齊笑笑，郭嘉，溫紀平

（河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

小麥是三大傳統(tǒng)谷物之一，是主要的糧食作物。小麥中富含多種營養(yǎng)物質，但由于天氣原因、貯藏條件不當等因素，小麥吸水受潮后品質會發(fā)生劣變，如內部酶活性升高，總淀粉、粗脂肪和蛋白質含量減少，出粉率、灰分、千粒重和容重降低[1-2]。隨著發(fā)芽程度的加深，面筋越來越弱，面團易流變，小麥加工品質和食用品質明顯下降，導致價格降低[3]，且多用作飼料生產，造成巨大的經濟損失和資源浪費[4]。研究表明，小麥發(fā)芽過程中蛋白酶活性增強易導致大部分的蛋白質水解，蛋白質分子結構變得更加疏松，部分大分子蛋白質轉變成小分子蛋白質，使清蛋白、球蛋白含量增加[5]；另外萌動也會使-SH、S-S含量減少、氨基酸含量增加、面筋蛋白的功能特性如持水力、持油力升高[6]。

解決發(fā)芽小麥品質劣變的問題，一方面可以通過培育抗穗發(fā)芽的小麥種子[7]；另一方面可以從發(fā)芽小麥角度出發(fā)，對芽麥進行不同手段的處理，來改善發(fā)芽小麥品質，主要包括微波輻照、加熱處理、添加酶抑制劑、剝皮制粉、配粉配麥等[8]。但現有的處理手段具有一定的局限性，如剝皮制粉易使碎麥麩進入面粉而降低其質量，配粉配麥需要利用正常小麥，微波處理和熱處理會對蛋白質造成不利影響。氣流分級是一種對組分無破壞的物理方法，可以有效改善萌動小麥粉的品質[9]。該法利用顆粒粒徑不同在空氣中受到的氣體曳力、自身重力和離心力的綜合作用不同，將粗粒沉降細粒帶走，從而對不同粒徑的顆粒實現分級[10]。

本研究對小麥進行發(fā)芽處理，分別得到未發(fā)芽小麥粉（WF）和發(fā)芽小麥粉（SF），并對SF進行氣流分級后按照粒徑大小分為F1、F2和F3，共5種小麥粉，以此為原料，通過對其蛋白質含量、面筋指數、巰基二硫鍵含量、面筋蛋白的功能特性、動態(tài)流變學特性、氨基酸含量等進行測定分析，探究氣流分級對發(fā)芽小麥粉面筋蛋白特性的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百農307：河南秋樂種業(yè)科技股份有限公司；L-半胱氨酸、β-巰基乙醇、Tris、甘氨酸、5，5-二硫代-2-2硝基苯甲酸 （5，5-dithio bis-2-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA）：上海麥克林生化科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）：北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、鹽酸、硼酸、尿素、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇：天津市科密歐化學試劑有限公司。以上均為分析純。

1.2 儀器與設備

LRH-550-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱：韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；MLU-202型布勒實驗磨：瑞士布勒集團；AF200氣流分級機：山東濰坊精華粉體工程有限公司；NKT-2010L激光粒度分析儀：山東耐克特儀器有限公司；HFQ型面粉混合器：開封海德機械有限公司；HJ-6磁力加熱攪拌器：金壇市西城新瑞儀器廠；THZ-82A水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；LXJ-IIB離心機：上海安亭科學儀器廠；UV2150紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；FOSS TM8400凱氏定氮儀：丹麥FOSS儀器公司；Freezone6 plus冷凍干燥機：美國Labconco有限公司；S-433D氨基酸分析儀：德國SYKNM公司；MARS60哈克流變儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；VTMR20-010V-T型核磁共振變溫分析系統(tǒng)：上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

發(fā)芽小麥制備：將除雜后的小麥籽粒室溫（25℃）下浸泡4 h，瀝干水分后鋪在托盤上，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中于 20℃、相對濕度（relative humidity，RH）85%條件下培養(yǎng)12 h，將發(fā)芽好的小麥放入45℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥12 h，使水分降到13%以下，室溫（25℃）保存。

