安然，蔡銘祺，覃小燕，韋秋，楊云，毛浩萍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)方劑與教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種常見(jiàn)的代謝性骨骼疾病，其特點(diǎn)是骨小梁結(jié)構(gòu)消失、骨量降低，骨折的風(fēng)險(xiǎn)升高[1]。骨質(zhì)疏松患者主要是老年人和絕經(jīng)期后女性，OP基本發(fā)病機(jī)制是骨代謝失衡，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)的骨形成[2]。目前對(duì)于OP的治療應(yīng)主要是通過(guò)刺激骨形成或抑制骨吸收。臨床用藥主要有雙膦酸鹽、地諾單抗和羅莫珠單抗。他們多數(shù)是通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞增生、分化及凋亡從而減少骨吸收。研究表明，雙膦酸鹽藥物和地諾單抗只能抑制骨吸收，不具備增加骨形成的能力[3-4]。羅莫珠單抗是作用于骨硬化蛋白的單克隆抗體，是唯一具有雙重作用的抗骨質(zhì)疏松藥物，它既可以抑制骨吸收又可以通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞分化和增殖作用促進(jìn)骨形成[5]。然而羅莫珠單抗產(chǎn)生嚴(yán)重心血管事件問(wèn)題尚未解決，尋找新的治療藥物是迫切需要的，具有重要意義[6]。

小鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）具有增殖能力和向多種細(xì)胞分化潛能[7]。在OP導(dǎo)致的骨損傷發(fā)生后，BMMSCs及其周圍的骨膜、軟組織間充質(zhì)等前體細(xì)胞增生，遷移到受損部位，分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨組織恢復(fù)[8]。因此，調(diào)控BMMSCs遷移和分化平衡，促進(jìn)BMMSCs趨于向成骨細(xì)胞分化，有助于骨形成，對(duì)治療OP具有重要意義。

墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrate L．的干燥地上部分，化學(xué)成分主要分為三萜類、黃酮類、噻吩類、香豆素類、甾體類[9]。墨旱蓮主治肝腎不足，眩暈耳鳴，視物昏花，腰膝酸軟等癥狀[10]。多項(xiàng)研究表明，墨旱蓮提取物（EHE）可改善多種骨質(zhì)疏松模型小鼠的骨微結(jié)構(gòu)損傷，且具有抑制破骨細(xì)胞骨吸收活性的作用[11-13]。其中，墨旱蓮有效成分蟛蜞菊內(nèi)酯通過(guò)Wnt/GSK3β/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞生成[14]，而墨旱蓮是否促進(jìn)BMMSCs的遷移和分化作用未見(jiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步闡明。本研究通過(guò)探究EHE對(duì)BMMSCs的遷移和分化的作用及可能的作用機(jī)制，為后續(xù)墨旱蓮治療OP的作用機(jī)制提供研究方向。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)6周雌性C57BL/6J小鼠，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2014-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房。

1.2 藥品與主要試劑 墨旱蓮藥材購(gòu)自安國(guó)祁安藥業(yè)有限公司；基礎(chǔ)培養(yǎng)基（αMEM）、胎牛血清、聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）檢測(cè)試劑盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；青霉素-鏈霉素混合液（10 000 U/mL青霉素G鈉鹽，10 mg/mL硫酸鏈霉素）、成骨誘導(dǎo)劑、成脂誘導(dǎo)劑、油紅O檢測(cè)試劑盒（BI，以色列）；5-溴-4-氯-3- 吲哚基-磷酸鹽/氯化硝基四氮唑蘭（BCIP/NBT）顯色試劑盒、蛋白裂解液（RIPA）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；茜素紅粉末、甲苯胺藍(lán)粉末（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)）；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）（R&D Systems，美國(guó)）；兔抗鼠 β-肌動(dòng)蛋白（βactin）一抗、兔抗鼠CXC趨化因子受體4（CXCR4）一抗、山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（賽信通生物試劑有限公司，美國(guó)）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液（ECL發(fā)光液）（默克，美國(guó)）

