張凌蛟，張 眉，呂東良，劉偉東，任毅杰，趙夢(mèng)潔，陳美杰，胡建宏*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2.陜西省漢中市鎮(zhèn)巴縣漁渡鎮(zhèn)人民政府農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站，陜西 鎮(zhèn)巴 723600；3.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站，陜西 西安 710016)

為了提高種公豬的生產(chǎn)性能，人工授精技術(shù)成為生豬養(yǎng)殖必不可少的關(guān)鍵技術(shù)，而精液保存是人工授精技術(shù)的核心環(huán)節(jié)。精液保存依據(jù)保存溫度的不同又可分為常溫保存、低溫保存和冷凍保存，其中常溫保存是生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用最為廣泛的保存方式。在低溫環(huán)境下，精子的代謝水平降到最低，但仍會(huì)產(chǎn)生ROS，而過(guò)量ROS能夠引起脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而破壞對(duì)維持精子功能至關(guān)重要的膜的完整性，并導(dǎo)致精子活率下降。目前的研究表明，稀釋液中添加外源性的抗氧化劑可以有效降低ROS對(duì)精子膜的氧化損傷，從而提高精液品質(zhì)。Li等研究報(bào)道，低聚青花素能夠有效清除自由基和ROS，顯著提高豬精液總抗氧化能力。侯震坤研究表明，淫羊藿苷能夠有效防止豬精液在常溫保存時(shí)受到氧化損傷。任發(fā)的研究指出，鞣花酸對(duì)豬精液常溫保存效果起到了積極的作用。另外，Zhu等研究報(bào)道，白藜蘆醇能夠顯著提高精子抗氧化的防御系統(tǒng)功能；Tian等研究發(fā)現(xiàn)，丹參酸A能夠增強(qiáng)豬精液總抗氧化能力。

兒茶素作為一種天然酚類物質(zhì)，具有抗氧化的作用，而兒茶素中的EGCG更具有抗菌、抗炎及抗癌作用，并且具有較強(qiáng)的清除活性氧能力及金屬螯合特性。謝東淇研究指出，在豬精液稀釋液中加入茶多酚作為外源抗氧化劑，可以有效提高常溫保存精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，有效抵御過(guò)量ROS對(duì)精子的傷害。趙琦研究認(rèn)為，將沒(méi)食子酸加入豬精液稀釋液中可以起到較好的抗氧化效果。另外，Bucci等研究顯示，EGCG與白藜蘆醇配伍，可提高冷凍-解凍后豬精子活率和頂體完整率，明顯提高豬精子的抗凍效果；Tvrda等指出，牛冷凍精液稀釋液中添加表兒茶素可以顯著減少脂質(zhì)過(guò)氧化及DNA氧化損傷，提高冷凍-解凍后精子活力；Bucci等認(rèn)為，犬冷凍精液稀釋液中添加EGCG能夠有效改善犬精子的運(yùn)動(dòng)性能，提高冷凍-解凍后精子活率和頂體完整性。因此，EGCG能夠有效地減緩精液保存時(shí)精子所遭受的氧化損傷，并保護(hù)其膜完整性，從而提高精液品質(zhì)。但是，目前關(guān)于EGCG對(duì)動(dòng)物冷凍精液保存的相關(guān)研究較多，而在豬精液常溫保存的方面研究較少，所以本試驗(yàn)旨在研究不同濃度EGCG對(duì)常溫保存豬精液的影響，為豬精液常溫保存提供應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 精液 本試驗(yàn)采用的精液均來(lái)自于陜西楊凌秦亥旺養(yǎng)殖場(chǎng)，用手握法采集3頭14月齡的健康長(zhǎng)白公豬精液。精液采集時(shí)間固定于早上8：00-9：00，僅收集射精中段精子富集部分，30 min內(nèi)于墊有3層濾紙的保溫杯中送回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)原精品質(zhì)，只有氣味及顏色正常、鏡檢后活率大于80%、密度為2×10～4×10mL為合格原精，檢測(cè)合格后方可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 藥品和試劑 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，上海源葉生物有限公司生產(chǎn)；葡萄糖(分析純)、檸檬酸(分析純)等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(北京索萊寶科技有限公司)、FITC-PNA(1 MG，Sigma)、DAPI(10 mL，Solarbio)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 豬精液檢測(cè)系統(tǒng)CASA(HVIEW-SSA V8.0)，倒置熒光顯微鏡，立式壓力蒸汽滅菌器，17 ℃恒溫箱，離心機(jī)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將不同濃度EGCG添加到豬精液常溫保存基礎(chǔ)稀釋液中，其中，添加0 μmol/L(即不添加)EGCG組作為對(duì)照組；添加EGCG的處理組作為試驗(yàn)組，其添加濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L和50 μmol/L，每組有6個(gè)重復(fù)。

