王 楨 楊柳燕 裴衛(wèi)忠 李 心 楊 貞 張永春*

（1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海 201499；2. 上海市藥材有限公司，上海 200003）

對(duì)高等植物來(lái)說(shuō)，開(kāi)花是從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)換的重要生活階段，與不同信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的排列組合緊密相關(guān)。研究表明在擬南芥（）中至少存在5 條不同的開(kāi)花調(diào)控途徑：光周期途徑、春化/溫度途徑、自主途徑、赤霉素途徑以及年齡途徑等。（）是三大開(kāi)花途徑整合子之一，可以整合來(lái)自光周期、春化/溫度等不同開(kāi)花途徑的信號(hào)，促進(jìn)植物開(kāi)花，在植物開(kāi)花過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。2007 年，在擬南芥和水稻（）中同時(shí)被證實(shí)，F(xiàn)T-like 蛋白作為“成花素”，主要在葉片中表達(dá)，通過(guò)篩管運(yùn)輸?shù)角o尖分生組織（SAM），與鋅指蛋白FD（FLOWERING LOCUS D）互作，促進(jìn)下游、、等花分生組織特征基因和花器官?zèng)Q定基因的表達(dá)，促進(jìn)成花轉(zhuǎn)換，啟動(dòng)花發(fā)育過(guò)程?；蛟诔苫ㄞD(zhuǎn)變過(guò)程中起重要作用，且同源基因的序列相似性很高，使得對(duì)基因的分離和功能研究發(fā)展很快，先后從葡萄（）、玉米（）、黃瓜（）、蘋果（）、土豆（）、楊樹（）、郁金香（）等多種植物中分離出同源基因，并進(jìn)行了一系列的生物學(xué)分析，逐漸揭示了不同物種同源基因在調(diào)控開(kāi)花時(shí)間及其它多方面的功能。

西紅花（L.）為鳶尾科（Iridaceae）番紅花屬（）多年生球根植物，又名藏紅花、番紅花。其紅色的干燥柱頭和花柱可入藥，是我國(guó)緊缺的名貴藥材之一。還廣泛應(yīng)用于食品香料、天然染料等行業(yè)，集多種用途于一身，被譽(yù)為“紅色金子”。上海崇明島作為我國(guó)最早開(kāi)始西紅花人工種植的地區(qū)之一，從上世紀(jì)70 年代末進(jìn)行引種栽培，形成了獨(dú)有的“兩段法”栽培模式，目前西紅花已經(jīng)成為上海市的道地中藥材之一。

筆者前期對(duì)西紅花田間栽培階段的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程和室內(nèi)儲(chǔ)藏階段的花芽分化、開(kāi)花過(guò)程進(jìn)行了觀測(cè)。自然條件下，西紅花的花期主要集中在10 月底至11 月上旬，單朵花期短，給花絲的采收帶來(lái)很大的人工壓力。研究發(fā)現(xiàn)溫度處理能顯著影響西紅花花芽分化的有無(wú)和花發(fā)育、開(kāi)花進(jìn)程，但是迄今為止，鮮見(jiàn)對(duì)西紅花成花誘導(dǎo)過(guò)程的分子機(jī)理進(jìn)行深入探索的文獻(xiàn)報(bào)道，分離到的開(kāi)花相關(guān)的基因也不多，主要集中在MADS-box基因家族等。Tsaftaris 等從西紅花中分離得到3 個(gè)同源基因，、和，但沒(méi)有進(jìn)一步進(jìn)行功能鑒定等。因此，為深入理解西紅花基因在西紅花開(kāi)花、休眠和球莖膨大等重要發(fā)育過(guò)程中的功能，本研究對(duì)Tsaftaris等克隆出的3 個(gè)西紅花基因通過(guò)qRT-PCR 分析其在不同組織中的表達(dá)情況，通過(guò)轉(zhuǎn)化煙草（）和擬南芥及其突變體進(jìn)行功能驗(yàn)證，期望為探索西紅花基因的功能和基因資源的開(kāi)發(fā)利用等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