1.3 儀器 二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)）；細(xì)胞遷移侵襲（Transwell）小室（美天旎生物技術(shù)公司，德國(guó)）；倒置顯微鏡（尼康，日本）；臺(tái)式高速離心機(jī)（貝克曼庫(kù)爾特有限公司，美國(guó)）；-40℃低溫冰箱（三洋，日本）；電泳槽、半干轉(zhuǎn)（伯樂(lè)，美國(guó)）。

2 方法

2.1 EHE的制備 2 kg墨旱蓮藥材用70%乙醇回流2次，每次2 h。將提取物濃縮至200 g，4℃條件下儲(chǔ)存。憑證標(biāo)本（編號(hào)20161229）保存在天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測(cè)定了 7 種主要化合物的濃度，0．233±0．005 mg/g（旱蓮苷 IV），1．021±0．004 mg/g（旱蓮苷 A），0．272±0．003mg/g（芹菜素），0．115±0．00mg/g（3’-羥基生物素A），0．306±0．004 mg/g（木犀草素），0．125±0．008 mg/g（木犀草素-7-O-葡糖苷），0．271±0．001 mg/g（蟛蜞菊內(nèi)酯）[15]。

2.2 小鼠原代BMMSCs的提取與培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，取小鼠雙側(cè)股骨和脛骨，置于含10%雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，剔除肌肉組織，使用用含有10%血清和1%雙抗的α-MEM的培基沖洗骨髓腔至無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，收集細(xì)胞懸液。經(jīng)70 μm細(xì)胞篩過(guò)濾，過(guò)濾后培養(yǎng)于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，每2～3 d換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%后可進(jìn)行傳代，傳至第3代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 小鼠原代BMMSCs表面抗原鑒定 BMMSCs使用胰酶消化后，加入預(yù)冷PBS，調(diào)整細(xì)胞密度為3×107個(gè)細(xì)胞/mL。采用流式細(xì)胞儀鑒定，分別加入不同的熒光標(biāo)記的單克隆抗體渦旋混勻，在冰上避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀鑒定。

2.4 小鼠原代BMMSCs誘導(dǎo)分化鑒定 第3代BMMSCs接種于96孔板，細(xì)胞密度為6×104個(gè)細(xì)胞/mL，加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)72 h后棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次，進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色；培養(yǎng)2周后進(jìn)行茜素紅染色；加入軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑培養(yǎng)2周后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色；加入脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)10 d后進(jìn)行油紅O染色。

2.5 細(xì)胞遷移侵襲（Transwell）檢測(cè)第3代BMMSCs鋪板于8 μm孔徑的Transwell小室上層，小室下層加入 50 ng/mL SDF-1、0．1 μg/mL 和 1μg/mL EHE，6 h后用棉簽擦去小室上層還未穿過(guò)薄膜的細(xì)胞，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照遷移后的細(xì)胞。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）方法檢測(cè)CXCR4蛋白表達(dá) 加入細(xì)胞蛋白裂解液，冰上裂解15 min。12 000 r/min，離心半徑10 cm，4℃離心 15 min，離心后取上清，使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。將各組蛋白濃度調(diào)整至1．5mg/mL。加入5×蛋白上樣緩沖液，金屬浴100℃加熱5 min，制備樣品結(jié)束。樣品通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后將蛋白轉(zhuǎn)移到用濾紙包裹PVDF膜中。三乙醇胺-吐溫緩沖（TBST）配置的5%牛奶中進(jìn)行封閉2 h。PVDF膜在4℃下在TBST制備的一抗體稀釋液中孵育過(guò)夜。第2天回收一抗，用TBST洗膜3次。加入二抗室溫孵育2h。用TBST洗膜3次。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影，用Image j軟件測(cè)定蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

2.7 ALP活性檢測(cè) 第3代BMMSCs接種于96孔板，細(xì)胞密度為6×104個(gè)細(xì)胞/mL，設(shè)置對(duì)照組和成骨誘導(dǎo)劑組。成骨誘導(dǎo)劑組給予EHE，劑量分別為0．1和1 μg/mL。72 h后進(jìn)行ALP活性檢測(cè)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用Dunnett檢驗(yàn)。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠原代BMMSCs培養(yǎng)和鑒定 分離提取得到的BMMSCs正常培養(yǎng)狀態(tài)下，鏡下觀察如圖1所示。培養(yǎng)3 d后的小鼠BMMSCs呈圓形；培養(yǎng)7 d后貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞表面分子sca-1的表達(dá)率為86%、分化簇（CD）29的表達(dá)率為99%、CD140α的表達(dá)率為88．7%、CD90 的表達(dá)率為 63．7%以及 CD45 的表達(dá)率為14%、CD34的表達(dá)率為1%。

