李夢(mèng)寒 趙望 賈庚佩 孫毅 曾同祥

(1.長江大學(xué)，荊州 434100； 2.長江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，荊州 434100; 3.長江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院皮膚病與性病科，荊州 434100)

鐮刀菌廣泛存在于土壤中和植物上，是一種條件致病菌，臨床上可引起角膜炎、皮膚感染及深部感染，其中鐮刀菌性角膜炎相對(duì)常見，而本病最常見的致病菌種是茄病鐮刀菌[1-3]。目前臨床上隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，皮膚及深部鐮刀菌感染的報(bào)道不斷增加[4]。但伏立康唑治療侵襲性鐮刀菌病的成功率僅為 46%～67%，而兩性霉素B通常因其不良反應(yīng)導(dǎo)致治療失敗[5-7]。

大蠟螟幼蟲作為一種昆蟲模型，可以作為病原真菌感染模型，如曲霉、念珠菌等，且研究結(jié)果與哺乳動(dòng)物模型有正相關(guān)性[8-10]。既往的研究表明，大蠟螟幼蟲具有完善的先天免疫應(yīng)答機(jī)制，并在上皮細(xì)胞防御、細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答上與哺乳動(dòng)物共享進(jìn)化模式并保持一致[11-13]。大蠟螟幼蟲可以在25～37℃環(huán)境中生存，因此該模型適合于人體鐮刀菌感染的相關(guān)研究[14-15]。大蠟螟幼蟲模型與傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物感染模型相比，易存活，價(jià)格便宜，操作方便，實(shí)驗(yàn)周期短，已被廣泛用作評(píng)價(jià)微生物病原體(包括真菌病原體)毒力和抗菌藥物療效的替代模型[16-19]。但在中國知網(wǎng)和PubMed上檢索既往中英文文獻(xiàn)，未查找到關(guān)于茄病鐮刀菌的大蠟螟幼蟲感染模型的研究。

本研究的目的是建立大蠟螟幼蟲體內(nèi)模型以研究茄病鐮刀菌的毒力，同時(shí)檢測伏立康唑?qū)η巡＄牭毒捏w內(nèi)抗菌效果，為構(gòu)建茄病鐮刀菌毒力及抗真菌治療的動(dòng)物模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株 茄病鐮刀菌BMU7905(由北京大學(xué)第一醫(yī)院惠贈(zèng))，在沙堡弱固體培養(yǎng)基平皿上35℃培養(yǎng)3 d后收集新鮮孢子。用生理鹽水將活化好的茄病鐮刀菌制成濃度為1×108CFU/mL的孢子懸液。

實(shí)驗(yàn)用藥 伏立康唑(批號(hào)S1442，純度>99%)購自美國Selleck公司。使用分析純度二甲亞砜來溶解并配置為6 400 μg/mL母液，用生理鹽水稀釋為100 μg/mL工作液。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大蠟螟幼蟲購自四川省成都寵物飼料公司，幼蟲為六齡幼蟲，長度2～3 cm，體重平均0.33 g/只。實(shí)驗(yàn)均挑選活力好，無黑斑幼蟲。大蠟螟幼蟲注射方法：選擇25 μL尖頭微量進(jìn)樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)作為注射工具，吸取菌懸液或抗菌藥物工作液，經(jīng)大蠟螟幼蟲左下腹后足注射入大蠟螟幼蟲體內(nèi)。大蠟螟幼蟲孵育環(huán)境：將大蠟螟幼蟲分組后，每一組大蠟螟幼蟲分別置于一次性塑料培養(yǎng)盒內(nèi)，并向其中加入適量的紗布和少量的水來保持環(huán)境的濕度，之后將培養(yǎng)盒放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。

1.2 菌株毒力檢測實(shí)驗(yàn)

菌液稀釋 用生理鹽水將制備好的高濃度的菌懸液分別稀釋至1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL。

分組、注射及孵育 本實(shí)驗(yàn)分為6組，每組20只大蠟螟幼蟲(其中C1、C2組為對(duì)照組，T1、T2、T3、T4組為實(shí)驗(yàn)組)。C1組不做任何處理作為空白對(duì)照；C2組每只幼蟲注射無菌生理鹽水10 μL作為陰性對(duì)照；T1組每只幼蟲注射濃度為1×105CFU/mL的菌懸液10 μL(103/幼蟲)；T2組每只幼蟲注射濃度為1×106CFU/mL的菌懸液10 μL(104/幼蟲)；T3組每只幼蟲注射濃度為1×107CFU/mL的菌懸液10 μL(105/幼蟲)；T4組每只幼蟲注射濃度為1×108CFU/mL的菌懸液10 μL(106/幼蟲)。注射完成后，將所有大蠟螟幼蟲放回培養(yǎng)盒內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育達(dá)5 d，并每24 h記錄大蠟螟幼蟲死亡數(shù)量(幼蟲死亡后表現(xiàn)為：蟲體不移動(dòng)、觸之無反應(yīng)、體表顏色變黑)(見圖 1)。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，比較2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)論一致。