2018 年11 月至2019 年11 月將西紅花種球種植于崇明華宇西紅花種植專業(yè)合作社基地。期間，11 月至5 月為大田繁育球莖階段，5 月至11 月為室內(nèi)儲(chǔ)藏球莖階段。

煙草栽培種‘NC89’種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱，生長(zhǎng)條件為24 ℃，16 h/22 ℃，8 h，用于遺傳轉(zhuǎn)化和對(duì)照。

擬南芥Col 和突變體-（Ler 生態(tài)型）用于遺傳轉(zhuǎn)化和對(duì)照，Ler 生態(tài)型用于對(duì)照，均種植于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱，生長(zhǎng)條件為24 ℃，16 h/22 ℃，8 h，用于遺傳轉(zhuǎn)化或?qū)φ铡Ｆ渲?，突變體-（Ler 生態(tài)型）購(gòu)買自擬南芥生物資源中心（Bio‐logical Resource Center，USA），編號(hào)CS56。

1.1.2 各種酶及生化試劑

各種限制性內(nèi)切酶、T4-ligase 連接酶等購(gòu)自Thermo 公司。DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen 公司。植物RNA 提取試劑盒RNeasy PowerPlant Kit 購(gòu)自Qiagen 公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒Evo M-MLV、SYBR Green Pro Tag HS預(yù)混型qPCR試劑盒等購(gòu)自艾科瑞生物公司。

1.1.3 菌株及載體

pMD18-T 載體購(gòu)于TaKaRa 公司。大腸桿菌菌株DH5α 感受態(tài)，農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105、GV3101 均購(gòu)買自上海唯地生物科技有限公司。超量表達(dá)載體pMOG22為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 西紅花基因組DNA提取

稱取0.1 g鮮葉片，于液氮中研磨成粉末，根據(jù)CTAB法提取西紅花基因組DNA。

1.2.2 西紅花總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

稱取0.1 g 鮮葉片和花芽，于液氮中研磨成粉末，根據(jù)RNeasy PowerPlant Kit 植物總RNA提取試劑盒的操作步驟，提取總RNA。采用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.3 西紅花基因組DNA 和cDNA 全長(zhǎng)擴(kuò)增

根據(jù)Tsaftaris文中提供的西紅花3 個(gè)基因的引物序列，以基因組DNA（gDNA）和cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。通過(guò)測(cè)序得到基因序列后，自行設(shè)計(jì)特異性正向和反向引物，用于超量表達(dá)載體構(gòu)建。引物序列如表1，下劃線表示酶切位點(diǎn)，用于構(gòu)建超量表達(dá)載體的3對(duì)引物兩端分別加有酶切位點(diǎn)RⅠ/HⅠ，Ⅰ/RⅠ，RⅠ/Ⅰ；用于構(gòu)建亞定位載體的3 對(duì)引物兩段均加有酶切位點(diǎn)Ⅰ/Ⅰ。試驗(yàn)所用引物及測(cè)序均由上海生工生物技術(shù)有限公司提供服務(wù)。

表1 擴(kuò)增西紅花FT基因全長(zhǎng)的特異引物Table 1 Gene specific primers used to isolate complete FT coding sequences of saffron

1.2.4 西紅花表達(dá)分析

采集不同生長(zhǎng)階段的球莖、葉片、花等為材料，根據(jù)RNeasy PowerPlant Kit 總RNA提取試劑盒的操作步驟，提取總RNA，進(jìn)行基因的定量表達(dá)分析。詳細(xì)取樣部位為，大田繁育階段：1 月份子球莖、葉片、主根、側(cè)根，4 月份子球莖、頂芽；室內(nèi)儲(chǔ)藏階段：9 月份葉片、花瓣、花藥、柱頭。以西紅花作為內(nèi)參基因，檢測(cè)-在上述樣品中的表達(dá)水平（引物見(jiàn)表2）。使用Roche LightCy‐cle480 System 熒光定量PCR 儀。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。數(shù)據(jù)采用2法方法進(jìn)行處理。

