何澤賀，陳笑迎，郭明珠，劉建朝，孫紀(jì)錄，吳小禾

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.唐山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河北 唐山 063000；3.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康產(chǎn)業(yè)學(xué)院，廣東 中山 528436）

生物活性肽一般是包含3個～20個氨基酸的蛋白質(zhì)片段[1]。通常，生物活性肽存在于母體蛋白結(jié)構(gòu)中，少部分是自然的游離生物活性肽[2]。天然生物活性肽廣泛存在于植物、動物和微生物中，如小麥[3]、綠豆[4]、綠茶[5]、雞蛋[6]、羊肉[7]、鮭魚[8]和藍(lán)藻[9]等。生物活性肽對人類健康具有積極作用。食源性生物活性肽可分為抗癌肽、抗氧化肽、抗糖尿病肽、抗高血壓肽、抗菌肽、降膽固醇肽和多功能肽[10]等。

魚蛋白是生物活性肽的潛在來源。近年來，使用傳統(tǒng)方法，從不同水生物種的蛋白質(zhì)水解物中提取了生物活性肽[11]。通過酶水解[12]、化學(xué)合成[13]或微生物發(fā)酵[14]，也都可以產(chǎn)生生物活性肽。在傳統(tǒng)生產(chǎn)過程中，通常使用超濾、凝膠層析[15]、反相超快速液相色譜（reverse phase-ultra fast liquid chromatography，RP-UFLC）、反相高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）以及超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance lipid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）等分離和純化方法[16]。這些生產(chǎn)、分離、純化和表征方案既耗時又耗溶劑，因此，越來越多的研究開始應(yīng)用生物信息學(xué)工具，以達(dá)到節(jié)省時間和資源的目的[17]。由于天然來源的蛋白質(zhì)中潛在的生物活性肽種類及序列可搜索數(shù)據(jù)庫的增加 [如BIOPEP（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）、抗菌肽數(shù)據(jù)庫（antimicrobial pepteide database，APD）（http：//aps.unmc.edu/AP/main.php）和 Pepbank（http：//pepbank.mgh.harvard.edu/）]，使用序列信息預(yù)測的研究也逐漸增多。已有對鯉魚[18]、牦牛奶[19]和亞麻籽[20]等蛋白中的生物活性片段進(jìn)行計算機(jī)模擬消化預(yù)測的研究。目前，依賴于計算機(jī)模擬方法的食源性生物活性肽的研究已成為熱點[21]。

大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）大部分用于鮮食，被人體消化吸收后具有一定的降壓作用。市售降壓藥物目前大多是合成類的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制劑，長期服用可能會產(chǎn)生一些副作用。因此，現(xiàn)階段更多的研究是尋找食源性的ACE抑制肽來代替合成藥物。本研究針對大鱗副泥鰍的生物學(xué)活性，提出了一種替代的、可持續(xù)的方法，通過計算機(jī)模擬胃腸道內(nèi)消化大鱗副泥鰍蛋白來分析大鱗副泥鰍蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽的潛力。

1 材料與方法

1.1 大鱗副泥鰍中的蛋白質(zhì)氨基酸序列查找

輸入“Paramisgurnus dabryanus”到 UniProtKB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/），檢索出所有種類大鱗副泥鰍蛋白，并下載各種蛋白質(zhì)的氨基酸序列[22]。

1.2 蛋白質(zhì)氨基酸序列比對分析

使用默認(rèn)設(shè)置的ClustalW2多序列比對程序（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/），消除相似性小于90%的蛋白序列。

1.3 BIOPEP分析

生物活性肽序列獲自BIOPEP數(shù)據(jù)庫[23]。應(yīng)用此數(shù)據(jù)庫預(yù)測大鱗副泥鰍蛋白中潛在的ACE抑制肽，并與數(shù)據(jù)庫中已存在的體內(nèi)外具有ACE抑制活性的肽序列相匹配。此外，將大鱗副泥鰍蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入到BIOPEP數(shù)據(jù)庫可用的“酶促作用”工具中，預(yù)測被胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用形式，模擬胃腸消化過程。將從模擬胃腸消化獲得的理論肽提交給“尋找活性片段”選項。最后，顯示潛在的生物活性肽列表，從中選擇具有潛在ACE抑制活性的肽作進(jìn)一步分析。

潛在生物活性的概況用于定義蛋白質(zhì)分子中生物活性片段的類型和位置。根據(jù)以下公式，計算參數(shù)A（定義為蛋白質(zhì)序列中生物活性片段的出現(xiàn)頻率）和參數(shù)B（定義為蛋白質(zhì)的潛在ACE抑制活性）。

