■劉晏榕 張麗元，2 郭永鵬 彭青云 馬秋剛 張建云 計(jì) 成 趙麗紅*

（1.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.河南省農(nóng)業(yè)對(duì)外經(jīng)濟(jì)合作中心，河南 鄭州 450003；3.建明工業(yè)（珠海）有限公司，廣東 珠海 519040）

自2020年7月1日起，我國(guó)開(kāi)始全面禁抗，因此，養(yǎng)殖業(yè)對(duì)綠色飼料添加劑的需求增加，植物提取物因具有來(lái)源豐富、安全無(wú)殘留且易于加工等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為了近年來(lái)代替畜禽飼料中飼用抗生素的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)在豬、雞和羊的養(yǎng)殖中應(yīng)用植物提取物代替飼料中抗生素的研究越來(lái)越多[1-3]。牛至（Origanum vulgareL.）是一種唇形科牛至屬多年生草本植物，含有30多種抗菌化合物，具有廣譜抗菌性，是一種潛在的天然抗生素和藥物促生長(zhǎng)劑[4]。牛至油是從牛至植物中提取的揮發(fā)油，香芹酚和百里香酚作為牛至油中的主要有效成分，具有較強(qiáng)的抗菌和抗氧化作用，在畜禽養(yǎng)殖中可有效防治消化系統(tǒng)細(xì)菌性疾病，尤其對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌引起的感染有效，并可預(yù)防球蟲(chóng)病[5]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加百里香酚和香芹酚可以提高肉雞血清新城疫病毒抗體效價(jià)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。此外，因牛至提取物具有獨(dú)特芳香氣味，在飼料中補(bǔ)充適量牛至提取物可以增強(qiáng)動(dòng)物食欲，提高采食量，同時(shí)促進(jìn)胃腸道消化[7]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)關(guān)于牛至提取物在畜禽生產(chǎn)性能、繁育性能及抗氧化性能中的作用已被闡明，對(duì)牛至提取物在肉雞屠宰性能、免疫調(diào)節(jié)功能方面的作用也做了一些研究，但結(jié)果不一致，同時(shí)比較天然和合成牛至提取物作用效果的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)在飼糧中分別添加飼用抗生素和牛至提取物，比較其對(duì)肉雞屠宰性能和免疫機(jī)能的影響，同時(shí)對(duì)比天然和人工合成牛至提取物的作用效果，進(jìn)一步明確牛至提取物替代抗生素作為飼料添加劑的應(yīng)用效果，以期為牛至提取物在肉雞生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2017年3月12日在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州試驗(yàn)基地進(jìn)行。將384 只1 日齡AA 肉仔雞隨機(jī)分為4 組：即空白對(duì)照組（飼喂基礎(chǔ)飼糧）、抗生素對(duì)照組（基礎(chǔ)飼糧+20 mg/kg硫酸黏菌素+20 mg/kg維吉尼亞霉素）、試驗(yàn)1 組（基礎(chǔ)飼糧+200 mg/kg 天然牛至提取物）和試驗(yàn)2 組（基礎(chǔ)飼糧+200 mg/kg 合成牛至提取物），每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)16只雞。

1.2 試驗(yàn)飼糧及飼養(yǎng)管理

日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)動(dòng)物自由采食和飲水，每天定時(shí)觀察雞的健康狀況。試驗(yàn)期定時(shí)對(duì)雞舍進(jìn)行消毒，并保持通風(fēng)，初始溫度設(shè)定為32 ℃，此后每周降低2 ℃至22～25 ℃為止，光照以自然照明為主，人工照明為輔。試驗(yàn)所用硫酸黏菌素購(gòu)自山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司（批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥原字150092214）；維吉尼亞霉素購(gòu)自美國(guó)輝寶有限公司（證書(shū)號(hào)：外獸藥證字35號(hào)）；天然牛至提取物購(gòu)自建明工業(yè)（珠海）有限公司，有效成分百里香酚和香芹酚實(shí)際檢測(cè)值分別為2.64%和1.30%；合成牛至提取物是以化工合成的百里香酚和香芹酚為原料的預(yù)混劑，其有效成分含量與天然牛至提取物相同，其中百里香酚和香芹酚均購(gòu)自Sigma 公司，純度為98%以上。合成牛至提取物的制備工藝及有效百里香酚和香芹酚含量與天然牛至提取物相同。不同的是，天然牛至提取物中的百里香酚和香芹酚來(lái)自天然牛至無(wú)性系品種中提取的精油，而合成牛至提取物中的百里香酚和香芹酚是化學(xué)合成的。制備過(guò)程中分別將天然或合成牛至提取物吸附于二氧化硅上，并以脫脂米糠為載體進(jìn)行稀釋。

表1 試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 屠宰性能

42 d試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取2只體重相近的肉仔雞，禁食12 h 以后稱(chēng)重，并通過(guò)頸靜脈放血處死，稱(chēng)量肉仔雞的屠體重，隨后去毛稱(chēng)量胴體重。參考《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語(yǔ)和度量統(tǒng)計(jì)方法》計(jì)算屠宰率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率[8]。

