學(xué)的假陰性結(jié)果，因此，臨床醫(yī)師需要更加精確的手段以提高疾病篩查率。

基于持續(xù)性HPV 感染在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的重要性，HPV 和細(xì)胞學(xué)的聯(lián)合雙篩作為疾病的初步篩查方法亦普及于臨床。但由于女性一過(guò)性HPV 感染的高發(fā)病率，造成HPV 分型對(duì)于區(qū)別診斷低級(jí)別和高級(jí)別宮頸病變的特異性不強(qiáng)，尤其是在年輕女性中更為多見(jiàn)[4]。臨床醫(yī)師需要一種更好的指標(biāo)，而免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)是評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度的敏感方法，且特異性更顯著[5]。針對(duì)HPV感染導(dǎo)致的相關(guān)損傷，最常用的IHC 標(biāo)記是p16[6]。P16 由CDKN2A 基因編碼，是一種腫瘤抑制基因，可直接抑制細(xì)胞增殖[7]。而在HPV 相關(guān)的惡性腫瘤中，p16 過(guò)表達(dá)導(dǎo)致不能有效抑制被HPV 感染的細(xì)胞增殖，其高表達(dá)已被認(rèn)為是診斷HPV 所致宮頸癌的生物標(biāo)志物。盡管已有研究分析了p16 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展及診斷中的作用，但關(guān)于其突變情況、相關(guān)生物學(xué)功能及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)腫瘤的影響仍知之甚少，吸引了學(xué)者們的關(guān)注。

1 資料與方法

1.1 GEPIA 2 GEPIA 2(Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2,http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)數(shù)據(jù)庫(kù)是基于癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因型-組織表達(dá)(Genotype-Tissue Expression,GTEx)數(shù)據(jù)庫(kù)建立的癌癥大數(shù)據(jù)可視化分析平臺(tái)，它將基因表達(dá)定量從基因水平擴(kuò)展到轉(zhuǎn)錄水平，并支持特定癌癥亞型的分析和亞型間的比較[8]。“Single Gene Analysis”模塊下輸入“CDKN2A”，獲取p16 在泛癌組織與正常組織中的表達(dá)差異?！癊xpression DIY”模塊下分別選擇“BoxPlot”、“Stage Plot”，“Cancer name”選擇“CESC”(cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma,宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸內(nèi)腺癌)，其余選項(xiàng)保持默認(rèn)，分析p16 在宮頸癌組織與正常組織中的差異及其與宮頸惡性腫瘤分期的相關(guān)性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 Kaplan-Meier plotter Kaplan-Meier plotter(www.kmplot.com)數(shù)據(jù)庫(kù)是一種用于探索54 000 個(gè)基因?qū)ι嬗绊懙墓ぞ撸w包括宮頸癌在內(nèi)的21 種癌癥類(lèi)型[9]。數(shù)據(jù)來(lái)源于宮頸癌患者TCGA 數(shù)據(jù)集、高通量基因表達(dá)(gene expression omnibus,GEO)和歐洲基因組-表型組檔案(European Genome-phenome Archive,EGA)數(shù)據(jù)庫(kù)下載的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、無(wú)復(fù)發(fā)和總生存信息等資料，使用該工具對(duì)宮頸癌中p16的不同表達(dá)水平進(jìn)行預(yù)后分析。利用“General”、“Boxplot”、“Stageplot”模塊分析p16 在人類(lèi)癌癥中的表達(dá)及其與宮頸癌腫瘤分期的相關(guān)性。選擇“mRNA-RNAseq”選項(xiàng)下“start KM plotter for pan-cancer”模塊，Gene symbol 輸入“CDKN2A”，Survival 分別選擇“OS”、“RFS”，腫瘤類(lèi)型選擇“Cervical squamous cell carcinoma(n=304)”，其余選項(xiàng)保持默認(rèn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 cBioPortal cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)被用來(lái)分析各類(lèi)型癌癥基因組數(shù)據(jù)集中的基因變異信息[10]，利用該工具分析宮頸癌患者TCGA 數(shù)據(jù)集中p16 的基因突變頻率、位點(diǎn)與類(lèi)型，同時(shí)利用該網(wǎng)站篩選出宮頸癌中p16 的100 個(gè)相關(guān)基因。選擇“Cervix”選項(xiàng)下“Cervical Squamous Cell Carcinoma(TCGA)”數(shù)據(jù)庫(kù)，Gene name 輸入“CDKN2A”，分別選擇“OncoPrint”、“Cancer Types Summary”、“Mutations”和“Co-expression”模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 String String(https://string-db.org/)用來(lái)建立蛋白質(zhì)間相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)模型[11]。本研究對(duì)p16 的50 個(gè)相關(guān)蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化：Multiple Proteins 輸入獲取的100 個(gè)基因列表，Organism 選擇“Homo sapiens”，“Settings”設(shè)置 為：“full STRING network”、“evidence”和“High confidence(0.700)”。

