尹一卜 李吉祥 郭櫻杰 蘆子廷 肖 英 劉華領(lǐng) 詹亞光 曾凡鎖*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 黑龍江省山河屯林業(yè)局，哈爾濱 150232）

木質(zhì)素是高等陸地植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，它增強(qiáng)細(xì)胞的機(jī)械支持力和抗壓強(qiáng)度，促進(jìn)了水的運(yùn)輸，并成為抵抗病原體的物理屏障。木質(zhì)素的含量和組成在植物物種間以及植物體內(nèi)部有很大差異，并受發(fā)育和環(huán)境因素的影響。木質(zhì)素單體（S-，G-和H-木質(zhì)素的單體）生物合成途徑中大多數(shù)酶及其功能已被確定。目前，可以利用木質(zhì)素生物合成途徑中關(guān)鍵基因（等）的特定突變、遺傳修飾及差異表達(dá)來(lái)改變木材品質(zhì)性狀。苯丙氨酸途徑受到干擾后，途徑中間體可能會(huì)成功整合到木質(zhì)素聚合物中，從而影響其理化性質(zhì)。苯丙氨酸氨解酶（PAL）和酪氨酸氨解酶（TAL）催化苯丙氨酸向反式肉桂酸的轉(zhuǎn)化，并將碳流從莽草酸途徑引入苯丙烷代謝的各個(gè)分支，這是苯丙烷代謝途徑的第一步，也是初級(jí)和次級(jí)代謝交叉的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)。研究表明，同一植物中不同的基因表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制具有顯著的差異性。在擬南芥（）中具有4個(gè)不同的基因，其表達(dá)具有組織特異性，其中和表達(dá)模式較為相似，均在擬南芥的根、花、莖中表達(dá)水平較高，而在上述部位中幾乎沒(méi)有表達(dá)，獲得的、、、四突變體中木質(zhì)素的含量降低，并且大大減少莖中木質(zhì)素和其他酚類化合物的含量，這些突變體在生長(zhǎng)、繁殖力和對(duì)環(huán)境壓力的耐受性方面都受到損害。白梨（）基因在木質(zhì)化組織（根和莖）中的的轉(zhuǎn)錄水平高于木質(zhì)度較低的組織（葉、芽和花），在過(guò)表達(dá)擬南芥中增加了木質(zhì)素含量和細(xì)胞壁厚度，參與木質(zhì)素生物合成。本文的前期研究克隆了水曲柳（）基因，其與梨樹(shù)（）中參與木質(zhì)素合成的PAL基因具有極高同源性?；蛟谀举|(zhì)化程度較高的水曲柳枝中表達(dá)量最高，具有組織特異性。表達(dá)模式在水曲柳的不同部位顯示出與木質(zhì)素含量相似的變化趨勢(shì)，初步說(shuō)明可能參與水曲柳中木質(zhì)素的生物合成。在非生物脅迫下，的表達(dá)量顯著上升。植物的苯丙烷類代謝途徑能夠被非生物脅迫激活，從而增加基因的活性，提高植物抗逆境能力，起到保護(hù)和調(diào)節(jié)的作用。轉(zhuǎn)錄水平隨環(huán)境因素變化，例如高光/紫外線、病原體攻擊、低氮、低磷酸鹽、低溫和傷害都可以改變基因的轉(zhuǎn)錄水平。

水曲柳為木犀科（Oleaceae）白蠟屬（又稱為梣屬）落葉喬木，是東北珍貴的闊葉用材樹(shù)種之一。該樹(shù)種是中國(guó)木材生產(chǎn)的主要商業(yè)樹(shù)木之一，在東北的生態(tài)和環(huán)境保護(hù)中發(fā)揮著重要作用。前期研究中，本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)獲得水曲柳與大葉白蠟（）、小葉白蠟（）和絨毛白蠟（）的雜種F1，并營(yíng)建了對(duì)比試驗(yàn)林。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷類代謝中的關(guān)鍵酶和限速酶，解析的等位基因變異對(duì)水曲柳生長(zhǎng)和木材品質(zhì)性狀的影響機(jī)制具有重要意義。分析各雜交組合F1 木質(zhì)素含量，并與其母本自由授粉子代進(jìn)行比較，可揭示水曲柳各雜交組合木質(zhì)素含量的變異規(guī)律。通過(guò)序列測(cè)定，篩選F1 代各無(wú)性系中的SNP 位點(diǎn)，與木質(zhì)素含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，探究基因內(nèi)部堿基變化對(duì)水曲柳木質(zhì)素含量的影響，為從分子水平對(duì)水曲柳的雜交子代的選育和木材改良研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)方法