1.3.2 免疫器官指數(shù)的測(cè)定

試驗(yàn)第42 d 處死肉仔雞后，迅速剖取胸腺、脾臟和法氏囊等免疫器官，并稱(chēng)取重量。

免疫器官指數(shù)（mg/g）=免疫器官重（mg）/活雞體重（g）

1.3.3 血清中免疫球蛋白及補(bǔ)體含量的測(cè)定

試驗(yàn)第42 d時(shí)，每個(gè)重復(fù)各挑選2只接近其體重均值的肉仔雞，翅靜脈采血，于4 ℃下3 000 r/min 離心，制備血清，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法測(cè)定每組肉雞血清中免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和補(bǔ)體C3、C4的含量。試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3.4 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

試驗(yàn)第21 d和42 d，每個(gè)重復(fù)各挑選2只接近其體重均值的肉仔雞，翅靜脈采血，用D-Hanks液稀釋?zhuān)?jīng)密度梯度離心分離淋巴細(xì)胞，采用MTT法測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，即取100 μL 外周血淋巴細(xì)胞液置于96孔板中，加入100 μL 10 μg/mL的ConA或LPS（其中ConA 用于測(cè)定T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，LPS 用于測(cè)定B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率），于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)44 h 時(shí)向每孔中加入20 μL 5 mg/mL 的MTT，培養(yǎng)結(jié)束后加入150 μL DMSO，待紫色結(jié)晶完全溶解后，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（%）=100×試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行LSD多重比較，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至提取物對(duì)肉仔雞屠宰性能的影響（見(jiàn)表2）

表2 牛至提取物對(duì)肉仔雞屠宰性能的影響（%）

由表2 可見(jiàn)，與空白對(duì)照組及抗生素對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉仔雞屠宰性能均無(wú)顯著差異（P>0.05）。

2.2 牛至提取物對(duì)肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響（見(jiàn)表3）

表3 牛至提取物對(duì)肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響（mg/g）

由表3 可見(jiàn)，與空白對(duì)照組或抗生素對(duì)照組相比，飼糧中添加天然牛至提取物或合成牛至提取物對(duì)肉仔雞的免疫器官指數(shù)均無(wú)顯著影響（P>0.05）。

2.3 牛至提取物對(duì)肉仔雞血清免疫球蛋白及補(bǔ)體含量的影響（見(jiàn)表4）

由表4 可見(jiàn)，與空白對(duì)照組相比，在飼糧中添加天然牛至提取物或合成牛至提取物顯著提高血清中IgA、IgM、IgG、補(bǔ)體C3 和補(bǔ)體C4 的含量（P<0.05）；與抗生素對(duì)照組相比，在飼糧中添加合成牛至提取物顯著提高血清中IgM 的含量（P<0.05），在飼糧中添加天然牛至提取物顯著提高血清中補(bǔ)體C4 的含量（P<0.05）。

表4 牛至提取物對(duì)肉仔雞血清免疫球蛋白及補(bǔ)體含量的影響（g/L）

2.4 牛至提取物對(duì)肉仔雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響（見(jiàn)表5）

表5 牛至提取物對(duì)肉仔雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響（%）

由表5 可見(jiàn)，在試驗(yàn)期第21 d，與空白對(duì)照組相比，在飼糧中添加天然牛至提取物或合成牛至提取物顯著提高T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（P<0.05）；在試驗(yàn)期第42 d，與空白對(duì)照組相比，在飼糧中添加天然牛至提取物或合成牛至提取物顯著提高T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（P<0.05）。

3 討論

抗生素主要通過(guò)抑制腸道有害微生物的生長(zhǎng)，間接影響畜禽的組織結(jié)構(gòu)以及生理代謝，起到促生長(zhǎng)的作用，但其在提高畜禽生產(chǎn)性能的同時(shí)，引發(fā)的藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等問(wèn)題給畜禽和人類(lèi)健康帶來(lái)了安全隱患。因此，為避免抗生素殘留給畜禽和人類(lèi)健康帶來(lái)的危害，解決食品安全問(wèn)題，研究開(kāi)發(fā)可以替代抗生素的新型綠色、無(wú)公害飼料添加劑已經(jīng)成為各國(guó)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家研究的主要方向之一。牛至提取物因其中的活性成分如香芹酚和百里香酚等具有抑菌活性而被認(rèn)為具有替代抗生素的潛力，近年來(lái)逐漸受到關(guān)注。本課題組前期研究已表明，在肉仔雞飼糧中添加牛至提取物可以改善其腸道免疫功能，提高機(jī)體抗氧化能力，從而促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)[9]。