1.5 WebGestalt WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)是基于WEB 的基因集在線(xiàn)分析工具[12]。通過(guò)WebGestalt 對(duì)p16 相關(guān)基因進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能，京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和Reactome通路分析富集分析，GO 富集分析包括生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能，F(xiàn)DR＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體步驟：“Basic parameters”模塊選擇“Homo sapiens”、“Overrepresentation Enrichment Analysis(ORA)”，之后在“Gene List”界面上傳相關(guān)基因列表?！癋unctional Database”模塊中選擇“geneontology”-“Biological Process”、“Molecular function”、“Cellular component”進(jìn)行GO 富集分析，選擇“pathway”-“KEGG”+“Reactome”進(jìn)行通路富集分析。

1.6 TIMER 2.0 Timer 2.0(Tumor Immune Estimation Resource 2.0)用于評(píng)估宮頸癌中p16 的表達(dá)與不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平之間的相關(guān)性[13]。選擇“IMMUNE”模塊，Gene Expression 輸入“CDKN2A”，Immune Infiltrates 選擇“T cell CD4+”、“T cell CD8+”、“B cell”等免疫細(xì)胞類(lèi)型，導(dǎo)出結(jié)果中選擇CESC 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7 IHC 染色 回顧2021 年1 月1 日—12 月31日期間在江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院因?qū)m頸病變宮頸環(huán)形電切術(shù)(loop electrosurgical excision procedure,LEEP)的患者，納入所有通過(guò)IHC 檢測(cè)p16 的表達(dá)以明確診斷的病例。由病理醫(yī)師嚴(yán)格按流程完成染色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。

2 結(jié)果

2.1 p16在宮頸癌中的表達(dá) 通過(guò)GEPIA 2 數(shù)據(jù)庫(kù)比較p16 在泛癌組織與正常組織中的表達(dá)水平，可見(jiàn)p16 在膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等多器官惡性腫瘤組織中的表達(dá)均上調(diào)，尤其在CESC(P＜0.05)、卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma,OV)、子宮癌肉瘤(uterine carcinosarcomas,UCS)等女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中顯著高表達(dá)(圖1A～C)，但在宮頸癌不同臨床分期中的表達(dá)并無(wú)差異(圖1D)。

圖1 p16 在不同類(lèi)型癌癥及宮頸癌各臨床分期中的差異表達(dá)分析

2.2 p16 在宮頸癌預(yù)后中的作用分析 預(yù)后分析結(jié)果顯示：無(wú)論從中位數(shù)(Median)還是上四分位數(shù)(Upper quartile)而言，p16 低表達(dá)組患者具有更長(zhǎng)的總生存期(中位數(shù)HR=1.29，上四分位數(shù)HR=1.58)，而無(wú)復(fù)發(fā)生存期(中位數(shù)HR=0.87，上四分位數(shù)HR=0.95)較短，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖2)。結(jié)果提示：p16 低表達(dá)的宮頸癌患者可能更早地出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，但總生存期較樂(lè)觀(guān)。

圖2 宮頸癌中p16 的不同表達(dá)水平與生存期的相關(guān)性(Kaplan-Meier plotter)

2.3 p16 在宮頸癌中的遺傳學(xué)改變 進(jìn)一步對(duì)宮頸癌中p16 基因變異頻率、位點(diǎn)和類(lèi)型進(jìn)行分析，選擇包含297 例宮頸癌樣本的TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，庫(kù)內(nèi)共包含278 例樣本，6 例(2.2%)樣本檢測(cè)到p16 的遺傳變異。基因突變?nèi)堪l(fā)生在宮頸鱗狀細(xì)胞癌樣本中，突變位點(diǎn)集中在E88K，主要類(lèi)型包括錯(cuò)義突變、剪接突變和深度缺失等(圖3)。

圖3 宮頸癌中p16 的基因突變情況分析(cBioPortal)