1.1.1 試驗(yàn)材料

本研究材料取自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山林場(chǎng)，71 個(gè)白蠟屬種間雜交組合子代及16 個(gè)母本自由授粉子代。其中，親本為水曲柳×大葉白蠟的雜交組合共有25 個(gè)、親本為水曲柳×小葉白蠟的雜交組合共有18 個(gè)、親本為水曲柳×絨毛白蠟的雜交組合共有28 個(gè)、母本水曲柳的對(duì)照組合共有16 個(gè)。每個(gè)雜交組合取2～3 株，共176 個(gè)無(wú)性系，平均每棵樹(shù)上取3～4 個(gè)當(dāng)年新生枝條。將水曲柳枝用固體粉碎機(jī)攪碎呈粉末狀，裝入信封，標(biāo)明其對(duì)應(yīng)的水曲柳無(wú)性系，放于干燥通風(fēng)處以備后續(xù)試驗(yàn)使用。另一部分取每株新生枝剝?nèi)?shù)皮，放入-80 ℃冰箱保存，用于總DNA提取。

1.1.2 水曲柳新生枝木質(zhì)素含量測(cè)定

取一定量烘干的水曲柳粉末（80 目），將樣品放在65 ℃下烘干至恒質(zhì)量。取0.05 g 樣品溶于1 mL溴乙酰冰醋酸溶液（25%）中，70 ℃水浴30 min，冷卻后加入0.4 mL（2 mol·L）NaOH 終止反應(yīng)，再加入1 mL 冰醋酸和0.04 mL（0.5 mol·L）羥氨鹽酸，離心收集上清液，加入蒸餾水稀釋50 倍，測(cè)量280 nm處OD值A(chǔ)，以計(jì)算木質(zhì)素的含量。

1.1.3 水曲柳總DNA的提取及克隆

將水曲柳新生枝樹(shù)皮材料加入液氮研磨成細(xì)粉末狀后加入到已預(yù)熱（65 ℃）的CTAB 緩沖液中，放入金屬浴儀器（65 ℃）中保溫30 min，每5 min 搖動(dòng)離心管，后把樣品管插到冰上冷卻2 min，加入700μL 氯仿，離心取上清液再次加入氯仿離心，此過(guò)程重復(fù)2次。取上清液加入等體積的異丙醇，輕輕搖勻后插到冰上，沉淀至少30 min。離心取沉淀用70%的乙醇洗滌2次，最后加入50μL的ddHO進(jìn)行溶解，溶解后離心1 min，進(jìn)行電泳。設(shè)計(jì)基 因 全 長(zhǎng) 引 物 序 列（F：5′CTGCCA‐CATTCAACAACAAGAG3′，R：5′GTTTTAGTCCCAAAGTCTTGTTACA3′）并以提取水曲柳DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。電泳檢測(cè)利用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，選擇特異性條帶且大小在1 800 左右的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPASS19.0 軟件對(duì)所測(cè)得的木質(zhì)素含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)木質(zhì)素含量進(jìn)行差異顯著性分析。

所需應(yīng)用的變異系數(shù)的計(jì)算公式：

式中：代表所測(cè)含量或性狀的平均值，代表代表所測(cè)含量或性狀的對(duì)應(yīng)于平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。