1.2.2 溶液配制 基礎(chǔ)稀釋液：按照配方準(zhǔn)確稱取氯化鉀、Tris、D-葡萄糖等試劑于滅菌燒杯中，隨后向燒杯中添加1 L雙蒸水。

EGCG溶液的配制：稱取20 mg EGCG，充分溶解于10 mL雙蒸水，配制成2 mg/mL的溶液，分裝于1.5 mL滅菌離心管中，用封口膜密封，錫箔紙包裹后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

原精檢驗(yàn)合格后，預(yù)熱稀釋液并根據(jù)精子密度確定稀釋比例。先將稀釋液緩緩加入原精中按照1：1的比例進(jìn)行稀釋；平衡30 s后繼續(xù)加入稀釋液以達(dá)到所需濃度；混合均勻后進(jìn)行分裝，并置于17 ℃恒溫箱中避光保存，每12 h緩慢翻動(dòng)一次。

1.3 精液質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 精子活率 精子活率采用豬精液檢測(cè)系統(tǒng)CASA(HVIEW-SSA V8.0)對(duì)常溫保存第1、3、5天的精子活率進(jìn)行檢測(cè)。用移液槍吸取100 μL保存于17 ℃恒溫箱中的精液，移入到滅菌的1.5 mL離心管中，于37 ℃水浴5 min；將載玻片與蓋玻片37 ℃預(yù)熱。將載玻片放置于恒溫載物臺(tái)，取10 μL精液滴加于載玻片上，蓋上蓋玻片，調(diào)節(jié)顯微鏡以獲得清晰圖像，并用CASA系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)計(jì)算。

1.3.2 質(zhì)膜完整率 本試驗(yàn)采用SYBR-14/PI熒光染色法對(duì)豬精液常溫保存第1、3、5天的精子質(zhì)膜完整率進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 頂體完整率 花生凝集素-異硫氰酸熒光素法染色檢測(cè)豬精液常溫保存第1、3、5天的精子頂體完整率。

1.3.4 CAT活性 鉬酸銨比色法原理檢測(cè)豬精液常溫保存第1、3和5天的CAT活性，比色波長(zhǎng)為405 nm，相關(guān)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.3.5 ROS水平 DHE-ROS活性氧檢測(cè)檢測(cè)豬精液常溫保存第1、3和5天的CAT活性，相關(guān)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.3.5 SOD活性 氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法檢測(cè)豬精液常溫保存第1、3和5天的SOD活性，相關(guān)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)常溫保存豬精子活率的影響

豬常溫保存精液稀釋液中添加不同濃度EGCG對(duì)精子活率的影響見(jiàn)表1所示。由表1可知，在保存1～5 d時(shí)，對(duì)照組與稀釋液中添加50 μmol/L EGCG組相比，精子活率無(wú)顯著差異(>0.05)。但是，20、30 μmol/L EGCG組精子活率在保存1～5 d時(shí)均顯著高于其他處理組和對(duì)照組(<0.05)，且保存到第5天時(shí)20、30 μmol/L EGCG組精子活率分別達(dá)到78.36%、76.97%。因此，稀釋液中添加EGCG對(duì)常溫保存的豬精子活率具有積極作用，且其最適添加量為20 μmol/L。

表1 豬精液常溫保存添加EGCG后的精子活率Table 1 The sperm motility of boar after adding EGCG in normal temperature