式中：a為蛋白質(zhì)序列中具有特定生物活性的片段數(shù)；N為蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)。

式中：ai為蛋白質(zhì)序列中第i個ACE抑制肽片段的重復(fù)次數(shù)；IC50i為第i個ACE抑制肽對應(yīng)其半數(shù)最大活性的濃度，μmol/L；K為具有ACE抑制活性的不同片段的數(shù)量；N為蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的數(shù)量。

1.4 模擬胃腸道消化

在BIOPEP中，用胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）來模擬胃消化，用胃蛋白酶、胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）和胰凝乳蛋白酶（EC 3.4.21.1）模擬胃腸消化。在水解物中，根據(jù)以下公式確定蛋白質(zhì)序列中由選定的酶釋放ACE抑制肽片段的頻率（AE）以及潛在ACE抑制活性（BE）。

式中：d為可以被酶釋放的具有特定生物活性的蛋白質(zhì)序列片段的數(shù)量；N為蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)。

式中：aj為給定的酶從蛋白質(zhì)序列釋放的第j個ACE抑制肽片段的重復(fù)次數(shù)；IC50j為第j個ACE抑制肽對應(yīng)其半數(shù)最大活性的濃度，μmol/L；I為由給定的酶釋放的具有ACE抑制活性的不同片段的數(shù)量；N為蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的數(shù)量。

1.5 大鱗副泥鰍蛋白和計算機(jī)模擬水解后釋放的肽的理化特性

使用“Peptides”包（2.4版）在R中的應(yīng)用或者Ex－PASy 的 ProtParam 工具（https：//web.expasy.org/protparam/），分析大鱗副泥鰍蛋白經(jīng)胃腸消化后得到的ACE抑制肽的理化特性，包括氨基酸組成、分子量（MW）、等電點（pI）、Boman指數(shù)、凈電荷、親水性的總平均值（grand average of hydropathy，GRAVY）。使用計算機(jī)分析產(chǎn)生的ACE抑制肽，使用ToxinPred（http：//crdd.osdd.net/raghavaltoxinpred/）預(yù)測毒性。

1.6 分子對接

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PCSB protein Data Bank）下載ACE蛋白晶體三維結(jié)構(gòu)文件（PDB ID：1O86）。使用分子模擬軟件Discovery Studio（2017）繪制大鱗副泥鰍肽三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)行加氫處理，并通過CHARMM程序?qū)⒛芰拷抵磷畹停琙n2+被保留在ACE模型中。DS 2017軟件根據(jù)自身評分和每個結(jié)果的組合自由能，選擇最好的匹配結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鱗副泥鰍蛋白中生物活性片段的出現(xiàn)頻率及潛在生物活性

運用ClustalW2比對Uniprot數(shù)據(jù)庫中228種大鱗副泥鰍蛋白，將其中氨基酸序列相似性小于90%的42種蛋白的基本信息進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果見表1。

表1 Uniprot數(shù)據(jù)庫中的42種大鱗副泥鰍蛋白Table 1 42 kinds of loach proteins in Uniport database

續(xù)表1 Uniprot數(shù)據(jù)庫中的42種大鱗副泥鰍蛋白Continue table 1 42 kinds of loach proteins in Uniport database

由表1可知，將42種大鱗副泥鰍蛋白分為3組：肉和血液蛋白，頭部、尾部、皮和內(nèi)臟中的蛋白（廢料蛋白）以及不特定存在于某一部分的其他蛋白。分析結(jié)果顯示，大鱗副泥鰍蛋白的分子量范圍介于7 171Da～70 624 Da，氨基酸殘基數(shù)為67個～668個。

蛋白質(zhì)種類和結(jié)構(gòu)往往影響著生物體的生物活性。使用BIOPEP數(shù)據(jù)庫分析42種大鱗副泥鰍蛋白質(zhì)的潛在功能活性，結(jié)果見圖1。

圖1 BIOPEP數(shù)據(jù)庫中具有給定活性的大鱗副泥鰍肽的出現(xiàn)頻率Fig.1 The frequency of the occurrence of peptides with given activity in loach protein performed by BIOPEP