對(duì)遺傳力進(jìn)行計(jì)算研究所需公式：

式中：值代表遺傳力，代表樣本進(jìn)行放長(zhǎng)分析時(shí)的輸出項(xiàng)。

1.3 核苷酸多態(tài)性及SNP關(guān)聯(lián)性分析

將序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，篩選出SNP 位點(diǎn)，對(duì)突變頻率極低（＜3%）的位點(diǎn)進(jìn)行排除，計(jì)算SNP 頻率及發(fā)生突變過(guò)程中轉(zhuǎn)換和顛換的數(shù)量。利用DnaSP5.0 軟件分析基因核苷酸多樣性并進(jìn)行中性檢測(cè)；利用MEGA 軟件對(duì)不同無(wú)性系間基因的遺傳距離進(jìn)行分析；再利用DnaSP5.0軟件對(duì)基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析；最后結(jié)合其對(duì)應(yīng)無(wú)性系的木質(zhì)素含量，利用SPSS 軟件進(jìn)行差異檢測(cè)及關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蠟屬種間雜交組合木質(zhì)素含量分析

測(cè)量分析不同雜交組合子代木質(zhì)素的含量（見(jiàn)表1），在水曲柳×大葉白蠟組中70 號(hào)雜交組合木質(zhì)素含量最高為（32.96±5.25）%。水曲柳×小葉白蠟組和水曲柳×絨毛白蠟組中129號(hào)和7號(hào)雜交組合的木質(zhì)素含量為（35.29±1.71）%，（39.79±7.15）%達(dá)到組合內(nèi)最高水平。而母本自由授粉子代中135 號(hào)木質(zhì)素含量達(dá)到了最高值為（37.20±3.73）%，但是其中大多數(shù)雜交組合水曲柳的木質(zhì)素含量是高于母本對(duì)照水曲柳組的平均含量。70號(hào)、129 號(hào)，7 號(hào)雜交組合木質(zhì)素遺傳增益分別13.59%，25.57%，36.33%。

表1 白蠟屬種間雜交組合木質(zhì)素含量均值統(tǒng)計(jì)Table 1 Mean statistics of lignin content in Fraxinus spp.hybrid combinations

分析71 個(gè)雜交組合和16 個(gè)母本自由授粉子代間木質(zhì)素的含量差異（見(jiàn)表2），根據(jù)SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，各雜交組合間木質(zhì)素含量差異極顯著（<0.01）。水曲柳×大葉白蠟組、水曲柳×小葉白蠟組、水曲柳×小葉白蠟組及母本自由授粉子代的木質(zhì)素含量的變化范圍分別為17.28%～36.07%、11.98%～35.29%、11.80%～39.79%和11.59%～37.20%（見(jiàn)表2）。各組合內(nèi)木質(zhì)素含量差異顯著，其各組間的均值范圍為25.53%～27.38%，各雜交組合內(nèi)木質(zhì)素含量的均值分別為：水曲柳×大葉白蠟（27.31±4.72）%；水曲柳×小葉白蠟（26.50±6.47）%；水曲柳×絨毛白蠟（27.38±5.20）%；母本自由授粉子代水曲柳（25.53±7.16）%。各雜交組的木質(zhì)素含量均與母本自由授粉子代水曲柳差異顯著，遺傳力范圍為0.657～0.895。

表2 白蠟屬各組合木質(zhì)素的方差分析及含量變異參數(shù)分析Table 2 Variance analysis and content variation parameter analysis of lignin in various combinations of Fraxinus spp.

2.2 各雜交組合內(nèi)無(wú)性系間木質(zhì)素的含量及變異參數(shù)均值分析

對(duì)176 個(gè)無(wú)性系木質(zhì)素含量進(jìn)行分析（見(jiàn)表3），其中親本為水曲柳×大葉白蠟?zāi)副舅s交子代無(wú)性系53 個(gè)；水曲柳×小葉白蠟雜交子代無(wú)性系28 個(gè)；水曲柳×絨毛白蠟雜交子代無(wú)性系66個(gè)；母本自由授粉子代水曲柳無(wú)性系28 個(gè)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，水曲柳雜交組合內(nèi)各無(wú)性系木質(zhì)素含量差異顯著，具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。

表3 各組合內(nèi)無(wú)性系木質(zhì)素含量方差顯著性分析Table 3 Significance analysis of variance of lignin con‐tent in clones of different combinations

對(duì)176 個(gè)無(wú)性系木質(zhì)素含量變異情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)水曲柳×大葉白蠟組、水曲柳×小葉白蠟組、水曲柳×小葉白蠟組，母本自由授粉子代組內(nèi)各無(wú)性系間遺傳力（h）分別為0.863、0.955、0.917、0.961。