表2 qRT-PCR分析特異引物Table 2 Gene specific primers used for qRT-PCR analysis

1.2.5 西紅花序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析

序列分析和多序列比對(duì)使用ClustalW 軟件，基因序列作圖使用GeneDoc 軟件。系統(tǒng)進(jìn)化分析使用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法（Neighbor Join‐ing，NJ），使用1 000個(gè)重復(fù)進(jìn)行Bootstrap檢驗(yàn)。為了分析西紅花基因與其他被子植物同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，我們從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了已報(bào)道的功能確定（花期控制方面）的同源基因共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 西紅花超量表達(dá)載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

擴(kuò)增出的cDNA 特異片段通過(guò)DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，連接pMD18-T 載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽(yáng)性克隆搖菌，提質(zhì)粒，再通過(guò)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，酶切，回收，連接超量表達(dá)載體pMOG22。構(gòu)建的超量表達(dá)載體分別命名為35S：：，35S：：，35S：：.

將35S：：，35S：：，35S：：超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105 感受態(tài)細(xì)胞，采用葉盤轉(zhuǎn)化法異源轉(zhuǎn)化煙草‘NC89’。

將35S：：，35S：：，35S：：超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，采用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥（）Col生態(tài)型和突變體-（Ler生態(tài)型）。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)及表型觀測(cè)

采集待檢測(cè)的煙草和擬南芥植株的葉片，采用Trizol 法提取RNA 進(jìn)行PCR 分子鑒定。分別以煙 草和 擬 南 芥作 為 內(nèi) 參 基 因（見(jiàn)表3）。

表3 RT-PCR分析特異引物Table 3 Gene specific primers used for RT-PCR analysis

選取至少20株T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行表型觀測(cè)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，包括3個(gè)指標(biāo)—開(kāi)花時(shí)主莖的葉片數(shù)量，初花時(shí)植株高度和從移栽到開(kāi)花的時(shí)間。

選取至少20 株T1 代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行表型觀測(cè)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，包括3個(gè)指標(biāo)—抽薹時(shí)蓮座葉葉片數(shù)量，抽薹時(shí)莖生葉葉片數(shù)量和從播種到開(kāi)花的時(shí)間。

運(yùn)用SAS 進(jìn)行方差分析（one-way ANOVA）和顯著性分析（Duncan’s multiple range test）。

2 結(jié)果與分析

2.1 西紅花CsatFT 全長(zhǎng)gDNA 和cDNA 的克隆及系統(tǒng)進(jìn)化分析

以西紅花葉片gDNA 和葉片、花芽cDNA 為模板，采用特異引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別得到了3 個(gè)西紅花基因gDNA 和cDNA 的全長(zhǎng)序列。如圖1 所示，擴(kuò)增出的3 個(gè)西紅花基因gDNA 包含長(zhǎng)度分別為835、1 642 和1 132 bp 的完整開(kāi)放閱讀框（ORF），和其它絕大部分物種中同源基因的結(jié)構(gòu)一致，包含4 個(gè)外顯子（exon）和3個(gè)內(nèi)含子（intron），并且它們第二個(gè)和第三個(gè)外顯子的長(zhǎng)度一致，分別是62 和41 bp（見(jiàn)圖1：A）。擴(kuò)增出的3 個(gè)西紅花基因cDNA 包含長(zhǎng)度分別為528、525 和540 bp 的ORF，分別編碼175、174 和179個(gè)氨基酸。

用Clustal W 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)分離出的3 個(gè)CsatFT 的序列相似性達(dá)到79.44%，與模式植物擬南芥AtFT 氨基酸序列的相似性也達(dá)到69.66%、72.57%和71.51%。并且它們都含有保守的氨基酸位點(diǎn)，即FT 中的Tyr85 和Gln140 氨基酸殘基（見(jiàn)圖1：B）。

