蒙小俊，王秋利，龔曉松

（安康學(xué)院 旅游與資源環(huán)境學(xué)院，陜西 安康 725000）

隨著工農(nóng)業(yè)迅速發(fā)展和人們生活水平的提高，城市污水排放量迅速增加，水污染狀況日趨嚴(yán)重[1]。WWTPs是控制水污染，保證人類可持續(xù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)設(shè)施，活性污泥是WWTPs生物處理工藝的功能主體，污泥菌群多樣性以及優(yōu)勢菌群之間的相互作用決定了WWTPs生物處理功能的穩(wěn)定性，群落的改變常常影響WWTPs的處理效率與出水水質(zhì)[2]3699[3-4]。深入分析污水處理中微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)控制和提高污水處理的穩(wěn)定性具有重要作用[5]，可為污水處理系統(tǒng)精準(zhǔn)調(diào)控和優(yōu)化設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

已有研究利用純培養(yǎng)從污水處理系統(tǒng)中分離出多株功能菌，但WWTPs中微生物數(shù)量多達(dá)1018個(gè)，個(gè)體微小、多樣性豐富和可培養(yǎng)性低等特征導(dǎo)致傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)微生物開展研究十分困難[6-7]。近年來，隨生物技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)被廣泛用于WWTPs中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。Zheng等[8]利用高通量分析技術(shù)對(duì)外源性進(jìn)水群落和環(huán)境條件如何影響WWTPs膜生物反應(yīng)器中的活性污泥群落進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)進(jìn)水COD與Pseudomonas呈正相關(guān)，進(jìn)水群落無法為活性污泥提供硝化菌，但能接種反硝化菌，同時(shí)增強(qiáng)了活性污泥群落的生物多樣性和抵抗外部干擾的能力。李國令等[9]利用高通量測序技術(shù)對(duì)OAO和AO工藝處理城鎮(zhèn)生活污水的微生物群落特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)兩種工藝間微生物群落差異性較大，OAO工藝的微生物種群豐度和多樣性均大于AO工藝；AO工藝優(yōu)勢菌屬為Pseudomonas、 Thiothrix、 Dechloromonas， OAO 工藝 則 為 Thermomonas、 Dechloromonas、 Rhodobacter。韓文杰等[10]5037對(duì)長三角地區(qū)5個(gè)采用MBBR泥膜復(fù)合工藝污水廠低溫季節(jié)的微生物群落變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)各污水廠相對(duì)豐度較高的菌屬主要有 Nitrospira、Mycobacterium、Defluviicoccus、Hyphomicrobium和Macellibacteroides等，懸浮載體的投加極大程度上強(qiáng)化了優(yōu)勢硝化菌屬Nitrospira的富集。張曉紅等[11]1896以京津冀區(qū)域內(nèi)典型WWTPs活性污泥為研究對(duì)象，利用高通量測序?qū)?個(gè)WWTPs活性污泥的微生物種群結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了詳細(xì)解析，發(fā)現(xiàn)5個(gè)WWTPs活性污泥種群結(jié)構(gòu)具有一定差異；不同污水廠，影響其活性污泥群落結(jié)構(gòu)組成的環(huán)境因素不同，特殊的進(jìn)水水質(zhì)會(huì)對(duì)污泥菌群組成和生物多樣性產(chǎn)生影響。WWTPs活性污泥微生物的多樣性和豐度指數(shù)受進(jìn)水水質(zhì)的影響較為明顯，群落組成還受到工藝類型和地理位置等因素的影響，不同工藝、不同水質(zhì)和不同地理位置的WWTPs微生物多樣性存在差異[12]41。