在BIOPEP生物活性譜中，支持鑒定48種活性片段，如ACE抑制、抗氧化、抗記憶刪除、抗血栓形成、免疫調(diào)節(jié)、抑制二肽基肽酶IV、激活泛素-介導(dǎo)的蛋白水解、細(xì)菌滲透酶配體、趨化性、阿片樣物質(zhì)、抗癌、調(diào)節(jié)離子流、調(diào)節(jié)胃黏膜活性和磷酸肌醇代謝等。由圖1可知，大鱗副泥鰍蛋白與28種生物活性相關(guān)，其中二肽基肽酶IV抑制活性最高，ACE抑制活性其次。ACE抑制活性在42種大鱗副泥鰍蛋白中均有存在。此外，通過分析大鱗副泥鰍蛋白中生物活性肽出現(xiàn)頻率，發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽出現(xiàn)頻率較高。因此，本研究將ACE抑制活性作為主要活性進(jìn)行分析。

將42種大鱗副泥鰍蛋白分為3組進(jìn)行潛在生物活性肽數(shù)量以及頻率和潛在活性分析，結(jié)果見表2。

表2 在大鱗副泥鰍蛋白中鑒定出的潛在生物活性肽數(shù)量（a）以及頻率（A）和潛在活性（B）（每種蛋白分子）的最小值和最大值Table 2 Maximum and minimum values of potential bioactive peptides numbers identified（a），release frequency（A）and activity（B）in the loach proteins（each protein molecule）

如表2所示，在42種大鱗副泥鰍蛋白中檢測到生物活性肽數(shù)量最多為942種，最少為99種。肉類和血液蛋白中，尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶9，是包括ACE抑制肽在內(nèi)的生物活性片段的豐富來源。載脂蛋白中所有生物活性片段的出現(xiàn)頻率最高，A=1.576 7；ACE抑制肽出現(xiàn)頻率最高的是在β-肌動蛋白中，A=0.536 0。在大鱗副泥鰍蛋白中，具有最高潛在ACE抑制活性的蛋白質(zhì)是 β-防御素，B=0.047 4 μmol/L。

2.2 大鱗副泥鰍蛋白理化性質(zhì)分析

從42種蛋白質(zhì)中選擇具有最大ACE抑制活性潛力的3種蛋白質(zhì)。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白具有最多的ACE抑制活性片段，β-肌動蛋白出現(xiàn)ACE抑制活性片段的頻率最高，β-防御素潛在ACE抑制活性最高。3種蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果見表3。

表3 3種蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of three proteins

由表3可知，β-肌動蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9是酸性蛋白，β-防御素是堿性蛋白。堿性蛋白β-防御素的GRAVY值為0.842，酸性蛋白β-肌動蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9的GRAVY值分別為-0.215和-0.454。說明β-肌動蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白親水性更好，而β-防御素是疏水性蛋白。

Boman指數(shù)用來評價蛋白質(zhì)或肽與蛋白質(zhì)受體的結(jié)合潛力。因此，具有高Boman指數(shù)的肽和蛋白能夠在與一系列胞質(zhì)蛋白相互作用過程中表現(xiàn)出多功能行為。由表3可知，β-防御素的Boman指數(shù)為-0.432，表明與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的可能性較低。β-肌動蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白的Boman指數(shù)分別為1.446和1.596，顯示這些蛋白與其他蛋白結(jié)合的可能性更高。推測Boman指數(shù)與GRAVY值存在一定關(guān)聯(lián)性，即蛋白親水性越好，Boman指數(shù)越大。

2.3 經(jīng)計算機(jī)模擬胃和十二指腸消化后ACE抑制肽釋放數(shù)量、釋放頻率和活性

β-防御素、β-肌動蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白使用計算機(jī)模擬胃和胃腸消化后，將得到的ACE抑制活性指標(biāo)進(jìn)行對比，結(jié)果見表4。

表4 大鱗副泥鰍蛋白經(jīng)計算機(jī)模擬胃和胃腸連續(xù)消化后ACE抑制肽釋放數(shù)量（b）、釋放頻率（AE）和潛在活性（BE）Table 4 The release amount（b），release frequency（AE）and activity（BE）of ACE inhibitory peptides after gastric and gastrointestinal in silico digestion of loach proteins