小麥粉制備：小麥在室溫（25℃）下潤麥，加水調質約24 h，目標水分為15%。采用MLU-202型布勒實驗磨磨粉，收集各系統(tǒng)粉混勻，控制出粉率在70%左右。將部分發(fā)芽小麥粉（SF）進行氣流分級，得到3種不同粒徑的發(fā)芽小麥粉（F1、F2、F3），5種粉的粒徑分布見表1，相同環(huán)境下密封保存于4℃冰箱中。

表1 5種小麥粉的粒徑分布Table 1 Particle size distribution of 5 kinds of wheat flour

面筋蛋白制備：參考徐小青等[11]的方法，并略作修改，將小麥粉制成面團后，采用水洗法提取面筋蛋白，真空冷凍干燥48 h，用高速粉碎機粉碎后過80目篩，密封保存于4℃冰箱中備用。

1.3.2 蛋白組分的提取及蛋白含量測定

總蛋白含量的測定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中自動凱氏定氮儀法進行測定，系數為5.70。

谷蛋白大聚體（glutenin macropolymer，GMP）含量的測定：1.00 g小麥粉，加入20 mL 1.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）溶液，旋渦振蕩混勻，30℃水浴30 min，4 000 r/min離心15 min，棄上清液，用凱氏定氮法測定其含量，系數為6.25。

清蛋白含量的測定：1.00 g小麥粉加10 mL蒸餾水，50℃水浴30min，4 000 r/min離心20 min，收集上清液；蒸餾水洗沉淀2次，每次10 mL，50℃水浴10 min，4 000 r/min離心10 min，收集所有上清液，待測。

球蛋白含量的測定：上述沉淀用10%的氯化鈉溶液提取，提取方法同清蛋白的提取方法。

麥醇溶蛋白含量的測定：沉淀用75%的乙醇溶液提取，提取方法同清蛋白的提取方法。

麥谷蛋白含量的測定：沉淀用0.2%的氫氧化鈉溶液提取，提取方法同清蛋白的提取方法。

上清液收集合并后，用凱氏定氮法測定其含量，換算系數為6.25。

1.3.3 面筋含量和指數的測定

濕面筋含量的測定：參照GB/T 5506.2—2008《小麥和小麥粉面筋含量第2部分：儀器法測定濕面筋》測定；干面筋含量測定：參照GB/T 5506.4—2008《小麥和小麥粉面筋含量第4部分：快速干燥法測定干面筋》測定；面筋指數的測定：參照LS/T 6102—1995《小麥粉濕面筋質量測定法面筋指數法》測定。

1.3.4 面筋蛋白總巰基、游離巰基和二硫鍵含量的測定

參考郭興鳳等[12]的方法，并略作修改，繪制L-半胱氨酸標準曲線。用0.2 mol/L Tris-Gly緩沖溶液配制2 mmol/L L-半胱氨酸標準溶液，在412 nm處測定其吸光度，繪制標準曲線（吸光度為橫坐標），得到y(tǒng)=0.076 3x+0.000 2，R2=0.999 5。

游離巰基（-SH）含量的測定：0.03 g面筋蛋白，溶于10 mL 0.2 mol/L Tris-Gly緩沖溶液，4 000 r/min離心15 min；取4 mL上清液，加0.1 mL 10 mmol/L的DTNB溶液，混勻后顯色20 min，在412 nm處測定吸光度，通過標準曲線計算游離巰基的含量。

式中：y為樣品在412 nm處吸光度對應的L-半胱氨酸濃度，μmol/mL；m為樣品質量，g。

總巰基、二硫鍵含量的測定：取上述上清液1 mL，加入0.1 mL β-巰基乙醇和3 mL緩沖液，25℃下保溫1 h；再加入10 mL 12%的三氯乙酸，再次25℃下保溫1 h，4 500 r/min離心15 min；除去上清液，將沉淀用5 mL 12%的三氯乙酸洗滌兩次后，溶于8 mL緩沖液，取4 mL上述溶解于沉淀的溶液，加入0.1 mL DTNB，混勻后顯色20 min，在412 nm處測定吸光度。