地理位置特殊的漢江流域上游WWTPs以活性污泥為主體的微生物多樣性研究鮮見報(bào)道。發(fā)源于陜南秦巴山地的漢江流域是丹江口水庫的主要水源地，其在確保南水北調(diào)中線工程水質(zhì)，促進(jìn)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有重要的戰(zhàn)略地位[13]，但漢江流域上游支流污染嚴(yán)重、生態(tài)環(huán)境質(zhì)量差、潛在威脅多[14]，污水排放是最主要的威脅之一。2017年以來對(duì)漢江流域上游污水處理設(shè)施進(jìn)行提標(biāo)改造，很大程度上緩解了污水對(duì)水源涵養(yǎng)地水環(huán)境的污染。為保證水源涵養(yǎng)地水質(zhì)，確保南水北調(diào)中線的穩(wěn)定供水，需要加強(qiáng)該區(qū)域WWTPs處理設(shè)施的優(yōu)化和監(jiān)控。同時(shí)，利用高通量分析WWTPs微生物的研究主要關(guān)注的重點(diǎn)為群落結(jié)構(gòu)。PICRUSt（Phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states） 功能預(yù)測分析已在土壤、沉積物、水體和動(dòng)物胃液等環(huán)境中進(jìn)行應(yīng)用[15]422[16-18]。孫峰等[15]421對(duì)丹江口庫區(qū)庫濱帶植被土壤細(xì)菌群落多樣性及PICRUSt功能預(yù)測分析表明，庫濱帶植物根際細(xì)菌主要涉及次生產(chǎn)物代謝的生物合成、轉(zhuǎn)錄、多糖生物合成和代謝、細(xì)胞生長和死亡等38個(gè)子功能?；诟咄繙y序的PICRUSt功能預(yù)測分析在WWTPs微生物研究中分析相對(duì)較少，因此對(duì)微生物進(jìn)行功能多樣性預(yù)測分析，可為提高WWTPs的運(yùn)行效果提供理論支撐，為污染物去除系統(tǒng)提供優(yōu)化運(yùn)行的技術(shù)支持。

本研究利用高通量測序技術(shù)對(duì)采自漢江流域上游5個(gè)不同WWTPs好氧單元中活性污泥的微生物群落組成和多樣性進(jìn)行研究，結(jié)合PICRUSt分析預(yù)測活性污泥微生物功能，從微生物群落和功能角度分析不同樣品的差異，以期為漢江流域上游WWTPs的穩(wěn)定運(yùn)行、精準(zhǔn)調(diào)控和優(yōu)化及丹江口水源涵養(yǎng)地水環(huán)境保護(hù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNAKit， OMEGA；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒，Life；2×HieffRobust PCR Master Mix，Yeasen；Hieff NGSTMDNA Selection Beads，Yeasen。Pico-21臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Fisher；DYCZ-21電泳槽，北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司；Q32866 Qubit3.0熒光計(jì)，Invitrogen；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 樣品采集

污泥樣品分別采自漢江流域上游5個(gè)不同的WWTPs好氧單元，每個(gè)污泥樣品采集3次，采樣時(shí)間為2020年10月23日—10月29日，所有采集的污泥樣品置于聚乙烯密封袋中并排盡空氣密封，立即用冰盒儲(chǔ)存帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存，用于DNA提取和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。樣品編號(hào)分別為O1、O2、O3、O4和O5，各WWTPs工藝及主要進(jìn)出水平均水質(zhì)指標(biāo)如表1所示。

表1 污水處理廠水質(zhì)指標(biāo)mg/L

1.3 微生物總DNA提取、PCR擴(kuò)增和Illumina測序

污泥樣品微生物總DNA提取嚴(yán)格按照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試驗(yàn)步驟進(jìn)行。PCR進(jìn)行兩輪擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量后，確定PCR反應(yīng)加入的模板DNA量，PCR擴(kuò)增引物341F：CCTACGGGNGGCWGCAG和805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)閂3～V4[19]。反應(yīng)條件94℃3 min；94℃30 s，45℃20 s，65℃30 s，5個(gè)循環(huán)；94℃20 s，55℃20 s，72℃30 s，20個(gè)循環(huán)；72℃5min，10℃。30μLPCR反應(yīng)體系，2×HieffRobust PCR Master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F 1 μL， Primer R 1 μL， 模 板 PCR 產(chǎn) 物10～20ng，ddH2O9～12μ L。第二輪擴(kuò)增，引入Illumina橋式PCR兼容引物。反應(yīng)條件95℃3 min；94℃20s，55℃20s，72℃30s，5個(gè)循環(huán)；72℃5min，10℃。30 μL PCR反應(yīng)體系，2×HieffRobust PCR Master Mix 15μ L，Primer F 1 μ L，Index-PCR Primer R1μ L，第一輪 PCR 產(chǎn)物 20～30ng，ddH2O9～12μ L。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，為得到均勻和高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，使用Qubit3.0熒光定量儀進(jìn)行文庫濃度測定。利用Illumina MiSeq 2000進(jìn)行測序，委托生工生物工程（上海） 股份有限公司完成。將得到的微生物16S rRNA基因高通量測序結(jié)果提交至NCBI（登錄號(hào)為PRJNA698055）。