2.4 p16 相關(guān)基因的功能及通路富集分析 首先，通過(guò)cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出宮頸癌中與p16 關(guān)系最密切的100 個(gè)基因，運(yùn)用String 數(shù)據(jù)庫(kù)匹配到的其中95 個(gè)基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)。WebGestalt 對(duì)p16 相關(guān)基因進(jìn)行了GO 富集分析，結(jié)果顯示：p16相關(guān)基因功能主要與生物調(diào)節(jié)、能量代謝、刺激反應(yīng)等生物過(guò)程；在以下細(xì)胞成分中高度富集：細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、膜封閉腔和內(nèi)膜系統(tǒng)等；分子功能方面：蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性和酶調(diào)節(jié)劑活性等被高度富集(圖5A)。此外，KEGG和Reactome 分析結(jié)果表明：p16 相關(guān)基因與質(zhì)膜內(nèi)蛋白(plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)、RHORho 激酶(Rho-associated kinase,ROCK)、生促紅素人肝細(xì)胞B 受體(ephrin type B receptor,EphB)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等通路相關(guān)(圖5B)。

圖4 p16 相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖5 p16 相關(guān)基因功能及通路富集網(wǎng)絡(luò)(WebGestalt)

2.5 p16 與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析 使用TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估宮頸癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與p16 之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示：p16 與CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞呈正弱相關(guān)，與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblast,CAFs)呈弱負(fù)相關(guān)，與中性粒細(xì)胞、自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞無(wú)明顯相關(guān)性(圖6)。以上數(shù)據(jù)表明，p16 在不同類(lèi)型腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制中發(fā)揮作用各異。

圖6 宮頸癌中p16 表達(dá)與不同類(lèi)型免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

2.6 p16 免疫組化染色結(jié)果分析 共51 例患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示：p16 在宮頸高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)病例中陽(yáng)性表達(dá)率為89.19%，而在低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)病例中陽(yáng)性表達(dá)率為14.29%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1，圖7)。

圖7 不同病理類(lèi)型宮頸組織中p16 的表達(dá)(100×)

表1 不同病例類(lèi)型中p16 表達(dá)情況分析

3 討論

宮頸癌發(fā)病具有明顯的地域性特點(diǎn)，85%以上的病例發(fā)生在低收入和中等收入國(guó)家[14]。從癌前病變到惡性腫瘤之間可能有較長(zhǎng)的進(jìn)展期，這為篩查和早期治療提供了機(jī)會(huì)。在細(xì)胞學(xué)檢查中診斷為L(zhǎng)SIL 或非典型鱗狀細(xì)胞-不能明確意義的患者通常會(huì)接受如陰道鏡+活檢等檢查，以排除更高級(jí)別的病變[15]。而研究[16]表明，70%～90%的LSIL 會(huì)自發(fā)消退，特別是30 歲以下女性。這意味著許多年輕患者的檢查是不必要的，如宮頸環(huán)形電切術(shù)或冷刀錐切術(shù)。不同病理醫(yī)師對(duì)同一等級(jí)病變的評(píng)估并不一致，且單獨(dú)應(yīng)用HE 染色的診斷個(gè)體差異較大，同時(shí)由于宮頸病變細(xì)胞學(xué)的多樣性，最終可能造成誤診和漏診。

P16 基因由p16INK4a、p15INK4b、p18INK4C 和p19INK4D 組成。P16 可與細(xì)胞周期蛋白D1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4，通過(guò)抑制CDK4 活性直接參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，起負(fù)調(diào)節(jié)作用[17-18]。HPV 表達(dá)的E7 蛋白干擾成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)基因的正常功能，E7 與磷酸化的Rb(pRb)結(jié)合使其功能失活，pRb 對(duì)p16 蛋白表達(dá)的負(fù)反饋抑制消失，導(dǎo)致p16 過(guò)表達(dá)[19]，最終引起宮頸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期紊亂，啟動(dòng)一系列癌變過(guò)程[20]。目前認(rèn)為p16 免疫染色陽(yáng)性可作為HSIL 的診斷標(biāo)志物，p16 過(guò)表達(dá)是宮頸高危型HPV 感染的替代指標(biāo)[21]。