2.2 EGCG對(duì)豬精液常溫保存精子質(zhì)膜完整率的影響

豬精子質(zhì)膜完整性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。由表2可知，在保存2～4 d，添加 EGCG的處理組精子質(zhì)膜完整率顯著高于對(duì)照組(<0.05)。保存1～5 d，添加20、30 μmol/L EGCG組的精子質(zhì)膜完整率顯著高于其它組(<0.05)，且保存到第5天時(shí)質(zhì)膜完整率分別達(dá)到74.17%、73.99%。因此，稀釋液中添加一定濃度的EGCG對(duì)精子質(zhì)膜具有保護(hù)作用，且其最適添加量為20 μmol/L。

表2 豬精液常溫保存添加EGCG后的精子質(zhì)膜完整率Table 2 The plasma membrane integrity of boar sperm after adding EGCG in normal temperature

圖1 豬精子質(zhì)膜完整性檢測(cè)SYBR-14染色呈綠色熒光代表質(zhì)膜完整的精子，PI染色呈紅色熒光代表質(zhì)膜破損的精子。Scale bars=100 μmFig.1 Detection of boar sperm plasma membrane integrity The green fluorescence stained by SYBR-14 represents sperm with intact plasma membrane, and red fluorescence stained by PI represents sperm with damaged plasma membrane.Scale bars=100 μm

2.3 EGCG對(duì)常溫保存豬精子頂體完整率的影響

豬精子頂體完整性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。由表3可知，在保存第1、2、5天時(shí)，添加EGCG的處理組，精子頂體完整率均顯著高于對(duì)照組(<0.05)。添加20、30 μmol/L EGCG后，保存第1～5天的頂體完整率均顯著高于其它組(<0.05)，第5天時(shí)頂體完整率分別為63.09%和62.25%。因此，稀釋液中添加一定濃度的EGCG對(duì)精子頂體具有保護(hù)作用，且其最適添加量為20 μmol/L。

表3 豬精液常溫保存添加EGCG后的精子頂體完整率Table 3 The acrosome integrity of boar sperm after adding EGCG in normal temperature

圖2 豬精子頂體完整性檢測(cè)豬精子細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色呈藍(lán)色熒光，豬精子頂體經(jīng)FITC-PNA染色呈綠色熒光，箭頭標(biāo)記代表頂體破損的精子，三角標(biāo)記代表頂體完整的精子。Scale bars=100 μmFig. 2 Detection of boar sperm acrosome integritySperm nucleus is stained by DAPI (blue). Sperm acrosome is stained by FITC-PNA (green). Arrow represents damaged acrosome sperm. Triangle represents intact acrosome sperm.Scale bars=100 μm

2.4 EGCG對(duì)常溫保存豬精液中CAT活性的影響

豬精液CAT活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，稀釋液中添加不同濃度EGCG保存的第1、3、5天對(duì)CAT活性影響趨勢(shì)基本相同，所有添加EGCG的處理組CAT活性均高于對(duì)照組，其中20 μmol/L EGCG組CAT活性最強(qiáng)，并顯著高于其他組(<0.05)；稀釋液中添加10、30 μmol/L處理組CAT活性僅次于20 μmol/L處理組，并顯著高于其他組(<0.05)。5 μmol/L EGCG組CAT活性顯著高于對(duì)照組(<0.05)，但顯著低于10、40 μmol/L組(<0.05)。另外，稀釋液中添加EGCG的第1天豬精液中CAT活性顯著高于第3和第5天(<0.05)，且第3與第5天精液中CAT活性無(wú)顯著差異(>0.05)。

圖3 不同濃度EGCG對(duì)常溫保存豬精液中CAT活性的影響同一天數(shù)據(jù)間標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖5同F(xiàn)ig. 3 Effects of different concentrations of EGCG on CAT activities in boar semen at room temperature The data with different lowercase letters for the same day demonstrate significant difference (P<0.05), while the same lowercase letters indicate insignificant difference(P>0.05). The same for fig. 5

