劉啟鴻，柯 曉*，胡露楠，陳 盈，方文怡，趙培琳，許燕城

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學脾胃研究所，福建福州 350003；3.福建省中醫(yī)脾胃醫(yī)學中心，福建福州 350003）

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是一種臨床常見的功能性腸病，以結腸傳輸時間延長、進食后結腸高振幅推進收縮減少為特征［1］，臨床上表現(xiàn)為大便次數(shù)減少（每周＜3次）、糞質干硬、排便困難等。STC在中醫(yī)學歸屬“便秘”的范疇，病位在大腸，大腸傳導不利為其發(fā)病機理，氣機的升降出入失常，影響腸道的傳輸，大腸傳導功能失職，導致糟粕內停，發(fā)為便秘。最新流行病學調查顯示，STC的患病人數(shù)在便秘人群中占15%～42%［2］。長期的便秘不僅會影響患者的工作與生活，頻繁就醫(yī)服藥還會加重經(jīng)濟負擔與精神壓力，此外還可誘發(fā)心腦血管、肛周疾病、腸道腫瘤等并發(fā)癥。雖然目前西醫(yī)治療在不斷完善和規(guī)范，但臨床療效尚不理想。然而，中醫(yī)藥在治療便秘方面有明顯的優(yōu)勢，具有藥物依賴性少、遠期療效滿意等優(yōu)點。

理氣通便方是根據(jù)前期文獻、證候學調查研究、中醫(yī)臨床診療經(jīng)驗與國醫(yī)大師楊春波教授學術思想的指導下擬定的驗方，方藥組成包括厚樸、枳實、火麻仁、郁李仁、瓜蔞、萊菔子、北柴胡、白芍、陳皮、芒硝10味藥。我們前期通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，理氣通便方治療STC具有一定的療效，可改善氣滯證STC患者臨床癥狀，增加每周自發(fā)排便次數(shù)［3］，但是其療效機制尚未完全明確，還需要進一步深入探索。網(wǎng)絡藥理學是一門新興的學科，主要是描述藥物之間相互作用的特點，與中醫(yī)學的方劑配伍治療相似，通過形成“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡對藥物與疾病的作用機制進行預測，為中藥復方現(xiàn)代藥理學研究與機制探討提高了精準度，同時也促進了中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展［4］。對此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，探討理氣通便方治療STC的分子機制，為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 活性成分及其對應靶點篩選 運用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以北柴胡、白芍、厚樸、枳實、火麻仁、郁李仁、瓜蔞、萊菔子、陳皮為關鍵詞，查找這9味藥的化學成分。利用TCMID（http：//www.ehbio.com/TCMIP/index.php/Home/Index/index.html）數(shù)據(jù)庫查找TCMSP未收錄的芒硝的化學成分。選擇口服生物利用度（OB≥30%）與類藥性（DL≥0.18）作為參考標準對所檢索到的活性成分進行篩選［5］，建立理氣通便方的成分數(shù)據(jù)庫。利用TCMSP查找理氣通便方化合物對應的靶標蛋白，并在Unitprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.Unitprot.org/）查詢靶標蛋白相對應的基因名稱與ID。

1.2 STC相關靶點檢索 運用Gene Cards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）收集STC疾病相關的靶點基因，并將二者收集的結果進行合并與整理，剔除重復的靶點，即為STC疾病的預測靶點庫。

1.3 藥物與疾病交集靶點的獲取 利用Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線工具繪制理氣通便方藥物靶標蛋白與STC疾病靶點的韋恩圖，并獲得二者交集靶點的蛋白名稱，即為理氣通便方在治療STC的潛在作用靶點。

1.4“藥物-潛在作用靶點-疾病”網(wǎng)絡構建 對交互靶點運用Excel表格進行整理，分別標出疾病、藥物、靶點等對應屬性后，將所有數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.2軟件中，可視化地構建“藥物-潛在作用靶點-疾病”相互作用的網(wǎng)絡圖。

1.5 構建PPI蛋白互作網(wǎng)絡 將交互靶點蛋白導入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），物種選擇為“人源”進行操作，最小相互作用閾值“＞0.9”，構建蛋白互作的PPI網(wǎng)絡圖。

1.6 GO生物學功能與KEGG通路富集分析 采用Metascape平臺對核心靶點進行GO與KEGG富集分析。GO生物學功能分析主要從細胞成分、分子功能和生物過程三個方面描述基因靶點的作用。KEGG富集分析主要是得到理氣通便方與STC共同靶點所富集的信號通路。GO和KEGG分析皆以P值＜0.01為篩選標準。

