鐘玉玲，代邦國(guó)，杜偉偉，張華文，李 純，史懷平

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

乳鐵蛋白(lactoferrin, LF)的大小約為80 kDa，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一種，也被叫做轉(zhuǎn)鐵蛋白。其最初是在牛奶中以鐵結(jié)合糖蛋白的形式被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)在人乳中被純化為含鐵的紅色蛋白，因此也被稱為紅蛋白。研究表明，LF廣泛存在于諸如淚液、唾液、精漿和鼻、胰、胃腸、支氣管的分泌物中，但主要還是存在于哺乳動(dòng)物乳汁中，且初乳中含量較高，常乳中含量較低。研究表明，LF在生物體的免疫調(diào)節(jié)、生理代謝、穩(wěn)態(tài)維持等方面具有重要的功能，是先天免疫的重要組成部分，可以刺激宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育，作為生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞的增殖與分化。同時(shí)，LF還具有抗癌和抗氧化活性，能夠調(diào)節(jié)癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞周期蛋白激酶的活性，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，LF能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵元素的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)，還可以作為肉類產(chǎn)品保鮮劑和動(dòng)物飼料添加劑。

目前在牛和人上對(duì)基因相關(guān)研究及其抗體制備的相關(guān)研究較多，而對(duì)于奶山羊LF蛋白抗體制備的研究報(bào)道較少，王建等通過(guò)用純化的牛LF蛋白直接免疫家兔，得到了牛LF蛋白的特異性多抗。鑒于此，本試驗(yàn)用奶山羊LF蛋白序列片段構(gòu)建了原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)，并用純化后蛋白免疫4月齡雌性新西蘭大耳兔，制備出能夠特異性識(shí)別奶山羊LF蛋白的多克隆抗體，并檢測(cè)該抗體的效價(jià)和特異性，為奶山羊LF蛋白功能的研究提供試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

奶山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMEC) 、pcDNA3.1-LF質(zhì)粒、pET-32a(+)原核表達(dá)質(zhì)粒、pMD19-T質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院奶山羊?qū)嶒?yàn)室提供；TOP10感受態(tài)細(xì)胞、BL21感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生物公司)；通用性DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、Ni-NTA Resin 蛋白純化試劑盒(南京金斯瑞生物公司)；限制性內(nèi)切酶I、d III，Prime STAR MAX-DNA 酶，T4 DNA連接酶及其buffer(大連寶生物工程公司)； DL 2000 DNA Maker、Trans2K Plus II DNA Maker與GenStar Color Prestained protein maker(北京全式金生物技術(shù)公司)；β-Actin鼠單克隆抗體、抗His-Tag鼠單克隆抗體、山羊抗兔IgG HRP和山羊抗鼠IgG HRP(北京CWBIO生物公司)；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、TMB底物顯色劑(北京天根生物公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1基因分析 將山羊()與兔()的基因序列進(jìn)行比對(duì)(NCBI blast)，篩選出差異性較大的片段。利用 DNASTAR 軟件及在線分析網(wǎng)站進(jìn)行分析：根據(jù)有無(wú)跨膜區(qū)段、靈活區(qū)域、抗原指數(shù)與表面可及性等指標(biāo)選取目標(biāo)片段；經(jīng)綜合分析，選取制備多克隆抗體的最適氨基酸序列，基于目的蛋白的特性選擇合適的表達(dá)體系。

1.2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建 通過(guò)1.2.1中的分析結(jié)果選取基因CDS區(qū)第930～1209位序列共279 bp片段做原核表達(dá)，選擇pET-32a(+)質(zhì)粒并根據(jù)合適的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物L(fēng)FF、LFR擴(kuò)增片段。

LFF：5'-CCCAAGCTTATGCCAGAAGGCCGGAGGGACCTGCTAT-3'，LFR：5'-CCGCTC GAGTTAACCAGGGCGATGCAGTCGTCGGTGG-3'，下劃線部分分別為Ⅲ和Ⅰ酶切位點(diǎn)。以實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的pcDNA3.1-LF質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增奶山羊LF第930～1209位序列，反應(yīng)體系為：2×Prime STAR MAX 10 μL， pcDNA3.1-LF質(zhì)粒0.2 μL，LFF primer 0.5 μL, LFR primer 0.5 μL，ddHO 8.8 μL，總體積20 μL。常規(guī)PCR后，將產(chǎn)物于 12 ℃保存。電泳檢測(cè)并回收目的片段。