由表4可知，β-防御素經(jīng)胃和胃腸道消化后得到ACE抑制肽的數(shù)量為1和2，β-肌動蛋白經(jīng)胃和胃腸道消化后得到ACE抑制肽的數(shù)量為3和16，基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白經(jīng)胃和胃腸道消化后的ACE抑制肽數(shù)量分別為10和31。經(jīng)胃和胃腸道消化大鱗副泥鰍蛋白產(chǎn)生的ACE抑制肽數(shù)量遠(yuǎn)低于由這3種蛋白可產(chǎn)生的ACE抑制肽數(shù)量（β-防御素，β-肌動蛋白，基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白的b值為27、210、305）。大鱗副泥鰍蛋白中β-肌動蛋白的ACE抑制肽釋放頻率最高AE=0.536 0，經(jīng)過胃腸道消化的β-肌動蛋白AE為0.043 7，在連續(xù)的消化階段，AE值降低。在胃腸道消化后，釋放ACE抑制肽頻率最高的是基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白其AE為0.044 9。同時基質(zhì)金屬蛋白酶9生物活性肽出現(xiàn)數(shù)量最多，所以將其作為ACE抑制肽來源比β-肌動蛋白豐富（表2，參數(shù)A）。推測可能是蛋白質(zhì)分子的生物學(xué)活性分布越豐富（表2，參數(shù)a），生物活性肽釋放的可能性就越大。

由表4可知，經(jīng)過胃消化后3種蛋白質(zhì)的BE值降低。β-肌動蛋白的BE值幾乎為0，這意味著β-肌動蛋白在胃消化后幾乎不存在ACE抑制活性。胃腸消化后，與胃消化相比，β-防御素的活性幾乎沒有變化，胃和胃腸消化后BE均降低為0.005 3 μmol/L?；|(zhì)金屬蛋白酶9的BE為0.025 0 μmol/L，胃腸消化后BE值為0.004 3 μmol/L。綜上分析，大鱗副泥鰍蛋白經(jīng)胃腸消化后產(chǎn)生ACE抑制肽，但是未完全釋放大鱗副泥鰍蛋白的潛在ACE抑制活性。

2.4 大鱗副泥鰍蛋白中鑒定出的ACE抑制肽的分析

β-防御素、β-肌動蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白經(jīng)胃腸消化后產(chǎn)生ACE抑制肽，將產(chǎn)生的ACE抑制肽進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 鱗副泥鰍蛋白中鑒定出的ACE抑制肽的序列、EC50、理化性質(zhì)和毒性預(yù)測Table 5 Sequences，EC50，physicochemical property and toxicity prediction of ACE inhibitory peptide identified in loach proteins

由表5可知，大鱗副泥鰍蛋白獲得的27種ACE抑制肽均為二肽和三肽，分子量范圍188.25 Da～317.41 Da。DF 和 DGL 的 pI≤4.5，凈電荷均為-1；其中18種肽的pI在5.5～6.5之間，凈電荷為0，3種肽的pI為 7.1，凈電荷為 0.5；4 種肽的 pI＞9，凈電荷為 1。因此，大多數(shù)大鱗副泥鰍ACE抑制肽是酸性且?guī)ж?fù)電荷，而少量為堿性帶正電荷。大鱗副泥鰍ACE抑制肽的Boman指數(shù)范圍為-4.92～7.46。大多數(shù)肽的Boman指數(shù)＜2，有8個肽的Boman指數(shù)＞2。Boman指數(shù)更大的肽更有可能與細(xì)胞內(nèi)的幾種蛋白質(zhì)結(jié)合或表現(xiàn)出多種功能。肽的GRAVY范圍為-3.70～4.15。本研究獲得的27種ACE抑制肽中，12種為疏水值介于-3.70～-0.50的親水性肽，13種為疏水值介于0.50～2.65的疏水性肽，而疏水性值在-0.50～0.50之間的兩親性肽只有兩種。

在27種ACE抑制肽中，大多數(shù)肽出現(xiàn)1次～2次，TF出現(xiàn)多達(dá)7次。高活性的TF可能是主要的ACE抑制肽。胃腸消化后的β-防御素與胃消化相比僅產(chǎn)生GF，而B值幾乎不變，所以GF的產(chǎn)生無法增加酶解蛋白體系的ACE抑制活性。GF的EC50為630 μmol/L，因此，經(jīng)胃腸消化后的大鱗副泥鰍蛋白產(chǎn)生的GL、GK、GM、GH和GF的EC50值大于或等于630 μmol/L，無法增加總體ACE抑制肽的活性。具有較高EC50值的ACE抑制肽的分子量高于222，所以，并不是分子量越低，ACE抑制肽的活性越高。同時，將蛋白與胃腸消化后蛋白的ACE抑制活性相比，雖然胃腸消化釋放一部分ACE抑制活性，但是并沒有充分利用大鱗副泥鰍蛋白中潛在的ACE抑制活性。