同時(shí)，為了分析克隆出的西紅花基因與其他被子植物同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，我們從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了已報(bào)道的功能確定（花期控制方面）的同源基因，利用MEGA 5.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。如圖1C 所示，CsatFT1、CsatFT2、CsatFT3 分別和同為單子葉植物的水仙（）、麝香百合（）LlFT 和洋蔥（）AcFT1表現(xiàn)出較近的遺傳距離。同時(shí)，這3個(gè)同源基因都具有促進(jìn)開(kāi)花的早花功能。

圖1 西紅花CsatFT基因的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析A.FT同源基因結(jié)構(gòu)；方框和橫線分別表示外顯子和內(nèi)含子，數(shù)字表示各自的長(zhǎng)度（bp）；B.FT同源基因預(yù)測(cè)氨基酸序列比對(duì)；星號(hào)表示保守的氨基酸位點(diǎn)，三角表示擬南芥FT基因外顯子和內(nèi)含子的邊界，第四個(gè)外顯子被分為ABCD四部分［25］；C.不同物種FT同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析，灰色方框表示3個(gè)西紅花FT基因，CsatFT1，CsatFT2和CsatFT3Fig.1 Gene structures and alignment of amino acid sequences and phylogenetic analysis of CsatFT homologs of saffronA.Gene structures of FT；Boxes indicate exons and lines indicate introns，the numbers represent their corresponding lengths（bp）；B.Alignment of amino acid sequences of FT homologs；Boxes and asterisks represent the conserved residues；Triangles show the exon boundaries of FT of Arabidop‐sis.The four segments of the fourth exon are shown as A，B，C and D［25］；C.Phylogenetic analysis of the FT homologs from different plant species.Grey boxes represent three FT genes of saffron，CsatFT1，CsatFT2 and CsatFT3

2.2 CsatFT的表達(dá)模式分析

如圖2 所示，1 月份，子球莖膨大至直徑約1 cm，、、在葉片中表達(dá)水平最高，側(cè)根中次之，子球莖、主根中極低幾乎檢測(cè)不到；4月份，子球莖膨大至直徑約3 cm，葉片上部開(kāi)始枯萎，此時(shí)剝開(kāi)外層的膜質(zhì)結(jié)構(gòu)可見(jiàn)明顯的頂芽，頂芽處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，、、都在子球莖中表達(dá)水平高，頂芽中極低幾乎檢測(cè)不到；在室內(nèi)儲(chǔ)藏開(kāi)花階段（5～11月），9 月份，頂芽已經(jīng)萌發(fā)，剝開(kāi)低出葉可見(jiàn)明顯的葉片和花器官，、、在柱頭中表達(dá)水平最高，葉中次之，花瓣和花藥中較低，其中和在花藥中幾乎檢測(cè)不到。

圖2 西紅花CsatFT的qRT-PCR表達(dá)分析A.西紅花不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和采樣部位；B.CsatFT1、CsatFT2、CsatFT3在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 qRT-PCR analysis of FT expression in saffronA.The different development phases and the tissues used of saffron；B.Relative expression levels of CsatFT1，CsatFT2 and CsatFT3 in different tissues

2.3 異源轉(zhuǎn)化CsatFT基因煙草的表型分析

如表4 所示，、和轉(zhuǎn)基因煙草植株開(kāi)花時(shí)間都顯著提前。T0代植株移栽60 d 后，幾乎所有轉(zhuǎn)基因植株均已開(kāi)花，而野生型煙草還未顯蕾（見(jiàn)圖3：A）。35S：：、35S：：和35S：：轉(zhuǎn)基因植株的開(kāi)花時(shí)間分別為（59.90±3.21）、（61.80±3.79）和（59.50±2.37）d，都顯著低于野生型所需要的開(kāi)花時(shí)間（68.10±1.86）d。但是，35S：：、35S：：和35S：：轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花時(shí)主莖上的葉片數(shù)量與野生型相比沒(méi)有顯著性差異；35S：：轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花時(shí)植株高度為（28.90±2.85）cm，與野生型（29.10±1.86）cm 相比沒(méi)有顯著性差異，35S：：、35S：：轉(zhuǎn)基因植株高度顯著高于野生型。