1.4 序列數(shù)據(jù)分析

所有測序原始數(shù)據(jù)利用Prinseq軟件經(jīng)過質(zhì)控過濾后得到高質(zhì)量序列，采用Usearch軟件進(jìn)行Operational taxonomic units（OTUs） 聚類分析，并利用RDP classifier（OTU物種注釋，默認(rèn)情況下16S擴(kuò)增片段使用RDP classifier比對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫（http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）） 貝葉斯算法在97%相似水平上對(duì)OTU進(jìn)行分類[11]1899，運(yùn)行軟件Mothur（http://www.mothur.org）/中的summary.Single命令，計(jì)算生物相關(guān)指數(shù)，包括豐富度指數(shù)（Chao1/ACE指數(shù)）、覆蓋率指數(shù)（Good’s coverage） 和多樣性指數(shù)（Shannon/Simpson指數(shù)）。利用R軟件基于主坐標(biāo)分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA） 進(jìn)行β多樣性分析。使用Origin、Excel等軟件進(jìn)行微生物的α多樣性和β多樣性的相關(guān)圖繪制。

1.5 PICRUSt功能預(yù)測分析

PICRUSt是一款菌群功能和代謝的預(yù)測軟件，可以通過16S rRNA基因序列預(yù)測對(duì)應(yīng)細(xì)菌的代謝功能譜功能。采用PICRUSt軟件進(jìn)行分析，利用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QⅡME）獲得的colsed OTU Table分別與Clusters of Orthologs Groups（COG） 數(shù)據(jù)庫和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得不同的數(shù)據(jù)庫功能預(yù)測信息，具體分析步驟基于在線分析平臺(tái)（http://picrust.github.io/picrust/）[20]816。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物多樣性分析

所有污泥樣品原始序列經(jīng)過質(zhì)控后α多樣性指數(shù)如表2所示，有效序列在54499～77420之間，樣品 OTUs在 1550～2064之間，覆蓋率均達(dá)到0.99，表明未被檢出的微生物種類較少，得到的α多樣性指數(shù)可靠性較高。微生物組成豐富度稀疏曲線圖1表明，隨著測序深度增加，OTUs（a）和香農(nóng)指數(shù)均逐漸增加并趨于飽和，說明所用樣品的序列數(shù)（b）能夠充分展示樣品中的微生物多樣性，與序列高覆蓋率（均達(dá)到0.99）反映的結(jié)果一致。圖2顯示,盡管每個(gè)污泥樣品的OTUs較多，但共有的OTUs僅為652，樣品 O1、O2、O3、O4和O5獨(dú)有的OTUs分別為65、83、269、187和47，說明樣品O3、O4微生物與其他樣品相比差異較大；5個(gè)樣品香農(nóng)指數(shù)分別為5.84、5.74、6.30、6.13和5.82，辛普森指數(shù)分別為0.0069、0.0150、0.0067、0.0066和0.0068，Chao1指數(shù)分別為1959、1924、2291、2190和1784，Ace指數(shù)分別為1902、1888、2213、2145和1761（見表2）。不難看出，樣品O3香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均較高。香農(nóng)指數(shù)越高，表明群落的多樣性越高，物種分布越均勻；Chao1指數(shù)越大，OTU數(shù)目越多，說明該樣本物種數(shù)比較多；Ace指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低[10]5039，表明O3的多樣性相對(duì)較高。