2.5 EGCG對(duì)常溫保存豬精液中ROS水平的影響

豬精液常溫保存第3天ROS水平見(jiàn)圖4。由圖4可知，稀釋液中添加20 μmol/L EGCG保存3 d后，精液中ROS顯著低于其他組(<0.05)；5、10、30、40 μmol/L的EGCG處理后均使精液中ROS水平降低，且與對(duì)照組相比差異顯著(<0.05)。另外，在稀釋液中添加5、10、20 μmol/L EGCG時(shí)ROS水平逐漸降低，但在添加30、40、50μmol/L EGCG后ROS水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且50 μmol/L處理組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(>0.05)。

圖4 不同濃度EGCG對(duì)常溫保存豬精液中ROS水平的影響柱上標(biāo)相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Fig. 4 Effects of different concentrations of EGCG on ROS level in boar semen at room temperature The same or the absence of letters above the columns indicate insignificant difference (P>0.05), different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)

2.6 EGCG對(duì)豬精液常溫保存SOD活性的影響

常溫保存豬精液SOD活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，稀釋液中添加不同濃度EGCG保存的第1、3和5天對(duì)SOD活性的影響趨勢(shì)基本相同，所有添加EGCG的處理組其SOD活性均高于對(duì)照組。其中20 μmol/L EGCG組SOD活性最強(qiáng)，且顯著高于其他組(<0.05)； 30 μmol/L處理組SOD活性僅次于20 μmol/L組，并顯著高于其他組(<0.05)。另外，10、40 μmol/L EGCG處理組SOD活性顯著高于對(duì)照組(<0.05)，5、50 μmol/L EGCG處理組也顯著高于對(duì)照組(<0.05)，但顯著低于10和40 μmol/L組(<0.05)。稀釋液中添加EGCG常溫保存第1天豬精液中SOD活性顯著高于第3天和第5天(<0.05)，但第3天與第5天之間精液中SOD活性無(wú)顯著差異(>0.05)。

圖5 豬精液常溫保存稀釋液中添加EGCG后豬精液SOD活性Fig. 5 SOD activities of boar semen after adding EGCG to the storage diluent of boar

3 討 論

在本試驗(yàn)中，添加EGCG可以提高常溫保存豬精液的精子活力、頂體完整率和質(zhì)膜完整率，且添加20 μmol/L EGCG對(duì)精液保存效果最好，這與Plaza的研究結(jié)果一致。Plaza報(bào)道，在公馬精液常溫保存稀釋液中加入20 μmol/L EGCG保存5 d后的精子活率為65.20%、精子質(zhì)膜完整率為59.88%、頂體完整率為60.30%，顯著高于對(duì)照組與其他處理組；Vallorani等研究發(fā)現(xiàn)，豬精液稀釋液中添加40 μmol/L EGCG在15 ℃孵育24 h后精子活率達(dá)到74.30%，質(zhì)膜及頂體完整率分別達(dá)到93.60%和95.80%；張文宇研究指出，將120 μmol/L羥基酪醇加入豬精液稀釋液中有利于精液的常溫保存，常溫保存第5天時(shí)精子活率為50.00%，質(zhì)膜和頂體完整率分別達(dá)到50.00%以上和75.00%以上。EGCG與羥基酪醇均是天然的多酚類化合物，對(duì)于生物膜的機(jī)械性能及生物活性具有保護(hù)作用，當(dāng)EGCG在生物膜中釋放時(shí)穩(wěn)定了生物膜中氫鍵的交聯(lián)作用，從而保護(hù)了精子質(zhì)膜和頂體的完整性，提高了精子活率。另外，Kaedei等研究發(fā)現(xiàn)，豬冷凍精液稀釋液中添加50 μmol/L EGCG冷凍-解凍后精子活率為50.36%。這可能是由于稀釋液中EGCG的添加改善了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，能夠抵御細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)蛋白質(zhì)硫醇基，從而在冷凍過(guò)程中保護(hù)精子。