將空白質(zhì)粒與目的片段的雙酶切產(chǎn)物連接，組成原核表達(dá)載體pET-32a(+)-LF。將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取菌液中的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。根據(jù)鑒定結(jié)果，將鑒定正確的質(zhì)粒送測(cè)序公司做進(jìn)一步測(cè)序。

1.2.3 誘導(dǎo)及鑒定 將測(cè)序正確的質(zhì)粒和空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌，接種于固體培養(yǎng)基，挑菌于液體LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。 取100 μL菌液與10 mL液體LB培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，檢測(cè)菌液OD值在0.4～0.6。將上述2種菌液以有無(wú)加入IPTC(0.5 mmol/L)各自分為處理組和對(duì)照組，37 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，離心取其沉淀，制備成蛋白樣并進(jìn)行電泳和染色檢驗(yàn)。用免疫印跡法鑒定重組蛋白，用鼠單抗(抗His-tag)為一抗，羊抗鼠多抗(HRP標(biāo)記)為二抗，通過(guò)ECL曝光顯影觀察是否具有His標(biāo)簽，確定重組蛋白的表達(dá)。將上一步收集的菌體沉淀進(jìn)行超聲破碎，離心，將沉淀和上清分別置于離心管中，用5×SDS laoding buffer混合，制備成蛋白樣進(jìn)行電泳分析。

1.2.4 LF蛋白的純化 將目的蛋白菌液1 000 mL離心棄上清，加入超聲保護(hù)液混勻后進(jìn)行超聲破碎，再次離心后非變性重組蛋白存在于上清中，用親和層析介質(zhì)純化該蛋白。將重組蛋白于配制好的洗滌液(pH 8.0)中洗脫，取Ni柱吸附前后溶液及3次洗脫液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳與考馬斯亮藍(lán)染色，檢測(cè)蛋白純化的程度，并對(duì)其進(jìn)行透析和濃度測(cè)定。

1.2.5 LF純化蛋白的免疫注射 將弗氏完全佐劑(Freund complete adjuvant，F(xiàn)CA)和LF純化蛋白進(jìn)行等體積混合乳化，皮下6點(diǎn)注射免疫4月齡雌性新西蘭大耳兔，第1次注射2周后再用LF純化蛋白和弗氏不完全佐劑(Freund incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)等體積混合乳化，進(jìn)行第2次注射，10 d后用FIA與LF純化蛋白混合物進(jìn)行第3次注射，之后每隔10 d注射1次，方法與2次免疫相同，每次每只兔接受注射蛋白的量均為0.8 mg。第5次注射后1周，采集足夠的血液，離心后收集上層血清，用于檢測(cè)抗體效價(jià)與特異性。用上述步驟中的洗脫液注射對(duì)照兔，其他條件與試驗(yàn)組保持一致。

1.2.6 LF多克隆抗體的效價(jià)和特異性檢測(cè) 將對(duì)照兔血清和LF蛋白抗血清按照1:10,1:10,1:10,..., 1:10的比例稀釋作為一抗。將LF純化蛋白調(diào)整到濃度為10 μg/mL, 96孔板內(nèi)各孔的操作如下：(1)加100 μL LF純化蛋白，4 ℃放置12 h；(2)再加150 μL 封閉液， 37 ℃恒溫放置2 h；(3)將96孔板內(nèi)液體棄去，洗滌后加入100 μL先前制備好的血清，37 ℃保存1 h；(4)棄去孔內(nèi)液體，PBS洗滌3次，加入150 μL IgG-HRP(1∶1000稀釋)，37 ℃，30 min；(5)拍干孔內(nèi)液體，PBS 3次，加入200 μL TMB顯色液，37 ℃避光1 h；(6)加入終止液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值, 處理組吸光度/對(duì)照組吸光度>2.5可確定抗體有效。