表2 微生物α多樣性指數(shù)

圖1 微生物組成豐富度稀疏曲線

圖2 微生物組成OUT韋恩圖

聚類和PCoA β多樣性分析均能描述不同樣品間群落的差異，若兩個(gè)樣品距離較近，表示這兩個(gè)樣品的物種組成較相似。圖3微生物組成聚類分析（a）和PCoA分析（b） 表明，樣品O2和O3聚類在一起且距離較近，樣品O1和樣品O4雖聚類在一起但分布在不同的象限內(nèi)，樣品O5未與其他單個(gè)樣品聚類且單獨(dú)分布在一個(gè)象限內(nèi)，說明樣品O2和樣品O3微生物組成相似度較高，樣品O5微生物組成與其他樣品相似度較低。

圖3 微生物組成聚類分析和PCoA分析

2.2 微生物結(jié)構(gòu)門水平上的組成和豐度

為進(jìn)一步了解不同污泥樣品微生物的組成和豐度，對(duì)質(zhì)控后的序列利用RDP classifier軟件進(jìn)行生物分類，圖4（每種門的豐度至少在一個(gè)樣品中不小于1%）為微生物群落結(jié)構(gòu)在門水平上的組成。優(yōu)勢門主要為 Proteobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes、Chloroflexi和 Acidobacteria，這 5類門類豐度總和在61.72%～78.25%之間（見圖4），此研究結(jié)果與Ma的研究結(jié)果類似[21]。Proteobacteria和Bacteroidetes為WWTPs污泥中常見的優(yōu)勢門[22][23]97，樣品O1、O2、O3、O4和O5中Proteobacteria的豐度分別為26.514%、33.864%、36.008%、21.510%和31.790%，Bacteroidetes的豐度分別為15.621%、12.164%、10.071%、6.779%和33.379%。Bacteroidetes和Chloroflexi普遍存在于WWTPs中并參與有機(jī)物的降解[24]，Chloroflexi在五個(gè)污泥樣品中的豐度為3.123%～13.856%。Bacteroidetes和Chloroflexi存在于WWTPs中并對(duì)有機(jī)物進(jìn)行降解，有利于脫氮自養(yǎng)菌的生長，從而增強(qiáng)氮素的去除；缺氧條件下反硝化菌以有機(jī)物為電子供體將NO3—或者NO2—轉(zhuǎn)化成N2，若碳源不足將影響總氮的去除，工業(yè)上常添加甲醇、葡萄糖、乙酸和乙酸鈉等作為碳源以提高總氮的去除效率。研究表明，分別添加葡萄糖和乙酸鈉為單一碳源時(shí)，Acidobacteria和Proteobacteria含量會(huì)上升[25]。值得一提的是，Planctomycetes在樣品 O1、O2、O3、O4和O5的豐度分別為7.245%、13.866%、13.416%、8.639%和7.327%時(shí)，可能存在厭氧氨氧化菌 （Anaerobic ammonium oxidation bacteria，AAOB）。王蕾等的研究表明WWTPs好氧污泥中存在一定數(shù)量的AAOB（8.63×105～1.90×107拷貝數(shù)/g污泥）[26]。以AAOB為驅(qū)動(dòng)的Anammox反應(yīng)因無需外加碳源、運(yùn)行成本低、耗氧量低和污泥產(chǎn)率低等優(yōu)點(diǎn)，成為迄今為止最簡捷的污水生物脫氮途徑，如何實(shí)現(xiàn)主流Anammox并加以工業(yè)化應(yīng)用是未來污水處理領(lǐng)域最熱門的研究熱點(diǎn)和焦點(diǎn)之一。Actinobacteria在5個(gè)污泥樣品中的豐度范圍為1.295%～3.826%，McLellan等發(fā)現(xiàn)Actinobacteria為污水處理廠進(jìn)水中的優(yōu)勢細(xì)菌[27]，推測Actinobacteria可能是外源微生物，群落結(jié)構(gòu)能在一定程度上反映WWTPs的進(jìn)水性質(zhì)及所在城市的地理環(huán)境特征[28]。Nitrospirae在樣品O1、O2、O3、O4和O5中的豐度分別為1.599%、0.237%、1.934%、2.479%和0.310%，表明5個(gè)污泥樣品具有良好的硝化性能，這與張冰等研究得出的Nitrospirae在城市活性污泥群落中的相對(duì)豐度在0.27%～1.61%基本相同[2]3701。Nitrospirae為化能自養(yǎng)菌，是WWTPs中典型的硝化細(xì)菌，大量異養(yǎng)菌的存在將與Nitrospirae競爭O2，不利于氮素的硝化，若好氧生物池存在大量COD，大量異養(yǎng)菌會(huì)增值，因此應(yīng)盡可能保持好氧進(jìn)水較低的COD濃度。除此之外，Verrucomicrobia、Firmicutes和Ignavibacteriae等在5個(gè)污泥樣品的豐度均較高，未分類的門類豐度在6.455%～21.621%之間。

