邢鵬，袁博，王娜，李澎濤，孟娜娜

顆粒細(xì)胞作為卵泡的基本組成單位，在調(diào)控卵泡生長(zhǎng)[1]、排卵和誘導(dǎo)竇卵泡凋亡[2]中起著關(guān)鍵性作用。由于顆粒細(xì)胞代謝旺盛致代謝產(chǎn)物的堆積，以及不良生活方式，如熬夜、飲酒等，都會(huì)導(dǎo)致氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡，形成氧化應(yīng)激損傷[3]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，從結(jié)構(gòu)和功能上改變蛋白質(zhì)和DNA功能，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激與女性生殖系統(tǒng)多種疾病有關(guān)，如多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)[4]、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT)[5]和原發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)[6]等。由于人卵巢原代顆粒細(xì)胞獲取方法困難、培養(yǎng)條件苛刻及傳代培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，較難構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞模型。既往，有學(xué)者通過(guò)不同濃度過(guò)氧化氫(H2O2)處理人卵巢顆粒腫瘤細(xì)胞(COV434)建立了氧化應(yīng)激模型[7]，但是由于腫瘤細(xì)胞固有的特性，其實(shí)驗(yàn)結(jié)論并不能完全反映生理細(xì)胞的特性。因此，構(gòu)建穩(wěn)定的原代黃素化卵泡顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，是進(jìn)一步開(kāi)展卵巢氧化應(yīng)激研究及篩選抗氧化藥物所需要的[8-9]。本研究通過(guò)H2O2誘導(dǎo)，探討是否可以建立穩(wěn)定的人原代黃素化卵泡顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

3% H2O2于美國(guó)Sigma，DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco，紅細(xì)胞裂解液、Percoll細(xì)胞分離液、碘化丙啶試劑盒均購(gòu)自北京Solarbio，CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁，丙二醛、總超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，雌二醇(estradiol，E2) ELISA試劑盒購(gòu)自武漢Elabscience。

1.2 顆粒細(xì)胞收集

收集2019年10月至12月于保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，行體外受精-胚胎移植患者取卵后廢棄的卵泡液。本研究獲得保定市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與研究的患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 選擇年齡<35歲的輸卵管性不孕或男方精子因素不孕患者，同時(shí)排除：① 卵巢低反應(yīng)[10]；② PCOS；③ EMT；④ 各種類型的卵巢腫物[11]的患者。

1.2.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將收集到的卵泡液置入50 mL離心管，400 g離心10 min棄上清，沉淀用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)重懸，緩慢加入50% Percoll單層密度梯度離心液上層，400 g離心25 min。離心后，液體共分四層，從下到上依次為：紅細(xì)胞層，透明Percoll液層、白色絮狀顆粒細(xì)胞層、淡黃色上清液層。收集顆粒細(xì)胞層，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，沉淀用PBS重懸，加入等體積0.25%胰蛋白酶+EDTA，37℃消化10 min。400 g離心5 min，棄去上清，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)液[含15%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)]、1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，置入37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱(以下簡(jiǎn)稱培養(yǎng)箱)中上層。培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況[12]。培養(yǎng)5～6天細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上，開(kāi)始建立氧化應(yīng)激損傷模型，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 顆粒細(xì)胞氧化損傷模型的建立

1.3.1 采用最大半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)來(lái)建立顆粒細(xì)胞氧化損傷模型。

1.3.2 取1.2.2培養(yǎng)后的顆粒細(xì)胞，經(jīng)消化、計(jì)數(shù)后，以105/mL的濃度，每孔100 μL，均勻接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入用無(wú)血清培養(yǎng)液倍數(shù)稀釋的H2O2(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L、320 μmol/L)100 μL，以無(wú)血清培養(yǎng)液為陰性對(duì)照組，以PBS為空白組。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入新培養(yǎng)液100 μL和CCK-8 10 μL， 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在波長(zhǎng)為450 nm酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度(Optical Density,OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 利用GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算IC50。

1.4 顆粒細(xì)胞氧化損傷模型的驗(yàn)證

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 以IC50濃度的H2O2處理匯合后的顆粒細(xì)胞12 h，作為模型組；以未加H2O2的顆粒細(xì)胞，作為對(duì)照組。

1.4.2 采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和WST-1法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平 收集實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎，漩渦混勻。按照BCA(bicinchoninic acid)蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞勻漿液中蛋白濃度。按MDA和SOD試劑盒操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀分別在532 nm處測(cè)定ODMDA值和450 nm處測(cè)定ODSOD值，并計(jì)算MDA含量和SOD水平。

1.4.3 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定E2分泌量 分組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，更換新鮮的含濃度為12 ng/mL的r-FSH(Gonal-F)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。1 500 g離心10 min，取上清液。按E2試劑盒操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定ODE2值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)液中E2的濃度。

1.4.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 收集兩組顆粒細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后收集單個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌。75%酒精4℃固定4 h，500 g離心10 min，去上清。預(yù)冷PBS洗滌后，每管加入400 μL PI(50 μg/mL)，100 μL RNase(100 μg/mL)輕柔旋渦混均后，4℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，利用ModFit LT 3.1軟件分析細(xì)胞周期分布。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生存曲線