屠宰性能各項(xiàng)指標(biāo)反映動(dòng)物機(jī)體對(duì)于飼料添加劑在體內(nèi)代謝的差異，一般用于衡量添加劑在動(dòng)物生產(chǎn)中帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益[10]。目前已有研究表明，牛至提取物作為一種綠色添加劑對(duì)于家禽屠宰性能具有一定促進(jìn)作用[11-12]。彭青云等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞日糧中補(bǔ)充200 mg/kg牛至油可以顯著提高半凈膛率并降低腹脂率，補(bǔ)充300 mg/kg 牛至油可以顯著提高屠宰率、全凈膛率和半凈膛率，同時(shí)降低肉雞腹脂率。Peng 等[12]在肉雞日糧中添加300 mg/kg 或600 mg/kg牛至油后，肉雞在42 d 時(shí)的屠宰率、全凈膛率和腿肌率均顯著提高。但也有研究表明，在肉雞日糧中添加百里香植物提取物對(duì)其屠宰率、胸肌率、腿肌率和腹脂率均無(wú)顯著影響[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，在日糧中補(bǔ)充天然牛至提取物和合成牛至提取物雖然對(duì)肉仔雞屠宰性能無(wú)顯著影響，但有改善作用，與上述其他研究中關(guān)于牛至提取物的結(jié)果不完全相同。這表明牛至提取物在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)于肉雞屠宰性能的作用效果可能不穩(wěn)定，可能與牛至提取物的加工類(lèi)型和其中的有效成分含量相關(guān)，在今后的研究中需更多屠宰試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

動(dòng)物的免疫器官是其機(jī)體抵抗體外病原微生物侵入體內(nèi)的重要屏障，家禽的免疫器官除胸腺和脾臟外還包括法氏囊[14]。免疫器官指數(shù)指的是免疫器官的相對(duì)重量，可以用來(lái)反映動(dòng)物機(jī)體在特定條件下的免疫狀況，免疫指數(shù)提高說(shuō)明機(jī)體的免疫性能增加，免疫器官指數(shù)下降說(shuō)明機(jī)體免疫性能減弱。王秋梅[15]在肉仔雞飼糧中添加100～150 mg/kg 牛至油顯著增加了脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)，但不影響胸腺指數(shù)。彭青云等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞飼糧中添加200～300 mg/kg 牛至油顯著增加了胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)，但不影響脾臟指數(shù)。本研究與其他學(xué)者的試驗(yàn)結(jié)果不完全一致，本研究中牛至提取物對(duì)血清免疫指標(biāo)和外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均有影響，但對(duì)免疫器官指數(shù)的影響不顯著，可能說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，牛至提取物對(duì)肉仔雞的免疫性能具有一定的改善效果，但對(duì)免疫器官發(fā)育的促進(jìn)作用較小，啟示我們牛至提取物對(duì)肉仔雞免疫性能的影響有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，飼糧中補(bǔ)充牛至提取物可以增加肉仔雞血清中IgA、IgM、IgG、補(bǔ)體C3 和補(bǔ)體C4 的含量，與王亮等[16]在仔豬日糧中添加牛至油提高血清免疫球蛋白水平以及郝丹丹等[17]在蛋雞日糧中添加牛至油提高血清免疫球蛋白和補(bǔ)體水平的結(jié)果一致。免疫球蛋白是血清中的抗體，在動(dòng)物機(jī)體的體液免疫中發(fā)揮主要作用，補(bǔ)體活化后具有免疫學(xué)活性，也是免疫反應(yīng)的重要組成部分[18]。本研究中添加牛至提取物后肉仔雞血清中免疫球蛋白和補(bǔ)體水平增加，表明牛至提取物可以增強(qiáng)肉仔雞機(jī)體體液免疫功能。

除體液免疫外，細(xì)胞免疫也是機(jī)體清除抗原的重要方式。淋巴細(xì)胞主要包括T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞主要在體液免疫中發(fā)揮作用，T淋巴細(xì)胞則主要在細(xì)胞免疫中發(fā)揮作用。動(dòng)物體受外界抗原刺激時(shí)，體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖，然后T 淋巴細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化成效應(yīng)淋巴細(xì)胞，以清除抗原。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率影響免疫調(diào)節(jié)平衡，因此本研究通過(guò)外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率來(lái)體現(xiàn)飼糧中添加牛至提取物后肉仔雞免疫功能的變化情況。郝丹丹等[17]在成年蛋雞試驗(yàn)中證明，牛至油可以提高成年蛋雞脾臟T淋巴細(xì)胞亞群CD4+的百分比，有助于T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖分化及抗體的產(chǎn)生。王秋梅[15]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中補(bǔ)充牛至油，42 d時(shí)肉仔雞的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著提高。武晶等[19]在飼糧中添加牛至油，長(zhǎng)大雜交閹公豬血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著提高。在本試驗(yàn)中，飼糧添加天然或合成牛至提取物顯著增加肉仔雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，與抗生素對(duì)照組的效果相當(dāng)，且與前人研究結(jié)果相似。可見(jiàn)，飼糧添加牛至提取物能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，具有提高肉仔雞體液和細(xì)胞免疫力的作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，在飼糧中添加200 mg/kg牛至提取物對(duì)肉仔雞屠宰性能的改善效果不顯著，但提高了其血清免疫性能并促進(jìn)了外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，達(dá)到了與抗生素同樣的效果，此外，天然牛至提取物和合成牛至提取物在提高肉仔雞免疫性能方面的作用效果相似。