以LF原核表達(dá)蛋白、奶山羊乳腺上皮細(xì)胞蛋白為樣品,以β-Actin作為內(nèi)參，用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜后，常溫封閉4 h，洗脫3次， 4 ℃過(guò)夜孵育β-actin鼠單抗，洗滌后用山羊抗鼠多抗室溫孵育2 h, 洗滌后用ELC進(jìn)行結(jié)果觀察；用一抗稀釋液將血清稀釋500倍，用來(lái)孵育轉(zhuǎn)有LF原核表達(dá)蛋白、山羊乳腺上皮細(xì)胞蛋白的膜，4 ℃孵育12 h。同時(shí)，對(duì)照組為用陰性血清孵育轉(zhuǎn)有GMEC蛋白的膜，以山羊抗兔多抗作為二抗，將其在室溫條件下孵育到洗凈的NC膜上，孵育時(shí)間為2 h，最后通過(guò)ELC曝光觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 LF基因的生物信息學(xué)分析

蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果見(jiàn)圖1。由于山羊基因全長(zhǎng)無(wú)跨膜區(qū)段，因此整段序列都適合用來(lái)制備抗體。根據(jù)該序列的表面可及性分析及其靈活性的分析圖譜顯示，N端25～100位氨基酸、中間240～450位氨基酸及C端540～670位AA序列的表面可及性良好，更有可能暴露在蛋白表面，便于被抗原識(shí)別(圖2)。而通過(guò)抗原指數(shù)分析結(jié)果表明，基因全長(zhǎng)的抗原指數(shù)都較高，全部序列都具有明顯的抗原決定簇特征(圖3)。

圖1 LF蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.1 Transmembrane domain of LF protein

圖2 LF序列的表面可及性與靈活性分析Fig.2 Surface probability and flexibility plot for LF

圖3 LF蛋白抗原決定簇Fig.3 The prediction of antigenic index for LF

在NCBI上將奶山羊的LF序列與兔子的LF序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示二者序列的同源性為74%，其中LF兩端的序列與兔的同源性較高，不能用來(lái)制備抗體。因此選擇中間第311～403位氨基酸序列來(lái)進(jìn)行抗體制備。對(duì)該段序列中潛在的稀有密碼子篩查結(jié)果表明，序列中有4個(gè)稀有密碼子(圖4)，可能會(huì)對(duì)蛋白的表達(dá)造成限制，而Rosseta系列菌株可以補(bǔ)充這一缺陷，能夠提高真核質(zhì)粒在原核體系中的表達(dá)效率。該段所選序列表達(dá)的蛋白大小預(yù)測(cè)值為10.1 kDa。

圖4 LF蛋白序列的稀有密碼子稀有密碼子Fig.4 The analysis of rare coden for LF Rare codon

2.2 pET32a(+)-LF原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用實(shí)驗(yàn)室保存的pcDNA3.1-LF質(zhì)粒當(dāng)?shù)孜铮脦盖形稽c(diǎn)的引物進(jìn)行目的片段的克隆，電泳結(jié)果顯示，在297 bp(含有18 bp的酶切位點(diǎn))處有目的條帶 (圖5A)。對(duì)pET32a(+)-LF重組質(zhì)粒進(jìn)行Ⅰ、Ⅲ雙酶切鑒定，在約300 bp處顯示有載體片段(圖5B)。測(cè)序結(jié)果顯示，片段已成功與原核表達(dá)載體連接。

圖5 奶山羊LF片段擴(kuò)增(A)及pET32a(+)-LF重組質(zhì)粒鑒定(B)M1. DL 2000 DNA Maker; 1. LF片段PCR產(chǎn)物;M2. Trans2K Plus II DNA Maker; 2. pET32a(+)-LF質(zhì)粒酶切產(chǎn)物Fig. 5 PCR amplification of LF fragment (A) and identification of pET32a(+)-LF recombined vector (B)M1. DL 2000 DNA Maker; 1. PCR product of LF fragment;M2. Trans2K Plus II DNA Maker; 2. Enzymatic digestion of recombined vector pET32a(+)-LF

2.3 奶山羊LF截短蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入pET32a(+)-LF重組質(zhì)粒的3～8泳道檢測(cè)到29 kDa左右的LF重組蛋白條帶，而對(duì)照組的空載體蛋白樣在相同的大小無(wú)融合蛋白條帶，僅出現(xiàn)19 kDa大小的標(biāo)簽蛋白條(圖 6A)。利用anti-His tag鼠單抗作一抗，山羊抗鼠IgG做二抗，通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)目的蛋白的His tag，結(jié)果表明LF截短型蛋白在BL21大腸桿菌中正確表達(dá)(圖6B)。