宮頸組織病理學(xué)檢查易受主觀(guān)因素影響，特別是在診斷LSIL 時(shí)。而p16 過(guò)表達(dá)幾乎存在于所有的HSIL 和宮頸癌組織中，且表達(dá)位置有差異：在LSIL組織基底層彌漫表達(dá)，而在HSIL 組織的中層和淺層表達(dá)。因此，p16 檢測(cè)對(duì)于提高宮頸組織學(xué)診斷的正確性和再現(xiàn)性方面有重要意義。在D.ZHANG 等[19]的研究中，p16 陽(yáng)性與HE 染色病理診斷之間存在很強(qiáng)的一致性，而對(duì)于p16 陰性的患者，幾乎可以100%排除宮頸HSIL 或浸潤(rùn)癌。A.C.GUEDES 等[22]對(duì)90 例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的病理切片進(jìn)行了p16 和Ki-67 免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)其與宮頸上皮內(nèi)瘤變分級(jí)具有非常好的一致性。這些研究也與本結(jié)果相符合，生存分析顯示：p16 低表達(dá)宮頸癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期較短，但總生存期更長(zhǎng)。一種可能是p16 具有抑制腫瘤的作用，可以特異性地抑制cyclinD/CDK4/6 通路活性，從而調(diào)控細(xì)胞周期。腫瘤細(xì)胞增殖因此受到抑制，表達(dá)p16 的腫瘤整體表現(xiàn)出更好的預(yù)后。

近年來(lái)，研究[23]證實(shí)惡性腫瘤的發(fā)病與身體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。眾所周知，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的旁分泌，內(nèi)分泌和細(xì)胞間相互作用影響疾病的發(fā)展和預(yù)后，腫瘤微環(huán)境被認(rèn)為是重要的預(yù)后因素[24]。T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抗腫瘤免疫機(jī)制中起主要作用，主要分為不同的功能亞群：輔助性T 細(xì)胞(CD3+CD4+)，細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(CD3+CD8+)，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)等。CD8+T 細(xì)胞是主要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，CD4+T 細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞活化和增殖，兩者協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用；而Treg 細(xì)胞可誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制和免疫逃逸[25]。惡性腫瘤患者T 淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能異常會(huì)引起機(jī)體免疫系統(tǒng)失調(diào)，從而加速腫瘤的進(jìn)展。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，在不同條件下可分化為抗腫瘤經(jīng)典活化型(M1 型)或替代活化型(M2 型)，而M2 型巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)[26]。CAFs 是活化的成纖維細(xì)胞，是部分癌癥類(lèi)型中最豐富的基質(zhì)成分[27]。CAFs 的異質(zhì)性使其能對(duì)各種微環(huán)境信號(hào)作出不同反應(yīng)，并在癌癥進(jìn)展過(guò)程中成為干預(yù)的對(duì)立因素，給惡性腫瘤的臨床治療提出了重大挑戰(zhàn)。然而，專(zhuān)注于分析受各種癌癥類(lèi)型中不同CAFs 亞型影響的研究是有限的。CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被認(rèn)為能通過(guò)免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)抑癌作用，然而免疫逃逸機(jī)制或許是造成免疫細(xì)胞大量浸潤(rùn)而不能發(fā)揮抗腫瘤作用的罪魁禍?zhǔn)?，與之相關(guān)的研究亟待進(jìn)一步深入。

目前p16 染色已在部分醫(yī)院展開(kāi)應(yīng)用，旨在進(jìn)一步區(qū)分宮頸病變的級(jí)別。而推廣開(kāi)發(fā)p16 快檢試劑盒可能更有利于在體檢人群中精確地發(fā)現(xiàn)患病人群，尤其是罹患高級(jí)別病變者。本文使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)生信分析證實(shí)p16 在宮頸病變中呈高表達(dá)，并導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例失調(diào)。針對(duì)發(fā)現(xiàn)的異常免疫細(xì)胞分群浸潤(rùn)，尋求采用更有效免疫干預(yù)措施或許會(huì)使宮頸癌患者受益，如對(duì)免疫治療的應(yīng)答、延長(zhǎng)生存期等。預(yù)后分析則提示：選擇p16 作為分流指標(biāo)可以提高篩查的準(zhǔn)確性并實(shí)現(xiàn)更個(gè)體化的隨訪(fǎng)復(fù)查策略，避免年輕女性的過(guò)度檢查；特別是對(duì)于中低收入國(guó)家而言，其經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益更為可觀(guān)，今后還需要進(jìn)一步開(kāi)展更大樣本的多中心實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。