圖3 西紅花3個(gè)FT基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株表型A.從左到右分別是35S：：CsatFT1-3，野生型，生長(zhǎng)60 d后；B.轉(zhuǎn)基因煙草植株的RT-PCR檢測(cè)Fig.3 Phenotypic analysis of transgenic tobacco plants harboring three FT homologs of saffronA.FT homologs of saffron from left to right，35S：：CsatFT1-3，wild-type，respectively，after growth for 60 d；B.RT-PCR analysis to confirm the trans‐genic lines

表4 西紅花FT基因的T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株表型統(tǒng)計(jì)Table 4 Flowering phenotypes of representative T0 transgenic tobacco lines harboring FT homologs of saffron

2.4 異源轉(zhuǎn)化CsatFT基因擬南芥的表型分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CsatFT1-3 的功能，我們又進(jìn)行了擬南芥轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)試驗(yàn)。如圖4A 所示，異源轉(zhuǎn)化擬南芥Col的表型觀測(cè)表明，在相同條件生長(zhǎng)30 d 后，、和轉(zhuǎn)基因擬南芥均已抽薹開(kāi)花，如圖4C～D 所示，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系#2 抽薹時(shí)葉片數(shù)量為（11.10±0.74）個(gè)，從播種到開(kāi)花所需的時(shí)間為（30.70±1.16）d，均顯著少于野生型Col 植株（14.30±0.82）和（34.20±1.14）d。如圖4E 所示，異源轉(zhuǎn)化擬南芥-（Ler 生態(tài)型）的表型觀測(cè)表明，、和轉(zhuǎn)化-突變體植株的開(kāi)花期均早于-突變體，轉(zhuǎn)基因株系的葉片數(shù)量和從播種到開(kāi)花時(shí)間都顯著低于-突變體，但顯著高于Ler 生態(tài)型擬南芥（見(jiàn)圖4：G～H）。綜上，轉(zhuǎn)基因擬南芥和功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，與超量表達(dá)煙草的表型一致，即均表現(xiàn)出早花的表型，進(jìn)一步說(shuō)明西紅花的3個(gè)基因都具有促進(jìn)開(kāi)花的功能。

圖4 西紅花CsatFT異源轉(zhuǎn)化擬南芥Col和ft-1突變體表型A.從左到右分別是30 d大的35S：：CsatFT1，35S：：CsatFT2，35S：：CsatFT3，Col擬南芥植株；B.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的RT-PCR檢測(cè)；C.長(zhǎng)日照條件下，擬南芥抽苔時(shí)的葉片數(shù)；D.長(zhǎng)日照條件下，擬南芥從播種到抽苔的天數(shù)；E.西紅花FT 異源轉(zhuǎn)化擬南芥ft-1 突變體植株表型；F.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的RT-PCR 檢測(cè)；G.長(zhǎng)日照條件下，擬南芥抽苔時(shí)的葉片數(shù)；H.長(zhǎng)日照條件下，擬南芥從播種到抽苔的天數(shù)；CL.莖生葉；RL.蓮座葉；相同的小寫字母表示在P=0.05沒(méi)有顯著差異Fig.4 Phenotypic analysis of ectopically expressing CsatFT homologs of saffron in the Col and ft-1 mutantsA. 30-day-old 35S：：CsatFT1，35S：：CsatFT2，35S：：CsatFT3，Col Arabidopsis；B. RT-PCR analysis to conform the transgenic lines；C. Leaf num‐ber of wild-type Col and transgenic Arabidopsis plants under LD（16 h-light/8 h-dark）conditions；D.Time from seed to bolting of wild-type Col and transgenic Arabidopsis plants under LD（16 h-light/8 h-dark）conditions；E. Phenotype of ectopically expressing FT homologs of saffron in ft-1 mu‐tant；F. RT-PCR analysis to conform the transgenic lines；G. Leaf number of wild-type Ler，ft-1 and transgenic Arabidopsis plants under LD（16 hlight/8 h-dark）conditions；H.Time from seed to bolting of wild-type Ler，ft-1 and transgenic Arabidopsis plants under LD（16 h-light/8 h-dark）con‐ditions；CL.Cauline leaves；RL.Rosette leaves；The common letters within the same figures are not significantly different at P=0.05