圖6 奶山羊LF重組蛋白的SDS-PAGE鑒定(A)及Western blot檢測(cè)(B)M. GenStar Color Prestained蛋白maker；1. 重組質(zhì)粒菌液誘導(dǎo)前；2. 空載體菌液誘導(dǎo)后；3～8.重組質(zhì)粒菌液誘導(dǎo)后; 9. pET32a (+)- LF原核表達(dá)蛋白樣品Fig. 6 SDS-PAGE (A) and Western blot identification of LF recombinant protein from dairy goat M. GenStar Color Prestained protein maker; 1. pET32a (+)- LF before induction; 2. pET32a (+) after induction;3～8. pET32a (+)- LF after induction; 9. prokaryotic expression protein of pET32a (+)-LF

2.4 奶山羊LF重組蛋白的純化

在16 ℃、26 ℃和37 ℃ 3個(gè)溫度,2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 5個(gè)誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng),0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L和2.0 mmol/L 5種濃度IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)目標(biāo)蛋白，并對(duì)不同條件下得到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果表明：在溫度為37 ℃，IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為4 h的條件下，誘導(dǎo)表達(dá)的效果最佳。

在最適條件下，誘導(dǎo)出大量的LF菌液，并將其離心，倒掉上清，在沉淀中加入超聲保護(hù)液混勻后進(jìn)行超聲破碎，并再次離心，將離心后的上清和沉淀分別制備成蛋白樣進(jìn)行蛋白電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后發(fā)現(xiàn)，目的蛋白大部分都以可溶形式存在于上液清中(圖7A)，并未形成難溶的包涵體。使用Ni-NTA Resin進(jìn)行蛋白純化發(fā)現(xiàn)，在29 kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶(圖7B)；進(jìn)一步純化后檢測(cè)，LF重組蛋白純度在98%以上，蛋白濃度為2.2 mg/mL。

圖7 奶山羊LF重組蛋白的純化

2.5 奶山羊LF蛋白多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)

免疫流程結(jié)束后，采集新西蘭大耳兔全血，使用iELISA方法對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組兔子的血清效價(jià)進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果表明制備的血清抗體效價(jià)達(dá)1:10(圖8)。

圖8 iELISA測(cè)定LF蛋白多克隆抗體效價(jià)Fig. 8 iELISA determined the titer of polyclonal antibody against LF protein

2.6 奶山羊LF蛋白多克隆抗體的特異性檢測(cè)

將制備好的多克隆抗體用脫脂奶粉5%稀釋500倍后進(jìn)行Western blot分析檢測(cè)。以原核表達(dá)的截短LF重組蛋白為樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在分子量29 kDa處出現(xiàn)明顯的條帶(圖9A)。以乳腺上皮細(xì)胞蛋白樣為樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在大概80 kDa處檢測(cè)到單一的蛋白條帶(圖9B),這表明制備的抗體不僅能夠識(shí)別選取片段表達(dá)的截短蛋白，也能夠識(shí)別奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中LF蛋白。同時(shí)對(duì)照組的NC膜在相同位置則沒(méi)有顯示(圖9C)。以上結(jié)果顯示，制備的山羊LF抗體對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中的LF蛋白具有較好的特異性。

圖9 LF蛋白多克隆抗體的特異性檢測(cè)A. 原核表達(dá)的LF重組蛋白(以抗血清為一抗)；B. 山羊乳腺上皮細(xì)胞蛋白樣(以抗血清為一抗)；C. 山羊乳腺上皮細(xì)胞蛋白樣(以陰性血清為一抗);M. GenStar Color Prestained 蛋白maker;1～2. 原核表達(dá)的LF重組蛋白；3～4. 山羊乳腺上皮細(xì)胞蛋白樣；5～6. 山羊乳腺上皮細(xì)胞蛋白樣Fig. 9 Specific detection of LF protein polyclonal antibodiesA. Prokaryotically expressed LF recombinant protein (rabbit positive serum as primary antibodies); B. Goat mammary epithelial protein (rabbit positive serum as primary antibodies); C. Goat mammary epithelial protein (rabbit negtive serum as primary antibodies) M. GenStar Color Prestained protein maker; 1～2. Prokaryotically expressed LF recombinant protein;3～4. Goat mammary epithelial protein; 5～6. Goat mammary epithelial protein