圖4 微生物群落結(jié)構(gòu)在門水平上的組成

2.3 微生物結(jié)構(gòu)屬水平上的組成和豐度

微生物屬水平上的組成如表3所示（Nitrosomonas、Pseudomonas、Thauera、Zoogloea和Unclassified Saprospiraceae除外，每種屬的豐度至少在一個(gè)樣品中不小于1%）。樣品O1、O2、O3、O4和O5中未分類但可以歸類到相應(yīng)屬的豐度分別為45.227%、41.094%、43.707%、43.074%和54.260%，推測這些可能是相應(yīng)屬的新種，除Dokdonella、Nitrosomonas、Thauera在樣品O2中的豐度和Zoogloea在樣品O3中的豐度為零外，所有屬在5個(gè)樣品中均有檢出，優(yōu)勢屬被所有污泥樣品共享，但豐度不同，完全未分類的豐度在6.455%～21.621%之間，這完全不同于賀赟等對(duì)北京市5座不同處理工藝污水處理廠污泥生物群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果[29]，而與高晨晨等的研究結(jié)果相似[12]40，這可能主要與各系統(tǒng)污水水質(zhì)、工藝類型和運(yùn)行參數(shù)有關(guān)，水質(zhì)是一個(gè)關(guān)鍵的決定因素[30]。

表3 微生物群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的組成 %

續(xù)表

研究表明，Dechloromonas是氨氧化菌，同時(shí)具備反硝化除磷的能力[31]，Saprospiraceae可參與脫氮除磷[32]；Anaerolineaceae 是反硝化菌[33]；Sphingobacteriales和 Xanthomonadaceae可進(jìn)行脫氮[34]；Comamonadaceae是構(gòu)成活性污泥菌膠團(tuán)的主要微生物[12]40。常見的亞硝化氧化菌Nitrosomonas在污泥中的豐度在0.042%～0.196%之間，其他參與氮素反應(yīng)的微生物如 Pseudomonas、Thauera、Terrimonas和Thiobacillus等均有檢出，Terrimonas菌能發(fā)生好氧反硝化[35]，Pseudomonas能發(fā)生好氧反硝化且具有異養(yǎng)硝化的能力[36]，T hiobacillus和

