陳晨 賀彬嬋 朱益敏 趙蓓蕾 陳菲 徐小勇

[1.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南京 210002；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院江蘇省第二中醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南京 210017；3.南京中醫(yī)院大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第二醫(yī)院)結(jié)核四科，南京 211131]

遠距離的細胞間通訊日益受到重視，這種通訊的重要載體就是細胞分泌的細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)[1-2]。EVs是細胞合成、分泌的一類由雙層脂質(zhì)膜包裹的尺寸在納米至微米范圍內(nèi)的囊泡狀小體。它選擇性攜帶細胞的信息，外排分泌到細胞外環(huán)境中，進而與靶細胞結(jié)合，主要執(zhí)行信息和物質(zhì)傳遞的信使功能。作為重要的致病原，真菌包括煙曲霉同樣也能分泌EVs[3-5]。明確EVs的成分是掌握曲霉致病機制的重要環(huán)節(jié)，為此我們通過分子生物學(xué)方法結(jié)合生物信息學(xué)對EVs中重要成分進行分析。

1 材料與方法

1.1 曲霉的生長

標(biāo)準(zhǔn)煙曲霉株AF273接種于沙堡弱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中孵育5 d。無血清RPMI-1640細胞培養(yǎng)基洗下，16層無菌紗布過濾，懸液含孢子107/mL，置于37℃，48 h后鏡下有明顯菌絲形成。

1.2 分離出細胞外囊泡(EVs)

吸取曲霉培養(yǎng)的上清，然后4℃下4 000 g離心15 min，去除沉淀的曲霉，留上清，然后15 000 g，15 min去除破碎細胞片。剩余上清，0.45 μm的濾器過濾。然后4℃，100 000 g離心1 h，上清去除，然后5倍重懸(0.1 mol/L TBS)，4℃，100 000 g離心1 h，留取沉淀。

1.3 納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)

采用馬爾文納米顆粒跟蹤分析儀(Nanosight NS300)，軟件選擇NTA 3.0分析軟件，分析溶液中EVs的大小分布。

1.4 電鏡檢測(electronic microscopy)

EVs戊二醛固定，PBS清洗3次，加入0.5 mL 2%鋨酸溶液4℃固定2 h。PBS清洗后乙醇1 mL梯度脫水。用1 mL丙酮置換2次。將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中。將包埋板置于65℃條件下聚合48 h。醋酸雙氧鈾染色10 min后清洗；醋酸鉛染色10 min后清洗。電鏡觀察。

1.5 EV組分析

樣品從-80 ℃取出，分別加入4倍體積裂解緩沖液，超聲裂解。去除細胞碎片后利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。胰酶酶解的肽段除鹽后真空冷凍干燥。TEAB溶解肽段，根據(jù)TMT試劑盒操作說明標(biāo)記肽段。肽段用高pH反向HPLC分級，色譜柱為Agilent 300Extend C18。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進行電離然后進Q Exactive HF-X質(zhì)譜進行分析。二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant (v1.5.2.8)進行檢索。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡觀察EVs

我們通過離心法提取煙曲霉的EVs，電鏡檢測，可見明顯的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)(見圖1)。

圖1 電鏡下煙曲霉的EVs形態(tài)Fig.1 EVs morphology of Aspergillus fumigatus under electron microscope

2.2 NTA

通過NTA發(fā)現(xiàn)，煙曲霉的EVs大小主要集中在130 nm左右(見圖2)。

圖2 NTA分析煙曲霉的EVs大小分布Fig.2 EVs size distribution of Aspergillus fumigatus analyzed by NTA

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

通過質(zhì)譜，以煙曲霉的基因組序列(AF1163)，進行對比。利用http://www.aspgd.org/中GO分析和Pubmed對序列進行描述和推測其功能。PSORT(https://www.psort.org/)對序列進行定位分析。通過蛋白軟件分析，EVs蛋白中非穩(wěn)定蛋白為9種(15%)，其余為穩(wěn)定蛋白，而PI>7的為6種蛋白，因此在體內(nèi)大部分蛋白帶有負電荷。

蛋白定位分析 EVs中大部分是胞漿蛋白，其余比較多的是細胞外分泌蛋白，但仍有25%的蛋白不能定位，需要進一步實驗(見圖3)。

穿膜蛋白和GPI錨定蛋白分析 通過TMPred和GPI預(yù)測，有5種蛋白存在雙層脂質(zhì)膜上(見表2)。

表2 存在于雙層脂質(zhì)膜上的5種蛋白

2.4 RNA組學(xué)分析

RNA分布 檢測到RNA中主要是rRNA和tRNA分別占59.7%和29.4%，而miRNA占0.25%(見圖4)。

miRNA的分布情況 煙曲霉EVs里miRNA的長度分布在17～29 nt，主要在19～24 nt(見圖5)。

miRNA可能影響的一些通路 由于煙曲霉EVs可以被細胞吞噬而進入人體細胞內(nèi)，而影響的宿主細胞的生理過程，特別是miRNA存在特殊結(jié)構(gòu)可不易被宿主細胞內(nèi)RNA酶降解而發(fā)揮一定作用。同時煙曲霉的miRNA數(shù)據(jù)庫尚未建立，因此我們參照人的miRNA數(shù)據(jù)庫分析煙曲霉EVs中miRNA可能參與的一些通路(見圖6)。我們可以發(fā)現(xiàn)EVs-miRNA主要可能影響代謝通路，其他如mTOR、肌動蛋白相關(guān)細胞骨架、Ras、MAPK、PI3K-Akt等信號通路也有一定比例參與。

