■白勇昌 肖明霞 趙 平 陳德近 程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201；2.愛科特生物工程（昆明）有限公司，云南 昆明 650506）

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2020 年7 月1 日始禁止促生長類藥物飼料添加劑的使用，包括益生菌凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）在內(nèi)的替抗功能性添加劑成為行業(yè)應(yīng)用的熱點（葛長榮等，2019；王乙茹等，2019a；夏濤等，2019a；柳成東等，2020）。目前，大量飼養(yǎng)試驗表明凝結(jié)芽孢桿菌能夠顯著改善1～42 日齡AA 肉雞生長性能（Hung等，2012；林麗花等，2014；曹廣軍等，2016；孫煥林等，2014；趙娜等，2017；王乙茹等，2019a；夏濤等，2019a；嚴濤等，2019）；然而也有少量報道發(fā)現(xiàn)，21～42 日齡階段肉雞應(yīng)用凝結(jié)芽孢桿菌對生長性能沒有明顯的改善作用（宮秀燕等，2015a；宮秀燕等，2015b；Wu 等，2018；Zhen 等，2018；Li 等，2019）。以上飼養(yǎng)試驗矛盾的結(jié)果提示：除試驗階段因素外，試驗用凝結(jié)芽孢桿菌及其抑菌性能的不同，可能是肉雞生長性能表現(xiàn)差異的關(guān)鍵原因之一（夏濤等，2018；夏濤等，2019b；柳成東等，2021）。張韻等（2017）采用體外抑菌試驗表明，其篩選的4株凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號：BC147、BC235、BC310、BC303）對大腸桿菌、雞腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等腸道有害菌的抑制作用差異顯著。鑒于以往所有的試驗報道，只是單一通過飼養(yǎng)試驗評估凝結(jié)芽孢桿菌的應(yīng)用效果，沒有同時開展凝結(jié)芽孢桿菌的體外抑菌試驗研究。因此，文章首次結(jié)合飼養(yǎng)試驗和體外抑菌試驗，重點評估21～42日齡階段肉雞飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌對生長性能、免疫器官及腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號：YNAU 5517）及制劑由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供（王乙茹等, 2019b；王乙茹等，2020）。體外抑菌試驗所用材料，包括指示菌大腸桿菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）及羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）、金霉素和土霉素，均由昆明三正生物科技（集團）有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

按體重一致原則將160 只21 日齡健康A(chǔ)A 肉公雞分為2個處理組。每個處理組10個重復(fù)，每個重復(fù)（單籠）8只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加凝結(jié)芽孢桿菌，添加量4×106CFU/g全價配合飼料（王乙茹等，2019b）。

1.3 試驗飼糧

參考《雞飼養(yǎng)標準》（NY/T 33—2004）并結(jié)合云南省AA 肉雞實際養(yǎng)殖特點配制試驗日糧，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1，不添加抗生素、其他飼用益生菌及功能性替抗添加劑。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗雞場進行。試驗雞全程籠養(yǎng)，24 h光照，自由采食與飲水，執(zhí)行正常免疫程序。及時進行清糞與消毒，保證雞舍良好的衛(wèi)生環(huán)境，實時觀察雞群健康情況，及時進行記錄和治療。試驗周期是肉雞21～42日齡。

1.5 測定指標

1.5.1 生長性能以重復(fù)為單位統(tǒng)計肉雞平均日增重、平均日采食量及料重比（王乙茹等，2020）。

1.5.2 免疫器官指數(shù)

至肉雞42 日齡，每籠隨機挑選1 只肉雞屠宰，取脾臟、胸腺、法氏囊稱重。免疫器官指數(shù)為該器官重量除以活體重的百分數(shù)（Zhang等，2019）。

1.5.3 腸道菌群測定

取盲腸食糜于EP 管內(nèi)，液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存，用于大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量檢測。采用平板計數(shù)法檢測大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，檢測結(jié)果用log值表達（黃遵錫等，2020）。

1.5.4 凝結(jié)芽孢桿菌抑菌作用的體外試驗評估

以金霉素（Ⅰ組）、土霉素（Ⅱ組）為參照，采用牛津杯法測定抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ），對比評估本試驗所用凝結(jié)芽孢桿菌（Ⅲ組）對大腸桿菌K88、羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用。參照李靜舒等（2020）報道，依據(jù)本試驗所用牛津杯的直徑值（7.8 mm），將牛津杯外徑約2 倍值（16.0 mm）作為區(qū)分敏感與高敏感的判定標準，因此抑菌作用的判定標準如下：不敏感，DIZ=7.8 mm；敏感，7.8 mm16.0 mm。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