式中：y為樣品在412 nm處吸光度對應的L-半胱氨酸濃度，μmol/mL；m為樣品質量，g。

1.3.5 面筋蛋白功能特性測定

持水力的測定：1.00 g面筋蛋白（m1）于50 mL離心管中，放入轉子后稱量總質量m2，加入25 mL蒸餾水磁力攪拌30 min，2 000 r/min下離心30 min，除去上層水分后稱質量（m3），計算公式如下。

持油力的測定：2.00 g面筋蛋白（m1）用10 mL大豆色拉油攪拌，操作如持水力的測定，計算公式如下。

1.3.6 面筋蛋白動態(tài)流變學特性測定

參考黃蓮燕等[13]的方法，并略作修改，按照1.3.3中儀器法測定濕面筋含量的方法洗出濕面筋，從中心部位取2 g左右濕面筋，揉成小球置于35 mm圓形平板中央，平板間距1 mm，用刮板刮去多余樣品，頻率變化范圍為0.1 Hz～10.0 Hz，測試溫度為30℃，應力為1%。用哈克流變儀測定其彈性模量（G′）、黏性模量（G″）和損耗角正切值（tan δ）隨頻率的變化。

1.3.7 面筋蛋白中氨基酸含量的測定

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》進行測定。

1.4 數據處理

每個試驗至少重復3次，試驗結果表示為平均值±標準偏差。采用Excel和SPSS 20軟件對數據進行分析和處理，采用Duncan極差法分析數據在P＜0.05水平上的顯著性。采用Origin 8.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白質含量的分析

小麥中的蛋白質是重要的營養(yǎng)物質，氣流分級對發(fā)芽小麥粉蛋白質含量的影響如圖1所示。

圖1 氣流分級對發(fā)芽小麥粉蛋白質含量的影響Fig.1 The effect of air classification on the protein content of sprouted wheat flour

由圖1可知，小麥發(fā)芽后，SF總蛋白含量顯著降低，這是由于發(fā)芽會導致蛋白酶活性增強，將部分蛋白質水解成氨基酸或轉化為酰胺來滿足自身的生長需要，使蛋白質含量降低。GMP不溶于質量分數為1.5%的SDS緩沖溶液，GMP占總蛋白的比例不大，但與小麥的加工品質密切相關，可以用于面筋品質和面團特性的預測[14]。發(fā)芽前后和氣流分級后GMP含量沒有顯著差異。

小麥中的蛋白質根據溶解性不同可以分為清蛋白、球蛋白、麥醇溶蛋白和麥谷蛋白。清蛋白和球蛋白是小分子蛋白，被稱為生理活性蛋白，含有較高水平的氨基酸，不參與面筋網絡的形成；而麥醇溶蛋白和麥谷蛋白是大分子蛋白，被稱為面筋蛋白，參與面筋網絡的形成。如圖1所示，發(fā)芽后SF清蛋白含量升高，球蛋白含量無顯著差異，麥醇溶蛋白和麥谷蛋白降低，這與金玉紅等[15]的研究一致，說明在發(fā)芽過程中蛋白質處于不斷分解與合成的動態(tài)。氣流分級后，隨著粒徑的減小，F1、F2、F3清蛋白含量逐漸減少，球蛋白含量逐漸增加，麥醇溶蛋白與麥谷蛋白都是先增加再減小。說明清蛋白、麥醇溶蛋白和麥谷蛋白主要分布于大中粒徑粉中，球蛋白分布在小粒徑粉中。小麥胚乳中蛋白質含量從中心到皮層依次增加[16]，由此說明小粒徑粉更接近于胚乳中心，而大中粒徑粉更接近于皮層。