Thauera具有反硝化的功能[37]，Thauera能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。構(gòu)成活性污泥菌膠團(tuán)的微生物為Flavobacterium、Acinetobacter和 Zoogloea[12]40，豐度在5個(gè)污泥樣品中的范圍分別為0.019%～4.184%，0.086%～1.978%和 0.033%～0.253%，同時(shí)Flavobacterium能將周圍環(huán)境中的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷[23]97，Zoogloea是兼性好氧細(xì)菌，能降解有機(jī)物，可脫氮除磷[38]，Acinetobacter可進(jìn)行異養(yǎng)硝化[39]。盡管大部分屬為非優(yōu)勢屬，豐度在5個(gè)樣品中的范圍為17.440%～28.623%，但污水處理系統(tǒng)功能的穩(wěn)定性一定程度上需要多樣化群落結(jié)構(gòu)間的相互協(xié)同，生物處理單元是一個(gè)復(fù)雜的微生物群體，污水中污染物的有效去除是多種菌群共同作用的結(jié)果。上述結(jié)果表明，WWTPs中功能微生物多數(shù)具有脫氮除磷的功能，脫氮除磷是WWTPs關(guān)注的重點(diǎn)，若污水處理不達(dá)標(biāo)或工藝運(yùn)行失穩(wěn)，大量氮磷流入漢江將對(duì)供水水質(zhì)造成嚴(yán)重威脅。加強(qiáng)進(jìn)出水水質(zhì)監(jiān)測是關(guān)鍵。脫氮除磷微生物在泥齡（SRT）上存在矛盾，一定條件下，SRT越長，有機(jī)負(fù)荷越低，硝化細(xì)菌越易成為優(yōu)勢菌，硝化效果越好；SRT越短，有機(jī)負(fù)荷越高，除磷效果越好。為兼顧脫氮除磷，SRT應(yīng)控制在脫氮菌的最小值和除磷菌的最大值之間。同步脫氮除磷需COD充足，若WWTPs進(jìn)水COD濃度較低，應(yīng)縮短進(jìn)水初沉池的水力停留時(shí)間或取消初沉池，若需要，可依據(jù)實(shí)際情況添加葡萄糖、乙酸和乙酸鈉等進(jìn)行碳源補(bǔ)充，同時(shí)可考慮對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化分段進(jìn)水。低溫是WWTPs生物脫氮除磷效率降低的重要原因，可適當(dāng)提高污水水力停留時(shí)間和DO含量，增大污泥回流比以及提高污泥SRT，以應(yīng)對(duì)低溫的不利影響。生物單元中添加填料形成的MBBR，可提高生物量、處理負(fù)荷，強(qiáng)化處理效果，實(shí)現(xiàn)原池提量，A2/O、SBR和氧化溝工藝均能較易改造成MBBR，在好氧池原位原池進(jìn)行，對(duì)工藝流程影響小。總體原則為先優(yōu)化運(yùn)行，后工程措施；先內(nèi)部碳源，后外加碳源。

2.4 微生物群落功能預(yù)測分析

為獲得不同污泥樣品微生物的功能，采用PICRUSt軟件進(jìn)行菌群功能預(yù)測。利用PICRUSt預(yù)測微生物的功能，采用weighted nearest sequenced taxon index（weighted NSTI）指數(shù)來評(píng)估每個(gè)樣品中的序列與已知數(shù)據(jù)庫中測定基因的加權(quán)平均距離[20]819。NSTI指數(shù)的數(shù)值越小，說明預(yù)測樣品中的微生物組成與已知的數(shù)據(jù)庫匹配度越高[15]425，不同樣品在COG和KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測的NSTI指數(shù)在0.218～0.263之間，表明污泥樣品微生物功能預(yù)測匹配度較高。COG和KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測的結(jié)果分別見圖5、圖6和圖7。

圖5 COG數(shù)據(jù)庫對(duì)不同樣品預(yù)測功能基因分析

圖6 KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)不同樣品預(yù)測功能基因二級(jí)功能分析

圖7 KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)不同樣品預(yù)測功能基因三級(jí)功能分析

圖5顯示，能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化（Energy production and conversion）、氨基酸運(yùn)輸和代謝（Amino acid transport and metabolism）、碳水化合物運(yùn)輸和代謝（Carbohydrate transport and metabolism）、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（Coenzyme transport and metabolism）、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝（Lipid transport and metabolism）、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成（Translation，ribosomal structure and biogenesis）、轉(zhuǎn)tion）、復(fù)制，重組和修復(fù)（Replication，recombination and repair）、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/膜結(jié)構(gòu)的生物合成（Cell wall/membrane/envelope biogenesis）、翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換與分子伴侶 （Post-translational modification，protein turnover，and chaperones）、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（Inorganic ion transport and metabolism） 以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（Signal transduction mechanisms） 十二大類為主要功能基因家族，占比之和范圍為66.618%～67.518%。樣品O1、O2、O3、O4和O5中的預(yù)測功能基因占比相近，氨基酸運(yùn)輸和代謝占比為7.312%～7.786%，產(chǎn)能與轉(zhuǎn)化占比為5.899%～6.290%、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝占比為4.786%～5.191%、碳水化合物運(yùn)輸和代謝占比為5.746%～6.748%、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制占比為6.380%～6.812%、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜占比為6.464%～6.783%，這些研究結(jié)果與彭永臻等的研究結(jié)果基本一致[23]99。未能很好注釋的基本預(yù)測功能家族（General function prediction only）和未知功能基因家族（Function unknown）占比分別為12.387%～12.757%和7.504%～8.022%。