圖1 小鼠原代BMMSCs培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and identification of mouse primary BMMSCs

BMMSCs經(jīng)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，ALP染色觀察發(fā)現(xiàn)被黑染的成骨細(xì)胞，茜素紅染色觀察發(fā)現(xiàn)紅色礦化結(jié)節(jié)樣的成骨細(xì)胞；經(jīng)軟骨誘導(dǎo)后，甲苯胺藍(lán)染色觀察發(fā)現(xiàn)被藍(lán)染的軟骨細(xì)胞；經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，油紅O染色觀察發(fā)現(xiàn)橘紅色脂滴樣的脂肪細(xì)胞。以上結(jié)果表明提取得到的細(xì)胞符合BMMSCs的特性。

3.2 墨旱蓮提取物對(duì)小鼠BMMSCs遷移能力的影響 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，0．1和1 μg/mL EHE能顯著提高BMMSCs的遷移能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)圖2。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)探究EHE對(duì)小鼠BMMSCs遷移能力的影響Fig.2 Transwell experiment to explore the effect of Eclipta chinensis extract on the migration ability of mouse BMMSCs

3.3 墨旱蓮提取物對(duì)小鼠BMMSCs中CXCR4蛋白表達(dá)的影響 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1 μg/mL EHE具有提高CXCR4蛋白表達(dá)的趨勢(shì)，0．1 μg/mL EHE 顯著提高 CXCR4 蛋白的表達(dá)（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

圖3 Western Blot檢測(cè)EHE對(duì)小鼠BMMSCs中CXCR4蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Western blot detection of eclipta extract on the expression of CXCR4 protein in mouse BMMSCs

3.4 墨旱蓮提取物對(duì)小鼠BMMSCs向成骨細(xì)胞分化作用 ALP是BMMSCs向成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志性指標(biāo)之一，ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予成骨誘導(dǎo)劑顯著升高 ALP 濃度（P＜0．05）；與給予成骨誘導(dǎo)劑相比，1 μg/mL EHE具有升高ALP 濃度的作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

ALP染色觀察發(fā)現(xiàn)，與給予成骨誘導(dǎo)劑相比，0．1和1 μg/mL EHE組細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭型變?yōu)閳A形，細(xì)胞體積變大，被黑染的成骨細(xì)胞數(shù)量增多；茜素紅染色觀察發(fā)現(xiàn)，與給予成骨誘導(dǎo)劑相比，0．1和1 μg/mL EHE組細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭型變?yōu)閳A形，細(xì)胞體積變大，紅色礦化結(jié)節(jié)樣的成骨細(xì)胞數(shù)量增多。見(jiàn)圖4。

圖4 EHE對(duì)小鼠BMMSCs向成骨細(xì)胞分化作用Fig.4 The effect of eclipta extract on the differentiation of mouse BMMSCs into osteoblasts

4 討論

OP是一種系統(tǒng)性、多因素的骨病。由于骨微結(jié)構(gòu)消失，骨密度降低，骨質(zhì)疏松性骨折成為OP最常見(jiàn)的臨床癥狀，從而使患者面臨慢性疼痛和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[16]。BMMSCs被認(rèn)為是發(fā)育成骨細(xì)胞的主要來(lái)源，BMMSCs的功能對(duì)骨形成和骨微環(huán)境具有重要意義[17]。在OP患者中，BMMSCs可能會(huì)失去自我更新能力，且容易分化為脂肪細(xì)胞而不是骨細(xì)胞，從而導(dǎo)致骨丟失和脂肪堆積[18]。促進(jìn)BMMSCs的向成骨細(xì)胞分化是恢復(fù)不平衡骨代謝的潛在策略。國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)[19]提出BMMSCs具有以下特點(diǎn)：1）在正常培養(yǎng)條件下貼壁生長(zhǎng)。2）細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。3）缺乏造血標(biāo)志物的表達(dá)。4）具有多向分化的能力。本實(shí)驗(yàn)提取分離獲得的BMMSCs，培養(yǎng)7 d后貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)的有 sca-1、CD29、CD140α、CD90，陰性表達(dá)的有CD45和CD34，符合BMMSCs表型。實(shí)驗(yàn)可成功誘導(dǎo)BMMSCs分化為成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。以上結(jié)果表明提取的細(xì)胞符合BMMSCs特性。