2.2 面筋含量和指數的分析

面筋是由麥谷蛋白與麥醇溶蛋白通過二硫鍵交聯形成的凝聚物，面筋指數反映面筋的品質，面筋含量和品質是評價面團品質的重要標志[17]。氣流分級對發(fā)芽小麥粉面筋特性的影響見表2。

表2 氣流分級對發(fā)芽小麥粉面筋含量和指數的影響Table 2 The effect of air classification on the gluten content and quality of sprouted wheat flour

由表2可知，發(fā)芽后SF的面筋含量與面筋指數均降低；氣流分級后，隨著粒徑的減少，F1、F2、F3的面筋含量與面筋指數均呈下降趨勢，且F1的濕面筋含量和面筋指數與SF相比有顯著升高，與WF相比也有升高。這是由于隨著粒徑的減小，蛋白質碎片流失，從而導致面筋含量降低[18]。面筋由麥谷蛋白和麥醇溶蛋白組成，其含量越高，面筋的品質越好，結合圖1分析可知，隨著麥谷蛋白與麥醇溶蛋白的比例減小，面筋品質變差，手洗面筋時難以成團，面筋含量也會降低。結果表明F1中面筋品質更好。

2.3 面筋蛋白總巰基、游離巰基和二硫鍵含量的分析

巰基的存在方式和含量與面筋的性質息息相關，二硫鍵是一種共價鍵，S-S的含量代表蛋白質結構的穩(wěn)定性，S-S與還原酶作用會產生游離-SH，游離-SH對蛋白質的交聯作用有很大影響，會破壞蛋白質構象的穩(wěn)定性[19]。氣流分級對發(fā)芽小麥粉中巰基、二硫鍵含量的影響見圖2。

圖2 氣流分級對發(fā)芽小麥粉中巰基、二硫鍵含量的影響Fig.2 The effect of air classification on the content of sulfhydryl and disulfide bonds in sprouted wheat flour

如圖2所示，發(fā)芽后，SF的總巰基、二硫鍵含量降低；氣流分級后，隨著粒徑的減小，F1、F2、F3的總巰基與二硫鍵含量逐漸減少，且F1與WF相比有顯著增加，F2、F3與SF無顯著差異；游離巰基的含量先下降后上升。這說明隨著粒徑的減小，面團網絡結構從穩(wěn)定的S-S結構轉變?yōu)椴环€(wěn)定的-SH結構，導致內部交聯聚合緊密度的變化，面團中面筋網絡結構變得疏松，面團強度變弱。結果表明F1中蛋白質的結構更加穩(wěn)定。

2.4 面筋蛋白功能特性的分析

蛋白質的持水力是決定食品彈性和可塑性的主要因素，決定了蛋白質分子的內聚力和可分散性；持油力是蛋白質和脂類結合能力的表現，在不同的油脂中作用能力不同。氣流分級對發(fā)芽小麥粉面筋蛋白持水力和持油力的影響見表3。

表3 氣流分級對發(fā)芽小麥粉面筋蛋白持水力和持油力的影響Table 3 Effect of air classification on water holding capacity and oil holding capacity of sprouted wheat flour gluten

由表3可知，發(fā)芽后，SF的持水力和持油力均有增加，且持水力有顯著差異；氣流分級后，隨著粒徑的減小，F1、F2、F3的持水力和持油力逐漸增加，且F1、F2與WF無顯著差異。這是由于在正常情況下，蛋白質分子中的帶電基團和極性基團在分子內部無法與水或油結合。但在發(fā)芽后，蛋白酶活性升高，使部分蛋白質發(fā)生分解，這些基團被暴露出來，且隨著粒徑的減小更容易被暴露出來，從而加速與水或油結合，增強了持水力或持油力[20]。

2.5 面筋蛋白動態(tài)流變學特性分析

彈性模量G′又稱儲能模量，反映了彈性特征的減少量；黏性模量G″又稱損耗模量，反映了黏性特征的增加量；損耗角正切值 tan δ 是 G″與 G′的比值，tan δ＜1表明在線性范圍內的形變是可壓縮和可恢復的，tan δ越小說明面筋體系聚合度越大或高聚物含量越多[21]。在固定應力下，通過改變振蕩頻率來觀察面筋蛋白的G′和G″的變化。氣流分級對發(fā)芽小麥粉面筋蛋白動態(tài)流變學特性的影響如圖3所示。