本研究結(jié)果表明，稀釋液中添加20 μmol/L EGCG可以有效提高精子的抗氧化能力，常溫保存5 d后的精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率分別達(dá)到78.36%、74.17%和63.09%。Tian等研究表明，在豬精液稀釋液中添加30 μmol/L的丹參素可以有效提高精子保存效果，常溫保存5 d后精子活率為72.21%、質(zhì)膜完整率和頂體完整率分別達(dá)到60.00%和62.00%以上。本試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于Tian等的試驗(yàn)結(jié)果，這可能是因?yàn)镋GCG作為一種天然抗氧化劑，在精液保存時(shí)能夠更好地清除超氧化物陰離子，同時(shí)維持細(xì)胞表面雙分子層的穩(wěn)定性，從而降低了精子保存所遭受的氧化損傷，提高精子質(zhì)膜的完整性，進(jìn)而改善并提高了精液品質(zhì)。

另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著稀釋液中EGCG添加量的增加精液品質(zhì)反而下降，40 μmol/L和50 μmol/L EGCG組精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率明顯低于20 μmol/L和30μmol/L EGCG組，表明高濃度EGCG并不能對(duì)精子起到理想的保護(hù)效果，這與De Amicis等研究結(jié)果相似，其在人精液中加入20 μmol/L的EGCG 37 ℃孵育30 min精子活率達(dá)到85%以上，而60 μmol/L EGCG時(shí)精子活率不足60%。原因可能是稀釋液中較高濃度的EGCG影響了精子所處稀釋液中微環(huán)境的滲透壓，不僅降低了Bcl2、Akt和Src等調(diào)控蛋白的活性，而且調(diào)控細(xì)胞代謝的蛋白磷酸化也受到影響，破壞了精子膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致精子活率降低。關(guān)于EGCG在細(xì)胞水平和分子水平保護(hù)精子的具體機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

在精液的常溫保存過(guò)程中，因精子代謝累積產(chǎn)生的過(guò)量ROS會(huì)對(duì)精子造成氧化損傷，而豬精子中大量的不飽和脂肪酸導(dǎo)致精子對(duì)ROS十分敏感，致使精子的質(zhì)膜和頂體更易被ROS所破壞，導(dǎo)致精子活率降低，因而研究人員通過(guò)在稀釋液中添加抗氧化劑來(lái)維持精液保存過(guò)程中精子的正常功能。裴玲等證實(shí)了沒(méi)食子酸(GA)轉(zhuǎn)移電子的能力，確定了沒(méi)食子酸可以清除自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化能力；趙琦將GA作為外源性抗氧化物加入豬精液常溫保存稀釋液中，發(fā)現(xiàn)添加后抗氧化指標(biāo)均顯著提高，ROS顯著減少，精液保存質(zhì)量有所改善。本試驗(yàn)中選用的EGCG 是沒(méi)食子兒茶酚與沒(méi)食子酸形成的酯，該物質(zhì)表現(xiàn)出良好的抗氧化性，進(jìn)而保護(hù)精子降低氧化損傷，提高精液品質(zhì)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加20 μmol/L的EGCG能夠顯著提高CAT和SOD的活性。在精液常溫保存中，CAT與SOD是清除自由基的重要抗氧化酶，二者對(duì)于細(xì)胞的氧化損傷有明顯的逆轉(zhuǎn)效果。Lin等發(fā)現(xiàn)EGCG可以阻止細(xì)胞內(nèi)過(guò)量ROS的產(chǎn)生，保護(hù)線粒體免受損傷，這與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，向稀釋液中添加EGCG可以降低豬精液保存過(guò)程中的ROS含量，抵抗外界環(huán)境對(duì)精子造成的氧化應(yīng)激，從而有效防止或者降低氧化應(yīng)激對(duì)精液品質(zhì)造成的不良影響。

4 結(jié) 論

在豬精液常溫保存稀釋液中添加EGCG可以有效提高保存效果，稀釋液中添加20 μmol/L EGCG時(shí)效果最好，常溫保存第5天時(shí)精子活率可達(dá)78.36%，質(zhì)膜完整率和頂體完整率分別達(dá)到74.17%和63.09%。