3 討 論

羊奶中含有多種生物活性物質(zhì),LF就是其中一種重要的多功能乳蛋白，它能夠利用自身特殊的蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合鐵離子，維持機(jī)體內(nèi)鐵的動(dòng)態(tài)平衡，還具有強(qiáng)大的防止細(xì)菌真菌感染作用、抗炎作用和抗癌作用。在機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，LF在宿主對(duì)傳染源的防御中起重要的作用。相關(guān)研究報(bào)道，LF可以通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)毒素主要成分-脂多糖的lipid A結(jié)合，來(lái)抑制TLR4信號(hào)通路，降低IL-8、IL-6、IL-1β等促炎癥因子的分泌，提高抗炎因子IL-10的水平，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的效果。由于LF具有許多重要的生物學(xué)功能，因此對(duì)LF基因在體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控的研究具有重要的意義，目前的研究結(jié)果顯示，LF的表達(dá)受到營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育和生長(zhǎng)因子等外源性因子以及轉(zhuǎn)錄因子、核受體等內(nèi)在性因子的影響，但LF表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究十分稀少。因此，制備針對(duì)LF蛋白的有效抗體顯得十分必要。

本研究在選擇作為抗原進(jìn)行表達(dá)的序列時(shí)，對(duì)LF全長(zhǎng)序列進(jìn)行了跨膜區(qū)域、表面可及性、靈活性及抗原指數(shù)等方面的詳細(xì)分析。結(jié)果表明，N端311-403位共92個(gè)氨基酸序列與兔的乳鐵蛋白序列差異較大，且親水性、表面可及性、靈活性較好，并且通過(guò)后續(xù)的免疫試驗(yàn)證明，所選的抗原具有良好的免疫原性，滿足作為抗原制備抗體的條件。

在原核表達(dá)載體的選擇上，與pQE、pMAL、pBV、pGEX等系列表達(dá)載體相比較，最終選擇了pET系列載體中的pET-32a (+)表達(dá)體系，因?yàn)樵擉w系表達(dá)出重組蛋白的能力較高且該載體的酶切位點(diǎn)與目的序列中的酶切位點(diǎn)相匹配。同時(shí)該載體上還帶有6個(gè)His標(biāo)簽，能夠附著在所表達(dá)的蛋白尾部，這一特點(diǎn)在下一步的蛋白鑒定和純化試驗(yàn)中提供了極大的便利。在對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在未進(jìn)行誘導(dǎo)的蛋白泳道，也會(huì)在相應(yīng)位置出現(xiàn)少量蛋白條帶，可能是由于液體培養(yǎng)基的成分之一——胰蛋白胨中含有少量的乳糖，可以與IPTG一樣對(duì)原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，因此電泳時(shí)也會(huì)出現(xiàn)少量本底表達(dá)。

在對(duì)LF重組蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，蛋白被檢測(cè)到的大小的位置略小于預(yù)測(cè)值，而被檢測(cè)蛋白預(yù)測(cè)的分子量為29 kDa,可能是由于電泳顯示的蛋白大小與理論計(jì)算值存在偏差，此外，蛋白樣的不同上樣體積也可能對(duì)蛋白電泳速度造成影響。在對(duì)制備的抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)時(shí)，使用奶山羊乳腺上皮細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳鐵蛋白全長(zhǎng)80 kDa處出現(xiàn)了清晰單一的條帶，而使用對(duì)照組血清作為一抗時(shí)，在相同位置沒(méi)有出現(xiàn)條帶，這表明本次試驗(yàn)制備的LF兔抗山羊多克隆抗體能夠?qū)δ躺窖蛉橄俳M織中的LF蛋白進(jìn)行特異性識(shí)別。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)對(duì)基因序列進(jìn)行生物學(xué)分析，選擇了最適合制備抗體的序列并進(jìn)行克隆，用鑒定正確的序列構(gòu)建原核表達(dá)載體。在BL21大腸桿菌中以最適的條件(37 ℃， IPTG 0.05 mmol/L, 4 h)成功誘導(dǎo)表達(dá)出了LF截短型蛋白。以該蛋白為抗原制備出了針對(duì)奶山羊LF蛋白的多克隆抗體，效價(jià)檢測(cè)結(jié)果顯示該抗體效價(jià)達(dá)到1:10, Western blot 結(jié)果顯示該抗體的特異性良好，可以用作LF基因功能研究的試驗(yàn)材料。