生長性能、免疫器官指數(shù)、腸道菌群等數(shù)據(jù)采用T-test統(tǒng)計，DIZ數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，P<0.05 表示顯著差異，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞生長性能的影響（見表2）

表2 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞生長性能的影響

由表2 可知，與對照組比，試驗組肉雞的料重比顯著降低（P<0.05）。此外，試驗組和對照組之間的42 d 體重、平均日增重及平均日采食量差異不顯著（P>0.05）。

2.2 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞免疫器官指數(shù)的影響（見表3）

由表3 可知，與對照組比，試驗組肉雞法氏囊指數(shù)顯著增加（P<0.05），脾臟指數(shù)有增加的趨勢（0.050.05）。

表3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞腸道菌群的影響（見表4）

表4 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞盲腸食糜菌群的影響（log10 CFU/g）

由表4可知，與對照組比，試驗組肉雞盲腸食糜中大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P<0.05），乳酸桿菌與大腸桿菌的比值顯著提高（P<0.05）。此外，試驗組和對照組之間盲腸食糜的乳酸桿菌數(shù)量差異不顯著（P>0.05）。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88、羅伊氏乳酸桿菌的體外抑制作用（見圖1和表5）

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88（A）、羅伊氏乳酸桿菌（B）的體外抑制作用

表5 凝結(jié)芽孢桿菌與金霉素、土霉素對大腸桿菌K88、羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用[抑菌圈直徑（DIZ），mm]

由圖1 和表5 可知，凝結(jié)芽孢桿菌對腸道有害菌大腸桿菌K88 的抑制作用為敏感（7.8 mm16.00 mm），抑菌效果均顯著高于凝結(jié)芽孢桿菌（P<0.05）。

3 討論

3.1 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞生長性能的影響

本研究開展的肉雞21～42日齡飼養(yǎng)階段，與對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧的肉雞比，飼喂凝結(jié)芽孢桿菌的試驗組肉雞料重比顯著降低4.52%；此外，兩組之間平均日采食量、平均日增重差異不顯著，且試驗全程無肉雞死亡。Hung等（2012）最早報道，21～42日齡肉雞飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌顯著降低了料重比，且對平均日采食量和平均日增重?zé)o顯著影響。王政等（2016）通過飲水添加凝結(jié)芽孢桿菌的試驗顯示：與對照組比，凝結(jié)芽孢桿菌顯著降低了21～42日齡肉雞的料重比，且平均日采食量和平均日增重也無顯著影響。均與本試驗結(jié)果基本一致，均證明：在衛(wèi)生狀況良好的養(yǎng)殖條件下，21～42 日齡肉雞應(yīng)用凝結(jié)芽孢桿菌有助于生長性能的改善，具體表現(xiàn)在良好的飼料轉(zhuǎn)化效率。

3.2 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是肉雞主要的免疫器官（宮秀燕等，2015b；夏濤等，2019a），免疫器官指數(shù)反映了肉雞免疫器官的發(fā)育程度，免疫器官發(fā)育良好能夠為肉雞提供正常的免疫保護，有助于保障肉雞良好的生長性能（Al-Khalaifa等，2019；王乙茹等，2019a）。表3結(jié)果顯示：與對照組相比，試驗組肉雞法氏囊指數(shù)顯著增加11.54%；脾臟指數(shù)增加5.04%，有統(tǒng)計差異的趨勢；此外，兩組之間胸腺指數(shù)差異不顯著。以上結(jié)果表明，飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌有助于肉雞免疫器官的發(fā)育，尤其是法氏囊和脾臟的發(fā)育完善對肉雞良好生長性能有積極的意義。趙娜等（2017）研究顯示，與對照組相比，飼喂0.3×106CFU/g（全價配合飼料）凝結(jié)芽孢桿菌組AA肉雞脾臟指數(shù)顯著增加40.00%；法氏囊指數(shù)增加了25.00%，有增加的趨勢，與本試驗結(jié)果基本相符。嚴濤等（2019）研究表明：與對照組相比，0.3×106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌組AA肉雞的法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)分別增加了47.65%、18.96%，但兩組之間統(tǒng)計差異不顯著。對比嚴濤等（2019）報道與本試驗結(jié)果之間的差異，原因可能包括：①凝結(jié)芽孢桿菌的添加量不同。本試驗?zāi)Y(jié)芽孢桿菌的添加量高于嚴濤等（2019）的報道。②試驗設(shè)計不同。本試驗是2組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，然而嚴濤等（2019）設(shè)計4個處理組的統(tǒng)計分析。③組內(nèi)數(shù)據(jù)變異系數(shù)的差異。本試驗2 個處理組免疫器官指數(shù)數(shù)據(jù)的組內(nèi)變異系數(shù)在6.9%以下，然而嚴濤等（2019）報道的4個處理組免疫器官指數(shù)數(shù)據(jù)的組內(nèi)變異系數(shù)整體偏高，最大值達30.5%，這可能是嚴濤等（2019）報道試驗組肉雞法氏囊和脾臟指數(shù)增加47.65%和18.96%，但與對照組差異不顯著的關(guān)鍵原因。