對(duì)各雜交組合無(wú)性系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中三個(gè)不同雜交組合中水曲柳木質(zhì)素含量最高的無(wú)性系分別為：水曲柳×大葉白蠟組Ⅱ-100-3（36.07±0.86）%，水曲柳×小葉白蠟Ⅱ-129-6（35.29±1.71）%，水曲柳×絨毛白蠟Ⅱ-7-10（39.79±7.15）%。母本自由授粉子代水曲柳中木質(zhì)素含量最高的為I-135-8（37.20±3.73）%。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果對(duì)其中前5%優(yōu)良生長(zhǎng)性狀無(wú)性系進(jìn)行篩選，結(jié)果為水曲柳×大葉白蠟組I-86-5 和Ⅱ-100-3 的木質(zhì)素遺傳增益分別為24.38%和27.69%；水曲柳×小葉白蠟Ⅱ-129-6的木質(zhì)素遺傳增益為31.67%；水曲柳×絨毛白蠟Ⅱ-7-10、I-48-4 和I-55-1 的木質(zhì)素遺傳增益分別為41.59%、34.64%和29.17%。

2.3 水曲柳基因組總DNA 的提取及FmPAL 基因的擴(kuò)增

分別對(duì)176 株不同無(wú)性系水曲柳總DNA 進(jìn)行提取，電泳有清晰DNA 條帶，且OD值約為1.8，樣品質(zhì)量較高，能夠滿足后續(xù)對(duì)基因的擴(kuò)增?；虻娜蛄泄灿? 893個(gè)堿基，其中編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 674 bp，設(shè)定擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 810 個(gè)堿基，其設(shè)計(jì)的引物序列范圍為13～34，1 799～1 823。對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)，其產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1 810 bp（見(jiàn)圖1）。

2.4 FmPAL基因中SNPs位點(diǎn)的篩選

利用BioEdit 軟件將基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，發(fā)生突變位點(diǎn)中，有一些位點(diǎn)的突變頻率極低（＜3%），為防止測(cè)量誤差造成的影響，這些位點(diǎn)不算作SNP 位點(diǎn)。篩選出的SNP 位點(diǎn)共有33個(gè)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果部分序列篩選SNP位點(diǎn)如圖2所示，其中C-T突變的位點(diǎn)有12個(gè)（90位，174位，306位，334 位，432 位，654 位，718 位，744 位，783 位，837 位，1 167 位，1 182 位）；A-C 突變位點(diǎn)1 個(gè)（604位）；G-A 突變位點(diǎn)12 個(gè)（204 位，348 位，435 位，603 位，623 位，657 位，796 位，829 位，1206 位，1 272 位，1 412 位，1 638 位）；T-G 突變位點(diǎn)2 個(gè)（753 位，1 165 位）；C-G 突變位點(diǎn)5 個(gè)（91 位，140位，387 位，828 位，1 421 位）；A-T 突變位點(diǎn)1 個(gè)（589 位）均出現(xiàn)在編碼區(qū)?；蛑袑偻x突變16 個(gè)，屬非同義突變17 個(gè)。進(jìn)行SNPs 位點(diǎn)篩選的基因總長(zhǎng)度為1 674 bp，故基因內(nèi)部SNP 位點(diǎn)出現(xiàn)的概率為1/51。

圖2 FmPAL基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Comparison of FmPAL gene sequences