圖6和圖7分別為KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)不同樣品預(yù)測功能基因的二級(jí)功能分析和三級(jí)功能分析。圖6顯示，氨基酸代謝（Amino Acid Metabolism）、膜轉(zhuǎn)運(yùn)（Membrane Transport）、碳水化合物代謝（Carbohydrate Metabolism）、復(fù)制和修復(fù)（Replication and Repair）、能量代謝（Energy Metabolism）、維他命及輔因子代謝 （metabolism of vitamins）、翻譯（Translation） 和次生產(chǎn)物代謝的生物合成（Biosynthesis of Other Secondary Metabolites） 等 20個(gè)子功能預(yù)測基因占比在5個(gè)污泥樣品中都約為90%，其中氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物代謝、復(fù)制和修復(fù)和能量代謝為預(yù)測的優(yōu)勢功能基因，占比分別為10.343%～10.975%、9.574%～11.337%、10.047%～10.721%、7.001%～7.299%和 5.895%～6.302%，這些檢測結(jié)果與COG數(shù)據(jù)庫對(duì)不同樣品預(yù)測功能基因分析得出的結(jié)論基本相似。圖7顯示，除丁酸酯代謝、TCA循環(huán)和氮代謝的預(yù)測基因外，其他所有功能預(yù)測基因豐度在每個(gè)樣品中均高于1%，豐度總和在43.027%～44.938%之間，大部分預(yù)測功能基因與氨基酸及其派生物和蛋白質(zhì)的新陳代謝、遺傳信息和物質(zhì)代謝等有關(guān)，這與COG數(shù)據(jù)庫預(yù)測得出的結(jié)論相吻合。如，檢測到主要的碳水化合物的代謝途徑糖酵解（Glycolysis/Gluconeogenesis） 和三羧酸循環(huán)（TCA cycle） 的預(yù)測功能基因占比分別為1.051%～1.178%和0.856%～0.922%（圖7），結(jié)果與Yang等的研究結(jié)果基本一致[40]，碳水化合物是典型高效的活性污泥中微生物能量產(chǎn)生和生物合成的過程。與氮素代謝的基因在樣品O1、O2、O3、O4和O5中的占比分別為0.718%、0.748%、0.741%、0.675%和0.703%；氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）是物質(zhì)在微生物體內(nèi)氧化時(shí)釋放的能量并通過呼吸鏈供給ADP與無機(jī)磷酸合成ATP的偶聯(lián)反應(yīng)，基因豐度在1.509%～1.653%之間；氮磷的去除是活性污泥中微生物最重要的代謝活動(dòng)之一。甲烷代謝的預(yù)測基因在1.033%～1.220%之間，表明有部分菌能在厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生甲烷，產(chǎn)生可再次利用的能源。

3 結(jié)論

（1） 微生物分析表明，漢江流域上游WWTPs好氧單元活性污泥微生物組成中的優(yōu)勢門為Proteobacteria，屬水平上檢測到多種參與脫氮除磷的微生物。

（2） PICRUSt功能預(yù)測分析表明，WWTPs活性污泥微生物主要涉及氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和碳水化合物代謝等20個(gè)主要功能，表現(xiàn)出功能上的多樣性。

（3）加強(qiáng)監(jiān)測，優(yōu)化工藝運(yùn)行參數(shù)，結(jié)合工藝改造調(diào)控功能微生物群落，提高WWTPs出水水質(zhì)、保護(hù)丹江口水源涵養(yǎng)地。