圖3 氣流分級對發(fā)芽小麥粉面筋蛋白動態(tài)流變學特性的影響Fig.3 Effect of air classification on the dynamic rheological properties of sprouted wheat flour gluten

由圖3可知，在0.1 Hz～10.0 Hz的頻率掃描范圍內，5種粉的面筋蛋白的G′和G″隨著頻率的增加整體呈增大趨勢，且彈性模量始終大于黏性模量，說明表現出固體的性質。在同一頻率下，F3的G′和G″均是最高的，說明F3的彈性變得越來越差，黏性越來越好，發(fā)生形變后不易恢復。如圖3所示，隨著頻率的增加，WF、SF和F3的tan δ先減小后增大，F1和F2的tan δ逐漸增大，且均小于1。在同一頻率下，發(fā)芽后SF的tan δ與WF相比增大了，說明SF面筋體系中的彈性比例變小，流動性變大，面筋強度下降，與2.2中面筋指數結果是一致的。

2.6 面筋蛋白中氨基酸含量的分析

氣流分級對發(fā)芽小麥粉面筋蛋白中氨基酸的含量變化如表4所示。

表4 氣流分級對發(fā)芽小麥粉面筋蛋白中氨基酸的影響Table 4 Effect of airflow classification on amino acids in gluten protein of sprouted wheat flour g/100 g

由表4可知，發(fā)芽前后與氣流分級后，小麥粉中的氨基酸種類數量齊全，共檢測到17種氨基酸，其中谷氨酸含量最高；在必需氨基酸中，亮氨酸含量最高。小麥發(fā)芽后，除半胱氨酸外，其余16種氨基酸含量均增加，這與龍杰等[22]的研究結果一致。氣流分級后，F1的氨基酸含量是5種粉中最高的，F2、F3與SF相比沒有顯著變化，與WF相比有增加。賴氨酸作為小麥蛋白質的第一限制氨基酸，在發(fā)芽后增加，F1時達到最大值。這是由于小麥發(fā)芽后部分蛋白質受酶活性升高而水解為游離氨基酸，使氨基酸含量上升[23]。結果表明F1中營養(yǎng)價值更高。

3 結論

小麥發(fā)芽后，SF的總蛋白含量下降、清蛋白含量升高、麥醇溶蛋白與麥谷蛋白含量降低；面筋指數顯著降低、總巰基與二硫鍵含量顯著下降，面筋品質與蛋白質穩(wěn)定結構變差；面筋蛋白的持水力和持油力升高，彈性下降、黏性上升；代表營養(yǎng)價值的氨基酸含量發(fā)芽后增加。

氣流分級后，與 SF 相比，F1、F2、F3 的 GMP、球蛋白與麥醇溶蛋白含量均無顯著變化，F1的總蛋白與清蛋白含量顯著增加，F1面筋含量與指數升高、F2無顯著差異、F3明顯下降；F1的總巰基與二硫鍵含量顯著增加，F2、F3無顯著變化；F1的持水力和持油力顯著下降、F2也有下降且二者與WF無顯著差異，F3升高；F1與F2的彈性模量和黏性模量均下降，F3升高，且F1的tan δ低于SF；F1的大部分氨基酸含量呈增加趨勢，F2與F3整體降低。

綜上所述，小麥發(fā)芽后面筋含量、品質與蛋白質結構穩(wěn)定性變差，面筋蛋白的功能特性、黏性與氨基酸含量升高，彈性降低；經氣流分級后，F1的面筋品質變好、蛋白質結構更穩(wěn)定、面筋蛋白彈性增加、黏性降低、氨基酸含量增加，其余指標與WF無顯著差異。因此氣流分級在發(fā)芽小麥上的應用值得更多研究。