2.5 核苷酸多態(tài)性分析

SNP 多態(tài)性指的是DNA 序列中單個(gè)堿基突變而引起的多種排列方式。這種突變的產(chǎn)生，主要由轉(zhuǎn)換（C-T、G-A）和顛換（C-A、C-G、G-T、A-T）引起，本研究篩選出的33個(gè)SNP位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)換突變位點(diǎn)24 個(gè)，顛換突變位點(diǎn)9 個(gè)。為了更深刻理解水曲柳群體的遺傳多樣性，利用DnaSP5.0 軟件對(duì)于比對(duì)序列的核苷酸多樣性（）進(jìn)行分析，值反應(yīng)了基因的相似性及多樣性，結(jié)果顯示所研究的基因中，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為93，經(jīng)篩選去除突變頻率極低（＜3%）位點(diǎn)后的有意義SNP 位點(diǎn)數(shù)為33 個(gè)，核苷酸多樣性值為0.007 45，單倍型數(shù)是131，單倍型多樣性值為0.999 7，核苷酸平均差異數(shù)：12.423。其中，單倍體多樣性反應(yīng)了群體總體的遺傳多樣性，越高則遺傳資源水平越豐富，抽取樣本時(shí)不同的概率越大。本研究中的水曲柳群體的基因單倍體多樣性值達(dá)到了0.999 7，屬高水平，證實(shí)了基因具有較高的變異，遺傳資源多樣。

2.6 不同無(wú)性系中FmPAL基因的遺傳距離

遺傳距離是用于衡量不同基因序列的綜合遺傳差異大小的指標(biāo)。分析基因的遺傳多樣性，對(duì)水曲柳不同無(wú)性系的基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后，利用MEGA 生物學(xué)分析軟件，計(jì)算不同無(wú)性系之間的遺傳距離。結(jié)果表明基因總體平均遺傳距離為0.010，各無(wú)性系間遺傳距離的分布范圍是0.000～0.030。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，無(wú)性系Ⅰ-33-3、Ⅱ-3-5-2 和Ⅰ-3-3-9 與其它大部分無(wú)性系的基因之間遺傳距離都大于0.020 cM，其中最大的遺傳距離達(dá)到0.030 cM（Ⅱ-3-5-2 與Ⅱ-91-3、Ⅰ-33-3 與Ⅱ-91-3、Ⅱ-3-5-2 與Ⅱ-66-8），其次的遺傳距離達(dá)到0.029 cM（Ⅱ-3-5-2與Ⅰ-28-1、Ⅱ-3-5-2與Ⅰ-105-2、Ⅰ-73-6 與Ⅰ-33-3、Ⅰ-73-6 與Ⅱ-3-5-2、Ⅰ-73-6 與Ⅰ-3-3-9、Ⅱ-66-8 與Ⅰ-33-3、Ⅱ-66-8 與Ⅱ-3-5-2、Ⅱ-66-8 與Ⅰ-3-3-9）。這說(shuō)明Ⅰ-33-3、Ⅱ-3-5-2 和Ⅰ-3-3-9 號(hào)無(wú)性系的變異程度高，遺傳差異最明顯。而遺傳距離最小的為0.000 cM，多對(duì)序列間的距離呈現(xiàn)最小值，包括Ⅱ-72-9 與Ⅱ-38-2、Ⅰ-44-8 與Ⅱ-72-2、Ⅱ-38-2 與Ⅱ-70-1。參考BioEdit 軟件的比對(duì)結(jié)果，這些遺傳距離小的無(wú)性系之間基因序列基本是一致的，而遺傳距離較大的兩個(gè)無(wú)性系之間，基因序列上的堿基差異較大，故遺傳距離的計(jì)算對(duì)于不同無(wú)性系基因變異及差異性的描述具有顯著意義，為表型數(shù)據(jù)的分析提供重要參考。

2.7 中性檢驗(yàn)及連鎖不平衡分析

通過(guò)對(duì)所研究的DNA 序列進(jìn)行基礎(chǔ)檢測(cè)分析，判定此物種群體的DNA 是否可以遵循中性進(jìn)化模式。我們利用DnaSP5.0 軟件對(duì)基因在進(jìn)化過(guò)程中的自然選擇的作用情況進(jìn)行中性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，基因的Tajimas D 值為-0.957 39，F(xiàn)u 和Li值為-1.563 74，均為負(fù)值，推測(cè)群體序列的進(jìn)化方式為負(fù)向選擇。關(guān)聯(lián)作圖，也稱為L(zhǎng)D 作圖或全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），是連鎖分析的一種映射選擇，應(yīng)用DnaSP 5.0 軟件中的LD 程序進(jìn)行對(duì)176 個(gè)不同水曲柳無(wú)性系基因連鎖不平衡進(jìn)行估算。由圖3 可見(jiàn)隨著基因中核苷酸序列長(zhǎng)度增加，基因無(wú)明顯衰退趨勢(shì)，其不平衡水平緩慢上升。值由0.1 緩慢上升至0.2。說(shuō)明基因中SNP 位點(diǎn)的連鎖不平衡水平無(wú)明顯衰退。