結(jié)果分析與繪圖 在Graphpad 8.0軟件上，將連續(xù)5 d大蠟螟幼蟲的生存數(shù)據(jù)錄入系統(tǒng)，并繪制大蠟螟幼蟲的生存曲線圖。由于本實(shí)驗(yàn)的目的之一為測定茄病鐮刀菌菌株的毒力以確定最適接種量，因此根據(jù)繪制的大蠟螟幼蟲生存曲線(見圖2)，分析結(jié)果，最終確定茄病鐮刀菌能夠在120 h時(shí)使幼蟲死亡率達(dá)到100%的菌液濃度(1×107CFU/mL)為最適接種濃度，為后續(xù)的抗菌藥物療效測定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.3 體內(nèi)抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

菌液配置 用生理鹽水稀釋孢子懸液，調(diào)到合適的感染濃度(1×107CFU/mL)。

分組、感染、抗菌藥物治療及孵育 本實(shí)驗(yàn)分為4組，每組20只大蠟螟幼蟲(其中C3、C4組為對(duì)照組，T5、T6組為實(shí)驗(yàn)組)，分組后分別將大蠟螟幼蟲按組別放入培養(yǎng)盒內(nèi)，并做好相應(yīng)標(biāo)記。C3組不做任何處理作為空白對(duì)照；C4組每只幼蟲注射無菌生理鹽水10 μL作為陰性對(duì)照；T5、T6組每只幼蟲注射濃度為1×107CFU/mL的菌懸液10 μL(105/幼蟲)。將4組大蠟螟幼蟲放回相應(yīng)培養(yǎng)盒，置于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h后取出，C3組不做任何處理；C4、T5組每只幼蟲注射5 μL生理鹽水；T6組每只幼蟲注射5 μL伏立康唑(0.5 μg/幼蟲)。給藥完成后，將所有大蠟螟幼蟲放回培養(yǎng)盒內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育達(dá)5 d，并每24 h記錄大蠟螟幼蟲死亡數(shù)量(幼蟲死亡后表現(xiàn)為：蟲體不移動(dòng)、觸之無反應(yīng)、體表顏色變黑)(見圖 1)。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，比較2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)論一致。

結(jié)果分析與繪圖 在Graphpad 8.0 軟件上，將連續(xù)5 d大蠟螟幼蟲的生存數(shù)據(jù)(見表1)錄入系統(tǒng)，并繪制大蠟螟幼蟲的生存曲線圖。

表1 由茄病鐮刀菌BMU7905感染的大蠟螟幼蟲經(jīng)伏立康唑治療組及其他對(duì)照組連續(xù)5 d的生存數(shù)據(jù)Tab.1 Survival data of the G. mellonella larvae infected by F. solani BMU7905 in the voriconazole treatment group and other control groups for 5 consecutive days (n)

1.4 病理組織切片的制備

為了評(píng)估宿主組織內(nèi)的真菌感染情況，將收集的第2天死亡的T5、T6組大蠟螟幼蟲尸體用于制備組織病理切片?？v向切開蟲體，并將蟲體浸泡于4%多聚甲醛中，然后將固定的大蠟螟幼蟲包埋在石蠟中，切片后，用蘇木精和伊紅(H&E)染色劑染色。

2 結(jié) 果

2.1 茄病鐮刀菌菌株毒力檢測結(jié)果

在菌株毒力檢測實(shí)驗(yàn)中(見圖 2)，當(dāng)菌液濃度為1×107CFU/mL時(shí)，大蠟螟幼蟲累計(jì)5 d的死亡率達(dá)100%，當(dāng)菌液濃度為1×106和1×105CFU/mL時(shí)，大蠟螟幼蟲累計(jì)5 d的死亡率未超過30%，當(dāng)菌液濃度為1×108CFU/mL時(shí)，大蠟螟幼蟲在第1 d的死亡率達(dá)100%，而未處理組和生理鹽水對(duì)照組的大蠟螟幼蟲累計(jì)5 d的死亡率未超過5%，因此我們選擇1×107CFU/mL作為接種濃度并成功建立茄病鐮刀菌BMU7905-大蠟螟幼蟲感染模型。

2.2 大蠟螟幼蟲感染后的抗菌藥物療效

由茄病鐮刀菌BMU7905感染后的大蠟螟幼蟲在經(jīng)過伏立康唑治療后，其120 h生存率明顯高于單菌組，且生理鹽水對(duì)照組和未處理組生存率超過90%(見圖3)，因此，我們認(rèn)為伏立康唑具有較好的蟲體內(nèi)抗茄病鐮刀菌作用。

圖3 由茄病鐮刀菌BMU7905感染的大蠟螟幼蟲經(jīng)伏立康唑治療組及其他對(duì)照組生存率曲線. C3. 未處理；C4. 生理鹽水；T5. 茄病鐮刀菌BMU7905；T6. 茄病鐮刀菌BMU7905+伏立康唑(0.5 μg/幼蟲)Fig.3 Survival rate of the G. mellonella larvae infected by F. solani BMU7905 in the voriconazole treatment group and other control groups. C3. untreated; C4. normal saline; T5. F. solani BMU7905; T6. F. solani BMU7905+ voriconazole (0.5 μg /larva)