2 結果

2.1 理氣通便方成分與疾病靶標預測結果 從TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫中搜索理氣通便方各味藥的有效化合物成分，得到最終選定的結果為75個化合物，枳實22個、白芍13個、瓜蔞11個、柴胡10個、火麻仁6個、陳皮5個、萊菔子3個、厚樸2個、郁李仁2個、芒硝1個，具體見表1。75個有效成分進一步檢索潛在有效靶點有275個。通過Gene Card、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到3 887個STC相關靶點基因。通過繪制韋恩圖，結果得到藥物-疾病交互靶點186個。具體見圖1。

表1 理氣通便方治療慢傳輸型便秘的主要活性化學成分

圖1 藥物-疾病交互靶點韋恩圖

2.2“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖 利用Cytoscape 3.8.2軟件，導入相應文件后構建“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡。如圖2所示，網(wǎng)絡中有186個疾病靶點（圖2藍色節(jié)點），每條連線則表示理氣通便方與藥物、藥物與作用靶點、作用靶點與STC之間的相互作用關系。

2.3 PPI網(wǎng)絡的構建及其關鍵靶點的獲取 將186個交互靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡分析后，得到蛋白間的相互作用信息，代表相互作用的邊有694條，詳見圖3。另外，繪制出前30位核心靶蛋白相互作用頻次的柱狀圖，橫坐標表示此蛋白互作的頻次，數(shù)值越大則表示越重要，這些靶點很可能是理氣通便方治療STC的核心靶點，詳見圖4，結果提示TP53、MAPK1、AKT1、RELA、JUN、MAPK3、TNF等靶點可能起到了關鍵作用。

圖3 PPI蛋白互作圖

圖4 核心靶蛋白相互作用頻次的柱狀圖

2.4 GO功能富集分析 GO分析包括分子功能、生物過程、和細胞組分三個層次，分別取前10條目錄進行條形圖展示，具體見圖5。在分子功能方面主要包括氧化還原酶活性、蛋白激酶結合、核受體活性、轉錄因子結合等；生物過程方面主要包括細胞對無機物、有毒物質和脂多糖以及化學刺激的反應、對活性氧代謝、細胞凋亡的調節(jié)；細胞組分主要包括體元投射、細胞外間隙、全膜、細胞質囊泡腔等。

圖5 理氣通便方GO基因功能富集分析圖

2.5 KEGG富集結果分析 篩選前20條通路進行部分展示，根據(jù)結果可以看出主要涉及與腫瘤相關通路、細胞衰老、NF-κB信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路，具體見圖6。

圖6 理氣通便方KEGG通路分析圖

3 討論

理氣通便方是在國醫(yī)大師楊春波“理氣通降法”學術思想的指導下擬定的驗方，對于STC患者具有較好的臨床療效。該方的配伍遵循以通祛疾的治療原則，強調順應大腸通降下行的生理特性，針對因滯而病的病理特點，方中以理氣藥與潤腸通便藥物為主，起到氣機通暢、腑氣得順的狀態(tài)，最終恢復大腸的正常傳導功能。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法結果發(fā)現(xiàn)，理氣通便方治療STC的活性化學成分主要集中在枳實、瓜蔞、柴胡、白芍四味草藥中。理氣通便方治療作用的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、毛地黃黃酮、花生四烯酸、β-谷甾醇等。槲皮素、山柰酚、毛地黃黃酮屬于黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性作用。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠活化乳酸菌，減少腸球菌，減少IL-6對腸道的損傷，保護腸黏膜，同時具有潤腸通便的作用，緩解慢性傳輸性便秘［6］。槲皮素有強大的活性氧（ROS）清洗功能，能抑制DSS誘導的腸炎小鼠血清MPO、MDA和NO的濃度，減少細胞氧化損傷，調節(jié)腸道菌群失調［7］。山柰酚能夠抑制NF-κB信號通路的激活，減輕Caco-2細胞IL-8分泌［8］。毛地黃黃酮具有抗炎、抗腫瘤、保護神經(jīng)元細胞的作用［9］?；ㄉ南┧崾且环N不飽和脂肪酸，在肝臟、肌肉等組織中作為磷脂結合的結構脂類起重要作用，也是前列腺環(huán)素、血栓烷素A2等生物活性物質的直接前體，對脂質蛋白的代謝、血液流變學、白細胞功能和血小板激活等具有重要的調節(jié)作用［10］。β-谷甾醇是一類曾被譽為“生命鑰匙”，含有多種功效的天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗抑郁等生物活性。［11］