BMMSCs可以通過(guò)較強(qiáng)的遷移和歸巢能力，到達(dá)受損組織部位，抑制炎癥并進(jìn)行多向分化使受損組織進(jìn)行傷口修復(fù)[20]。所以BMMSCs向骨表面遷移對(duì)骨形成和骨折愈合至關(guān)重要。CXCR4是SDF-1的G蛋白耦連特異性受體，可在細(xì)胞表面和胞漿中檢測(cè)到[21]。SDF-1/CXCR4信號(hào)通路參與各種細(xì)胞過(guò)程，常見(jiàn)于調(diào)控細(xì)胞遷移[22]，CXCR4蛋白在促進(jìn)BMMSCs的遷移能力可能發(fā)揮著重要的作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù)確定了BMMSCs在骨折部位的遷移是依賴時(shí)間和CXCR4表達(dá)量的，SDF-1與BMMSCs表面的CXCR4蛋白受體結(jié)合，促進(jìn)BMMSCs的遷移能力[24-25]。所以促進(jìn)CXCR4的表達(dá)可以提高BMMSC遷移能力、加快組織修復(fù)效率[26]。目前，提高BMMSCs遷移和分化能力的有多種方法，包括支架、水凝膠構(gòu)建、基因修飾和改變細(xì)胞膜表面受體，但這些方法具有潛在的誘變和致癌風(fēng)險(xiǎn)，需要更多的研究來(lái)解決安全性問(wèn)題[27]。

近年來(lái)，BMMSCs已成為OP治療研究的主要焦點(diǎn)。中醫(yī)對(duì)OP患者進(jìn)行補(bǔ)腎治療?！鹅`樞》有云：“人始生，先成精，精成而腦髓生?！薄澳I藏精，主骨生髓”，故此從來(lái)源、分布、功能等方面發(fā)現(xiàn)“腎精”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞形似[28-29]。因此推測(cè)BMMSCs向成骨分化的調(diào)節(jié)可能是OP治療中使用的補(bǔ)腎治療的部分科學(xué)依據(jù)。進(jìn)而思考補(bǔ)腎類中藥是否可對(duì)BMMSCs的功能發(fā)揮促進(jìn)作用。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，補(bǔ)腎類中藥及補(bǔ)腎活血復(fù)方可以促進(jìn)BMMSCs增殖、定向遷移，尤其是對(duì)成骨分化作用明顯[30]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，滋陰補(bǔ)腎中藥墨旱蓮有效改善骨質(zhì)疏松模型小鼠骨密度低，骨微結(jié)構(gòu)破壞的情況。研究報(bào)道，墨旱蓮的乙酸乙酯提取物及其成分蟛蜞菊內(nèi)酯具有促進(jìn)BMMSCs增殖的作用[31]，且蟛蜞菊內(nèi)酯可以促進(jìn)BMMSCs向成骨細(xì)胞分化[32]。為“腎”與骨代謝的中醫(yī)理論提供了科學(xué)依據(jù)。因此，推測(cè)EHE可能通過(guò)調(diào)控BMMSCs的增值，遷移和分化從而發(fā)揮治療OP的作用。本研究結(jié)果顯示，EHE能促進(jìn)BMMSCs的遷移和向成骨細(xì)胞分化，顯著提高CXCR4蛋白表達(dá)。

綜上，EHE具有促進(jìn)BMMSCs遷移和向成骨分化作用，其調(diào)控BMMSCs遷移的作用機(jī)制可能與促進(jìn)CXCR4蛋白表達(dá)相關(guān)。本課題組后續(xù)將研究EHE對(duì)誘導(dǎo)BMMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制，為后續(xù)墨旱蓮治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制提供研究思路。