3 討論

對(duì)高等植物來(lái)說(shuō)，開(kāi)花對(duì)生殖成功和繁衍至關(guān)重要，及其同源基因位于多條開(kāi)花途徑的交匯點(diǎn)上，在植物開(kāi)花過(guò)程中發(fā)揮著重要作用而受到研究者的關(guān)注，已經(jīng)從大量物種中克隆獲得了同源基因，并且通過(guò)異源或本物種轉(zhuǎn)基因等分子遺傳手段對(duì)其調(diào)控開(kāi)花時(shí)間的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，大量結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)可以縮短童期或營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間，促進(jìn)并加速成花。同時(shí)，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)也存在其它的潛在功能，例如，在長(zhǎng)光周期條件下，控制側(cè)枝的發(fā)育；響應(yīng)藍(lán)光的情況下，可以通過(guò)激活保衛(wèi)細(xì)胞中的H-ATP 合酶，調(diào)控氣孔張開(kāi)；土豆同源基因作為移動(dòng)的“塊莖形成素”，誘導(dǎo)對(duì)光周期敏感的塊莖形成過(guò)程；洋蔥同源基因和在鱗莖形成中發(fā)揮功能。同時(shí)，也逐漸進(jìn)化出抑制開(kāi)花的功能，甜菜（）中的2個(gè)基因參與了對(duì)冬天長(zhǎng)時(shí)間低溫和春化相關(guān)的開(kāi)花響應(yīng)，BvFT2 促進(jìn)開(kāi)花，而BvFT1 抑制開(kāi)花，并且BvFT1 的下調(diào)表達(dá)對(duì)甜菜對(duì)春化作用的響應(yīng)至關(guān)重要。在煙草中也發(fā)現(xiàn)了4個(gè)旁系同源基因，NtFT1-3 抑制開(kāi)花，NtFT4 促進(jìn)開(kāi)花。同樣地，在龍眼（）、楊樹（）等物種中都報(bào)道了旁系同源基因自然分化出拮抗功能的例子，同時(shí)功能的改變是由于關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變異導(dǎo)致的，并且這些位點(diǎn)在不同物種之間是保守的。

本研究中涉及的西紅花3 個(gè)同源基因，、和，均具有4個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子，將其編碼的氨基酸序列與擬南芥At‐FT 進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)彼此之間都有較高的序列相似性，說(shuō)明不同物種間基因序列是非常保守的。與同家族基因，兩者高度同源卻功能相反，F(xiàn)T 促進(jìn)開(kāi)花，TFL1 抑制開(kāi)花。研究表明，擬南芥AtFT 和AtTFL1 單個(gè)氨基酸的改變，或者一段氨基酸的改變，能使兩者的功能互換。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)CsatFT1、CsatFT2、CsatFT3 均具有行使FT 早花功能關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)Y85、Q140 和第四個(gè)外顯子中關(guān)鍵的B 段和C 段，同時(shí)，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示CsatFT1、CsatFT2、CsatFT3分別和同為單子葉植物的水仙NtFT、麝香百合LlFT和洋蔥AcFT1表現(xiàn)出較近的遺傳距離，這3 個(gè)同源基因都被報(bào)道具有促進(jìn)開(kāi)花的功能，說(shuō)明本研究克隆的為同源基因且具有促進(jìn)開(kāi)花的功能。