圖2“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡圖

通過PPI網(wǎng)絡研究發(fā)現(xiàn)，理氣通便方治療STC的核心靶點有TP53、MAPK、AKT、RELA、JUN、TNF等。TP53基因又稱為P53，作為抑癌基因能夠抑制細胞分裂和增殖過快，同時也是預防癌癥的重要基因［12］。一項關于結直腸癌危險因素的Meta分析結果顯示［13］，長期便秘會增加腸道內致癌物質對腸上皮的作用時間，是誘發(fā)結直腸癌的危險因素。MAPK是一種絲裂原活化蛋白激酶，可促使肌動蛋白細肌絲相關蛋白的磷酸化，引起平滑肌收縮［14］。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK表達與水通道蛋白3、4變化趨勢呈正相關，抑制MAPK可增加腸道水分，促進腸道蠕動［15］。AKT是PI3K/Akt信號通路下游的主要作用靶點，位于其上游的PI3K能夠調控細胞的增殖、存活、生長等，其下游的eNOS是NO的調節(jié)酶，具有抑制胃腸道平滑肌收縮和抑制胃腸蠕動的作用［16］。JUN是MAPK信號通路的下游效應因子，是信號從細胞表面?zhèn)髦良毎麅炔康暮诵膫鬟f者，可促使c-jun、c-fos的表達，與情緒、疼痛等有密切關系［17］。TNF分為TNF-α、TNF-β兩種，TNF-α主要由單核-巨噬細胞分泌，TNF-β主要由活化的T淋巴細胞分泌，可引起粒細胞、巨噬細胞趨化聚集，進一步擴大炎癥反應。RELA基因可能對腸道動力學發(fā)揮作用，但目前研究較少，機制不明確。

GO分析發(fā)現(xiàn)，理氣通便方治療STC的潛在作用機制可能是通過對細胞因子的反應、細胞凋亡、含氧化合物、脂質等生物過程，參與蛋白質或酶結合、信號受體結合、調節(jié)受體配體活性等分子功能，涉及細胞外的空間區(qū)域、細胞質囊泡腔細胞等組分發(fā)揮作用。KEGG分析結果顯示，主要參與腫瘤、細胞衰老、NF-κB信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路用。研究表明，腫瘤因子會造成Cajal間質細胞損傷，Cajal間質細胞是胃腸動力的起搏細胞，參與胃腸起搏介導神經(jīng)信號的傳播［18］。關于細胞衰老的研究，比較有影響力的有自由基、神經(jīng)可塑性下降等學說，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)STC患者存在腸神經(jīng)元細胞衰老的表現(xiàn)［19］。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥湯劑能夠降低炎癥因子IL-1b和腫瘤壞死因子-α的血清水平，抑制核轉錄因子NF-κB的磷酸化，并下調炎癥因子IL-1b和IL-6在便秘大鼠結腸中的表達［20］。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路意義作用重大，該通路集中了質膜上可以與細胞內外信號通路相關的受體與配體，尤其是5-羥色胺能神經(jīng)突觸和神經(jīng)活性配體受體相互作用，5-羥色胺主要是由結腸黏膜中腸嗜鉻細胞的合成而來，調節(jié)腸道運動，5-羥色胺異常是引起STC發(fā)病的一種重要神經(jīng)遞質，5-HT對腸道功能的調節(jié)依賴于不同的受體?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在STC患者結腸壁中五羥色胺受體-3表達降低，同時五羥色胺受體-4在黏膜層、黏膜下神經(jīng)叢、肌間神經(jīng)叢及肌層中的表達下降［21］。

基于前期臨床研究的基礎，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法，對理氣通便方治療慢傳輸型便秘的作用靶點和通路進行了預測篩選和分析，為進一步的實驗研究提供了新的思路方向和理論基礎。結果發(fā)現(xiàn)理氣通便方有不同的活性成分，能參與到不同的生物學進程，初步揭示了理氣通便方作用于慢傳輸型便秘的多靶點、多環(huán)節(jié)的復雜網(wǎng)絡機制，為進一步深入探討其作用機制提供參考方向。