3.3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞腸道菌群的作用及機制

腸道菌群平衡是肉雞腸道健康及良好生長性能的重要保障（Clavijo 等，2018；Shang 等，2018）。大腸桿菌是影響肉雞健康及生長性能的腸道主要有害菌，乳酸桿菌是肉雞腸道的優(yōu)勢有益菌，二者數(shù)量及比例對肉雞腸道菌群平衡、生長性能發(fā)揮具有重要意義（Clavijo 等，2018；Shang 等，2018）。表4 結(jié)果顯示：與對照組比，試驗組肉雞盲腸食糜大腸桿菌數(shù)量顯著降低14.03%；乳酸桿菌數(shù)量雖增加了0.73%，但無顯著差異。趙娜等（2017）研究顯示，飼用凝結(jié)芽孢桿菌顯著降低42 日齡AA 肉雞盲腸食糜大腸桿菌數(shù)量；且Wu等（2018）報道，飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌對42日齡AA肉雞盲腸食糜的乳酸桿菌數(shù)量無顯著影響。以上報道與本試驗結(jié)果一致。進一步分析表4結(jié)果：與對照組比，試驗組肉雞盲腸食糜中乳酸桿菌與大腸桿菌的比值顯著升高。這一結(jié)果提示，凝結(jié)芽孢桿菌具有優(yōu)化腸道菌群的作用，其機制可能與試驗用凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌性能有關(guān)。據(jù)此，本研究進一步開展了該株凝結(jié)芽孢桿菌的體外抑菌試驗，以驗證其在體內(nèi)優(yōu)化盲腸食糜菌群的作用。

牛津杯法是體外試驗評估益生菌抑菌性能的主要方法之一（柳成東等，2021）。為了驗證飼用凝結(jié)芽孢桿菌對試驗組肉雞盲腸食糜大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的影響，體外抑菌試驗對應(yīng)選用腸道有害菌的代表指示菌產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 及腸道有益菌的代表指示菌羅伊氏乳酸桿菌，并以金霉素和土霉素為參照，對比評估該株凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌作用及效果。圖1 和表5 顯示，凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88 的抑制作用達到敏感水平，具有良好的抑制效果。這與張韻等（2017）、汪攀等（2017）、周倩等（2020）的報道一致，從而驗證飼喂該株凝結(jié)芽孢桿菌抑制盲腸內(nèi)有害菌大腸桿菌的結(jié)果（見表4）。

此外，本研究體外評估了凝結(jié)芽孢桿菌對腸道有益菌乳酸桿菌的抑制作用。由于羅伊氏乳酸桿菌是畜禽腸道分布最廣泛、比例最高的乳酸桿菌（張如春等，2019），因此體外抑菌結(jié)果能夠反映飼喂該株凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞腸道乳酸桿菌的影響。圖1 直觀結(jié)果顯示：凝結(jié)芽孢桿菌（Ⅲ組）對羅伊氏乳酸桿菌無抑制作用（不敏感）；相反，廣譜飼用抗生素金霉素（Ⅰ組）及土霉素（Ⅱ組）顯著抑制羅伊氏乳酸桿菌（高敏感）。這一結(jié)果充分表明：凝結(jié)芽孢桿菌的應(yīng)用避免了以往飼用抗生素對肉雞腸道有益菌的不利影響，這是凝結(jié)芽孢桿菌進一步優(yōu)化腸道菌群的作用機制，從而實現(xiàn)了無抗養(yǎng)殖條件下肉雞生長性能的改善。

4 結(jié)論

本研究首次結(jié)合體內(nèi)外試驗證明：飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌能夠通過抑制腸道有害菌、優(yōu)化腸道菌群以及增強免疫器官的發(fā)育，實現(xiàn)無抗養(yǎng)殖條件下肉雞生長性能的改善。在當(dāng)前我國飼料禁抗的態(tài)勢下，本研究結(jié)果為廣大飼料企業(yè)評估和選用飼用凝結(jié)芽孢桿菌提供了技術(shù)參考。