普遍認(rèn)為，基因的表達(dá)模式與其功能密切相關(guān)。擬南芥主要在葉片篩管中表達(dá)，經(jīng)韌皮部運(yùn)輸至SAM，其在韌皮部和莖中過(guò)量表達(dá)，可促進(jìn)提早開(kāi)花；蘋果主要在成年期的花果枝的頂芽中表達(dá)，在幼年期的組織中幾乎無(wú)表達(dá)，而主要在花芽、花器官、花梗、幼果等生殖器官中表達(dá)，和異源轉(zhuǎn)化擬南芥均能促進(jìn)提早開(kāi)花，過(guò)表達(dá)能使轉(zhuǎn)基因蘋果植株縮短營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，提早開(kāi)花。qRT-PCR 的結(jié)果表明，小球莖膨大階段前期，、、在葉片中表達(dá)水平最高，側(cè)根中次之，子球莖、主根中極低（幾乎檢測(cè)不到）；小球莖膨大階段后期，、、都在子球莖中表達(dá)水平高，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)的頂芽中幾乎檢測(cè)不到。室內(nèi)儲(chǔ)藏開(kāi)花階段，、、在柱頭中表達(dá)水平最高，葉中次之，花瓣和花藥中較低（幾乎檢測(cè)不到）。這與Tsaftar‐is 等通過(guò)RT-PCR 半定量檢測(cè)方法，得到的西紅花3 個(gè)基因表達(dá)水平的結(jié)果部分一致，文中結(jié)果表明，和在10 月份和3 月份的葉片和球莖中有表達(dá)，但是沒(méi)有檢測(cè)到的表達(dá)，只在地下的未成熟的花中有表達(dá)，葉片和球莖中均沒(méi)有。而我們的試驗(yàn)結(jié)果在1 月份的葉片和球莖中也檢測(cè)到了的表達(dá)，雖然其相對(duì)表達(dá)量較和的低?？赡苁怯捎诓蓸訒r(shí)間和國(guó)內(nèi)外栽培模式存在差異，且檢測(cè)方法不同，后續(xù)需要進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

超量表達(dá)、、的轉(zhuǎn)基因煙草植株，均表現(xiàn)出提早開(kāi)花的表型，和野生型煙草相比，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段縮短。同時(shí)，擬南芥轉(zhuǎn)基因和突變體互補(bǔ)試驗(yàn)，進(jìn)一步證明了、、在促進(jìn)成花轉(zhuǎn)變中的早花功能。因此，說(shuō)明3 個(gè)西紅花同源基因在花期控制方面的功能和擬南芥等模式植物中報(bào)道的功能是保守的，均具有促進(jìn)開(kāi)花的功能。

西紅花為同源三倍體，其栽培歷史超過(guò)3 000年，一直進(jìn)行無(wú)性繁殖。從進(jìn)化角度來(lái)看，基因是在自然進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化出抑制開(kāi)花的功能，同時(shí)在很多物種中，F(xiàn)T抑制子和FT誘導(dǎo)子在功能上具有拮抗作用。本研究中涉及的3個(gè)西紅花同源基因的基因結(jié)構(gòu)一樣，序列相似性很高，行使關(guān)鍵功能的氨基酸位點(diǎn)和片段亦沒(méi)有出現(xiàn)氨基酸的差異，異源轉(zhuǎn)化的功能驗(yàn)證也呈現(xiàn)出相同的促進(jìn)開(kāi)花的功能，間接說(shuō)明其功能和進(jìn)化較保守。西紅花3個(gè)同源基因在西紅花球莖膨大過(guò)程中的子球莖中都有表達(dá)，而在儲(chǔ)藏期間的球莖中幾乎沒(méi)有表達(dá)，因此，西紅花3個(gè)同源基因是否和土豆、洋蔥中同源基因一樣，可能在球莖膨大過(guò)程中具有功能，也值得進(jìn)一步的研究。