毒性預(yù)測由ToxinPred進(jìn)行，該軟件使用基于二肽組成和基序掃描的混合模型來預(yù)測肽的毒性或識別蛋白質(zhì)中的毒性區(qū)域。在本研究中，從大鱗副泥鰍蛋白釋放的ACE抑制肽均沒有潛在的毒性，表明它們適合進(jìn)一步開發(fā)并用于食品和藥品。

2.5 大鱗副泥鰍ACE抑制肽與ACE的分子對接

大鱗副泥鰍蛋白經(jīng)計算機(jī)模擬水解后，選取其中的三肽DGL和GPL進(jìn)行分子模擬和分子對接，結(jié)果見圖2。

圖2 ACE-肽分子對接相互作用Fig.2 Molecular docking between peptides and ACE

分子對接是基于配體和受體的“鎖-鑰原理”，模擬了小分子配體與受體生物大分子之間的相互作用，從分子角度闡述GPL與DGL和ACE的作用機(jī)制。ACE是一種依賴Zn2+的羧基二肽酶，其中Zn2+是ACE活性中心的重要組成部分。ACE活性中心有S1、S2、S33個必需結(jié)合位點，S1為 Ala354、Glu384 和Tyr523，S2為 Gln281、His353、Lys511、His513 和 Tyr520，S3為Glu162。選擇三肽ASL、DGL、GPL中ASL的作用位點S1和S2[24]，將DGL和GPL分別進(jìn)行分子對接。

由圖2b可知，在DGL-ACE復(fù)合物中，DGL與ACE 的氨基酸殘基 Gln281（2.04 ?）、His353（2.35 ?）、Ala354（1.72 ?）、Lys511（1.76 ?/1.78 ?）和 Tyr520（2.91 ?）形成了6個距離不同的氫鍵，與Ala354之間的氫鍵最短，結(jié)合最緊密；與 His353（2.22 ?）、His383（3.01 ?）和His513（2.67 ?）形成了3個距離不同的碳?xì)滏I。DGL與氨基酸殘基Glu384（1.92 ?）形成鹽橋，DGL中的C原子與Val380（4.84 ?）形成烷基鍵，DGL中的O原子與 Arg522（5.59 ?）和 Zn701（2.27 ?）間形成靜電相互作用。其中DGL和ACE活性位點S1中Ala354形成氫鍵；活性位點 S2中的 Gln281、His353、Lys511、Tyr520形成氫鍵與His513形成碳?xì)滏I。ACE的活性中心含有Zn2+的活性口袋，DGL和活性位點中的殘基發(fā)生作用，且與Zn2+有較強(qiáng)的結(jié)合能力，占據(jù)ACE的活性中心，使其活性降低。

由圖2d可知，GPL與ACE的氨基酸殘基Glu162（2.72 ?）、Gln281 （2.11 ?）、His353 （2.18 ?）、Glu376（2.00 ?）、Lys511（2.08 ?）和 Tyr520（1.84 ?）之間形成了6個距離不同的氫鍵，其中GPL和氨基酸殘基Tyr520之間的氫鍵最短，結(jié)合最緊密；GPL與Ala354形成了距離為 2.57 ? 和 2.90 ? 的兩個碳?xì)滏I，與Zn701（2.28 ?）形成金屬受體相互作用，與Arg522（2.00 ?）形成鹽橋。其中GPL和ACE活性位點S1中Ala354形成碳?xì)滏I；活性位點 S2中的 Gln281、His353、Lys511、Tyr520 形成氫鍵；活性位點S3Glu162形成氫鍵。但是，DGL可以與Zn2+形成離子鍵，直接導(dǎo)致ACE分子失活。

3 結(jié)論

本研究初步篩選出大鱗副泥鰍蛋白中的潛在ACE抑制肽；發(fā)現(xiàn)ACE抑制活性是大鱗副泥鰍蛋白的主要生物活性，同時具有較高的ACE抑制肽產(chǎn)生頻率?；|(zhì)金屬蛋白酶9蛋白、β-肌動蛋白和β-防御素蛋白經(jīng)胃和胃腸消化后可得到27種ACE抑制肽，其中，DGL 和 GPL 與 ACE 活性位點 S1、S2、S3結(jié)合。但是，大鱗副泥鰍蛋白經(jīng)胃腸消化后ACE抑制肽產(chǎn)生數(shù)量、頻率和潛在活性均降低。這些結(jié)果為在食品工業(yè)中開發(fā)大鱗副泥鰍蛋白作為ACE抑制肽的前體提供了理論基礎(chǔ)。