圖6 EVs中miRNA可能參與的信號通路分析圖

3 討 論

臨床上患者腸道菌群的改變可伴隨肺部炎癥或哮喘出現(xiàn)。局限性的慢性曲霉病患者出現(xiàn)大片肺浸潤和喘息癥狀，這并非病原體的播散，而是微生物分泌的生物活性物質(zhì)對機體的刺激，而這種遠程通訊的重要載體就是細胞分泌的EVs。20世紀(jì)60年代就證實病原微生物可以分泌EVs，早期被認為是微生物的代謝廢物，但越來越多的研究表明Evs在病原體感染過程中起著極為重要的作用，病原體分泌的EVs可誘導(dǎo)宿主細胞壞死、凋亡，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，可以成為微生物毒力的載體，而有時候EVs可刺激宿主免疫反應(yīng)[1,6]，協(xié)助宿主清除微生物。大腸桿菌分泌的EVs入血可出現(xiàn)宿主出現(xiàn)膿毒癥。正常腸道菌群分泌的EVs可調(diào)節(jié)宿主的免疫功能，脆弱擬桿菌的EVs通過宿主的TOLL樣受體2(TOLL like receptor 2，TLR2)，刺激Foxp3表達，增加CD4細胞中IL-10分泌[7]，減少免疫性腸炎、哮喘等發(fā)生。真菌的EVs研究始于2007年，越來越多的研究表明其承載的大分子在感染中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，格特隱球菌強毒力株分泌的EVs能刺激巨噬細胞內(nèi)正常非毒力株的快速增殖，而毒力的主要承擔(dān)物質(zhì)是RNA和蛋白[8]。而作為人類重要致病原的曲霉其研究尚處起步階段，2019年Souza[4]證實了煙曲霉也能分泌EVs，并做了初步的蛋白組學(xué)的分析，曲霉分泌的EVs可被巨噬細胞識別和吞噬，并且可增強巨噬細胞黏附、吞噬殺滅曲霉孢子的能力，但其炎癥涉及的通路并未明確。

真菌與動物細胞重要的不同就是存在堅硬的細胞壁，這層細胞壁可能會阻斷一些物質(zhì)的分泌，包括囊泡的分泌。最近的研究表明新生隱球菌和白念珠菌的細胞壁并非堅硬密閉的一層結(jié)構(gòu)，而是能允許其60～80 nm的EVs分泌[9]，干擾細胞壁合成后EVs大小分布無明顯改變。我們的實驗發(fā)現(xiàn)煙曲霉也能分泌EVs，其直徑大小主要分布在130 nm左右，證實了曲霉的細胞壁也不能阻止分泌EVs，但我們之前的實驗都是在煙曲霉菌絲狀態(tài)，而對于細胞壁成分結(jié)構(gòu)更為堅實的孢子狀態(tài)尚未有研究。真菌分泌EVs的途徑尚存在很大空白，蛋白質(zhì)分析EVs中大部分是胞漿內(nèi)蛋白，這樣提示真菌的EVs分泌類似其他細胞的外泌體分泌途徑，從胞漿內(nèi)起始。通過RNA的分析也證實了這一點，煙曲霉EVs中大部分RNA為rRNA和tRNA也提示EVs起源于真菌的胞漿，從具體含量可推測煙曲霉分泌細胞內(nèi)成分并非致病機制的主動行為，或許分泌EVs只是生物體的固有本能機制或者細胞間信號和物質(zhì)交流的重要機制。

通過生物信息學(xué)分析，有可能對EVs中關(guān)鍵信號分子進行推測。煙曲霉EVs存在數(shù)十種的蛋白質(zhì)，其中包括Hsp90和Hsp70高度同源蛋白。這種同源蛋白與NOD受體-Casp9存在一定相互作用，Hsp90與NOD的CARD域結(jié)合抑制NOD降解而利于炎性信號的傳遞[10]，Hsp也可通過TLR2途徑影響宿主免疫[11]。而NOD在抗曲霉免疫中也有重要作用[12]，而NOD通過多種蛋白可以和NLRP3存在相互作用。EVs中miRNA分析，最主要的是對代謝途徑的影響，而具體的作用還待進一步的研究。另外，還有很多miRNA可能涉及mTOR、肌動蛋白相關(guān)細胞骨架、Ras、MAPK、PI3K-Akt等信號通路，這些信號通路都可能對炎癥反應(yīng)起重要作用。本研究尚有很多提升地方，比如需進一步檢測EVs中多糖成分，這類物質(zhì)可能更會刺激宿主細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

總之，我們證實了煙曲霉也能分泌EVs，其中位直徑在130 nm，含有較多種蛋白，以煙曲霉胞漿蛋白為主，RNA以rRNA和tRNA為主，而其中miRNA可能涉及多種信號通路。