隨著H2O2濃度的增加，人卵泡顆粒細(xì)胞的存活率呈對(duì)數(shù)下降。根據(jù)不同濃度H2O2與顆粒細(xì)胞的存活率，繪制細(xì)胞生存曲線(見(jiàn)下頁(yè)圖1)。所得IC50值為65.72 μmol/L，95%CI(60.98-70.84)。使用IC50濃度H2O2=65 μmol/L，建立顆粒細(xì)胞氧化損傷模型。

圖1 細(xì)胞生存曲線

2.2 兩組顆粒細(xì)胞形態(tài)的光鏡觀察結(jié)果

圖2A所示為模型組，可見(jiàn)卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核核仁不明顯，細(xì)胞的體積變形等早期凋亡形態(tài)，及凋亡小體和細(xì)胞膜發(fā)泡現(xiàn)象等凋亡晚期的形態(tài)。圖2B所示為對(duì)照組，可見(jiàn)卵泡顆粒細(xì)胞呈多突狀生長(zhǎng)，細(xì)胞間有偽足相連，細(xì)胞核圓形、較大，核仁明顯，胞漿內(nèi)可見(jiàn)豐富的顆粒。

圖2 光鏡下兩組顆粒細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)(20 μm)

2.3 兩組顆粒細(xì)胞MDA含量、SOD水平及E2分泌量比較

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞MDA含量升高，SOD水平降低，E2分泌量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 兩組顆粒細(xì)胞存活率、MDA含量及SOD水平的比較

2.4 兩組顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期的比較

與對(duì)照組相比，模型組的凋亡峰(sub G1)明顯增高[模型組vs對(duì)照組：(30.48±4.19) vs (7.14±3.84)，t=12.321，P<0.001]，而G1期[模型組vs對(duì)照組：(35.99±3.45) vs (47.06±6.09)，t=4.742，P<0.001]和G2期[模型組vs對(duì)照組：(9.12±3.95) vs (17.81±4.82)，t=4.178，P=0.001]細(xì)胞數(shù)量均明顯降低，S期兩組細(xì)胞數(shù)量無(wú)差異[模型組vs對(duì)照組：(24.40±4.01) vs (27.99±3.62)，t=1.996，P=0.063]，見(jiàn)圖3。

圖3 兩組顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期

3 討論

原代顆粒細(xì)胞來(lái)源于接受體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)治療的患者，這些細(xì)胞在超生理劑量的促卵泡生成素(follicle stimulating hormone,FSH)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)的刺激下，通常在獲得時(shí)已經(jīng)黃素化，它們?cè)隗w外的壽命有限，且新鮮制備的細(xì)胞缺乏對(duì)hCG一致性的反應(yīng)，在短期培養(yǎng)細(xì)胞中亦對(duì)FSH缺乏反應(yīng)性，因此，利用人類顆粒細(xì)胞的原代培養(yǎng)物進(jìn)行研究比較困難[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞能夠重建對(duì)FSH刺激的反應(yīng)性，在FSH和hCG共同處理下，E2和孕酮的分泌量明顯增加[14]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)多輪嘗試與摸索，并查閱大量其他人的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)觀察細(xì)胞的融合生長(zhǎng)狀態(tài)和測(cè)定細(xì)胞的孕酮分泌功能的恢復(fù)情況，我們通過(guò)增加鋪板密度和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至6天左右，這樣既能保證顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)匯合，又能使經(jīng)過(guò)過(guò)度刺激的黃素化-顆粒細(xì)胞恢復(fù)內(nèi)分泌功能。

H2O2屬?gòu)?qiáng)氧化劑，一定濃度下可對(duì)細(xì)胞造成氧化應(yīng)激和氧化損傷，已經(jīng)有多種H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激模型建立成功[15-16]。本研究通過(guò)給予不同濃度H2O2作用顆粒細(xì)胞12 h后，計(jì)算IC50濃度建立顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。活性氧攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為高活性的醛基化合物MDA[17]。SOD是一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和H2O2，體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶將其分解為水，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。膜損傷的最終結(jié)果將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死，進(jìn)而導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的分泌功能受損[18]。

本研究結(jié)果顯示，H2O2作用12 h后，MDA含量上升、SOD水平下降，說(shuō)明顆粒細(xì)胞氧化損傷程度增高，而細(xì)胞修復(fù)損傷的能力下降。經(jīng)過(guò)FSH刺激后，卵泡顆粒細(xì)胞分泌E2的量明顯較對(duì)照組下降，說(shuō)明細(xì)胞的內(nèi)分泌功能受損。細(xì)胞周期分析顯示：凋亡的sub G1峰升高，而G1/G0期和G2/M期均下降，說(shuō)明隨著細(xì)胞凋亡峰的增高，DNA發(fā)生損傷，細(xì)胞周期將不能通過(guò)DNA損傷監(jiān)測(cè)點(diǎn)[19]，從而不能進(jìn)入下一分裂時(shí)相，因此G1期、G2期均被延遲。以上指標(biāo)表明H2O2誘導(dǎo)的人黃素化卵泡顆粒細(xì)胞的應(yīng)激損傷模型建模成功，這與其他學(xué)者的研究基本一致[20-21]。

綜上所述，65 μmol/L H2O2處理人卵泡顆粒細(xì)胞12 h，細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷水平升高，內(nèi)分泌功能下降，細(xì)胞凋亡增加而分裂減少。因此，建立了穩(wěn)定的顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，為進(jìn)一步開(kāi)展顆粒細(xì)胞抗氧化研究提供了細(xì)胞模型。