圖3 FmPAL基因的LD連鎖不平衡圖譜R2值是衡量?jī)蓚€(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡程度的重要指標(biāo)；R2表示兩個(gè)位點(diǎn)在等位基因中出現(xiàn)的頻率；當(dāng)R2=1，表示連鎖完全不平衡，沒(méi)有重組；當(dāng)R2=0，表示連鎖完全平衡，隨機(jī)組合Fig.3 LD linkage disequilibrium map of FmPAL geneR2 value is an important index to measure the degree of linkage dis‐equilibrium between two loci；R2 represents the frequency of the two loci appearing in the alleles；R2=1，indicates complete linkage disequi‐librium，no recombination；R2=0，indicates complete linkage balance，random combination

2.8 單個(gè)SNP關(guān)聯(lián)分析

結(jié)合水曲柳無(wú)性系的木質(zhì)素含量，對(duì)所有33個(gè)位于基因編碼區(qū)的單個(gè)SNP位點(diǎn)與木質(zhì)素含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。關(guān)聯(lián)分析中具有顯著差異的 位 點(diǎn) 分 別 是SNP140（G-C）、SNP796（G-A）、SNP654（T-C）。在SNP140 和SNP796 中突變型純合體木質(zhì)素含量顯著高于野生型純合體木質(zhì)素含量，但在SNP654 中突變型純合體木質(zhì)素含量顯著低于野生型純合體木質(zhì)素含量。SNP140的CC突變純合基因型水曲柳木質(zhì)素含量為（29.03±3.53）%，GG 野生純合型木質(zhì)素含量為（26.86±5.39）%，兩種基因型之間具有顯著差異（=0.044）；SNP654的野生純合TT 基因型水曲柳木質(zhì)素含量為（28.49±4.72）%，CC 突變純合型木質(zhì)素含量為（25.67±5.95）%，兩種基因型之間具有顯著差異（=0.003）；SNP796的GG野生純合基因型水曲柳木質(zhì)素含量為（26.91±5.47）%，AA 突變純合基因型木質(zhì)素含量為（29.03±4.74）%，兩種基因型之間差異顯著（=0.039）。其余30 個(gè)SNP 位點(diǎn)其突變純合基因型水曲柳木質(zhì)素含量與野生純合型基因木質(zhì)素含量?jī)煞N基因型之間差異不顯著，說(shuō)明這30 個(gè)SNP位點(diǎn)單一突變對(duì)木質(zhì)素含量影響不明顯。

3 討論

目前，水曲柳作為珍貴闊葉用材樹(shù)種，種質(zhì)資源選擇和雜交育種是其遺傳改良的重要手段。林木遺傳變異是選擇的前提，前期研究發(fā)現(xiàn)白蠟屬的各雜交組合水曲柳×大葉白蠟組、水曲柳×小葉白蠟和水曲柳×絨毛白蠟組與母本自由授粉子代對(duì)照組相比其樹(shù)高、胸徑均存在顯著差異。本研究也發(fā)現(xiàn)各雜交組合的木質(zhì)素含量與母本也存在顯著差異，表明生長(zhǎng)性狀和木材性狀存在豐富的變異基礎(chǔ)，這為優(yōu)良雜交種的選擇奠定了基礎(chǔ)。表型是在遺傳和環(huán)境的共同作用下形成的。李昌榮等研究9.5年生的大花序桉（）胸徑、樹(shù)高、單株材積、生材密度等，明確了大花序桉生長(zhǎng)性狀對(duì)材性性狀間接選擇效果不好，基本密度對(duì)其他材性性狀的間接選擇效果較好。多性狀綜合指數(shù)法可以選擇出部分生長(zhǎng)和材質(zhì)兼優(yōu)的家系。本研究通過(guò)對(duì)白蠟屬種間雜交組合無(wú)性系木質(zhì)素含量進(jìn)行研究，有利于篩選各雜交組合中優(yōu)于母本自由授粉子代的組合及無(wú)性系。通過(guò)分析木質(zhì)素含量水平的高低，有利于種間雜交子代的木材性狀評(píng)價(jià)及實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的深入研究。