2.3 大蠟螟幼蟲被茄病鐮刀菌BMU7905感染后體腔組織的病理改變

病理切片染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量鐮刀菌菌絲和孢子(見圖4)。

圖4 大蠟螟幼蟲被茄病鐮刀菌BMU7905感染后體腔組織的病理改變(H&E染色). T5. 茄病鐮刀菌BMU7905感染(A：×10；B：×40)； T6. 茄病鐮刀菌BMU7905+伏立康唑(0.5 μg/幼蟲)(C：×10；D：×40)；黑色箭頭：菌絲團(tuán)及孢子Fig.4 Pathological changes of body cavity tissues after the G. mellonella larvae were infected by F. solani BMU7905(H & E staining). T5. F. solani BMU7905 infection (A：×10；B：×40); T6. F. solani BMU7905 + voriconazole (0.5 μg/larva) (C：×10；D：×40); black arrow: hyphae clumps and spores

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在Graphpad 8.0軟件上，對(duì)圖2、圖3中生存曲線所有組別進(jìn)行Log-rank test和Gehan-Breslow-Wilcoxon test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均為P<0.0001, 圖2、圖3中生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

在本研究中，成功地建立了茄病鐮刀菌感染的大蠟螟幼蟲模型以研究抗菌藥物在動(dòng)物體內(nèi)的療效。菌株毒力檢測實(shí)驗(yàn)表明，大蠟螟幼蟲的生存率隨著菌液濃度的增加而降低。當(dāng)大蠟螟幼蟲被第5 d達(dá)100%致死量的濃度的茄病鐮刀菌感染時(shí)，用伏立康唑治療顯著提高了大蠟螟幼蟲的生存率。此結(jié)果與已有的體外研究及臨床病例研究的結(jié)果具有一致性[20-23]。被茄病鐮刀菌感染的大蠟螟幼蟲尸體的病理切片發(fā)現(xiàn)了大量鐮刀菌菌絲和孢子也佐證了動(dòng)物模型的有效構(gòu)建。參與大蠟螟幼蟲免疫反應(yīng)的血細(xì)胞與哺乳動(dòng)物的中性粒細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上高度相似，體液免疫包括黑化作用、調(diào)理素和抗菌肽的產(chǎn)生。生物基因組研究表明，大蠟螟有許多與人類基因同源的編碼產(chǎn)物參與病原體識(shí)別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此在研究免疫系統(tǒng)對(duì)于病原體的反應(yīng)及反應(yīng)機(jī)制時(shí)，大蠟螟幼蟲具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。大蠟螟對(duì)茄病鐮刀菌感染的免疫情況還需進(jìn)一步研究。在真菌病模型中，大蠟螟現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于白念珠菌、光滑念珠菌、曲霉、組織胞漿菌、孢子絲菌、新生隱球菌、毛霉及鐮刀菌等致病真菌的致病機(jī)制、宿主免疫、毒力評(píng)估及抗真菌藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)等領(lǐng)域，大蠟螟幼蟲可進(jìn)行大樣本的研究便于統(tǒng)計(jì)分析，而且動(dòng)物倫理方面的限制較少[24-28]。當(dāng)需要初步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，又礙于哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的種種困難，大蠟螟幼蟲是一個(gè)很好的選擇。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)只研究了茄病鐮刀菌BMU7905這一種型號(hào)的鐮刀菌，在菌株是否具有代表性上存在劣勢(shì)。目前，臨床上治療茄病鐮刀菌病的常規(guī)方案是兩性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑等抗真菌藥物單獨(dú)或聯(lián)合治療以及糾正中性粒細(xì)胞減少來增強(qiáng)免疫功能，有些病例還可手術(shù)清除感染灶。其中，抗真菌藥物療效仍未確定，具體治療藥物及其劑量還需通過藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出選擇。盡管以上實(shí)驗(yàn)在一定程度上證實(shí)了伏立康唑有較好的抗茄病鐮刀菌效果，但在用法用量方面還需進(jìn)一步研究，才能更好地指導(dǎo)臨床治療。另外，對(duì)于伏立康唑與其他藥物聯(lián)合治療鐮刀菌病還有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)豐富了大蠟螟幼蟲作為真菌感染模型方面的研究，為后續(xù)針對(duì)鐮刀菌病的治療提供了研究思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié) 論

大蠟螟幼蟲感染模型可以作為哺乳動(dòng)物模型的替代方案，用于研究茄病鐮刀菌的毒力以及檢測抗真菌藥物對(duì)茄病鐮刀菌的體內(nèi)抗菌效果。但蟲體結(jié)構(gòu)與人體仍存在較大差異，所以還不能完全替代更精細(xì)的哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

致謝：感謝北京大學(xué)第一醫(yī)院李若瑜教授惠贈(zèng)茄病鐮刀菌菌株！