1989 年日本學(xué)者Fumio Tajima 首次建立了中性檢測(cè)（Tajima Test），現(xiàn)在廣泛的應(yīng)用于關(guān)聯(lián)性檢測(cè)前的基礎(chǔ)檢驗(yàn)。通過(guò)對(duì)所研究的DNA序列進(jìn)行基礎(chǔ)檢測(cè)分析，判定此物種群體的DNA 是否可以遵循中性進(jìn)化模式。通過(guò)中性檢測(cè)推測(cè)群體序列的進(jìn)化方式為負(fù)向選擇。連鎖不平衡（LD）為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)映射已替代傳統(tǒng)的QTL 作圖，用于解析性狀的復(fù)雜性。這種新穎的方法易應(yīng)用于自然或育種種群，以檢查自然等位基因變異與感興趣的性狀之間的關(guān)聯(lián)，并提高標(biāo)記/性狀關(guān)聯(lián)的分辨率。LD 的估計(jì)值從一個(gè)染色體區(qū)域到另一個(gè)染色體區(qū)域變化，并且在周圍區(qū)域中更高。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)基因中SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡水平無(wú)明顯衰退。

SNP 由于其分子標(biāo)記在基因組內(nèi)數(shù)量豐富，在編碼區(qū)和非編碼區(qū)皆廣泛分布，已成為鑒定樹(shù)木品種身份的輔助方法之一。在油橄欖（）研究中，通過(guò)11 個(gè)核心SNP 位點(diǎn)對(duì)57 種油橄欖品種進(jìn)行區(qū)分。SNP 位點(diǎn)的篩選分析還有助于對(duì)植物表型相關(guān)基因的研究。例如在水稻（）氣孔性狀相關(guān)基因的研究中，分析EPF-TMM-SDD 途徑相關(guān)基因在粳稻（var.）和秈稻（subsp.）的SNP 位點(diǎn)的不同，為其性狀差異的機(jī)制解析奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)對(duì)176 個(gè)水曲柳無(wú)性系基因進(jìn)行測(cè)序，從總長(zhǎng)度為1 674 bp 的序列中篩選出共33個(gè)SNP位點(diǎn)，其基因內(nèi)部SNP位點(diǎn)出現(xiàn)的概率為1/51，包含同義突變18 個(gè)，非同義突變15個(gè)。本文明確了等位基因變異與水曲柳的木質(zhì)素含量密切相關(guān)。單倍型多樣性值為0.999 7，核苷酸平均差異數(shù)：12.423，說(shuō)明基因具有較高的變異，遺傳資源豐富多樣。關(guān)聯(lián)分析確定了與木質(zhì)素含量顯著相關(guān)的3個(gè)SNP，分別為SNP140、SNP654、SNP796，而其余SNP位點(diǎn)并沒(méi)有對(duì)木質(zhì)素含量產(chǎn)生明顯影響，其原因可能為這些單一的非同義突變位點(diǎn)可能與其它SNP 位點(diǎn)連鎖共同發(fā)揮作用，而單一的SNP位點(diǎn)分析不能揭示其與木質(zhì)素合成的關(guān)系，所以具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的分析。這些發(fā)現(xiàn)表明了參與木質(zhì)素合成，并提供了與木質(zhì)素性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，在標(biāo)記輔助育種中的有較好的應(yīng)用潛力。由于大多數(shù)SNP 所解釋的性狀變異百分比很小，因此可能需要將這些重要標(biāo)記組合在一起。通過(guò)結(jié)合水曲柳中高度保守的木質(zhì)部轉(zhuǎn)錄組來(lái)解析這種復(fù)雜的關(guān)系，這將有助于構(gòu)建次生生長(zhǎng)和木材形成的調(diào)控模型，并設(shè)計(jì)出改善木材產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的策略，包括縮短育種周期和增加早期選擇準(zhǔn)確性。