邢馨竹， 楊占武， 孔佑賓， 李文龍， 杜匯， 李喜煥， 張彩英

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001）

大豆（Glycine max）是我國(guó)種植面積最大的豆科作物，也是需氮較多的作物［1-2］。大豆可與土壤中的根瘤菌共生互作，在固氮酶的作用下進(jìn)行根瘤固氮，將空氣中游離態(tài)的氮轉(zhuǎn)化為氨，一般根瘤固氮可提供植物所需氮素的50%～60%。共生固氮是一種無污染、可持續(xù)、廉價(jià)并高效地增施氮肥的方式［3］，其過程是土壤中的根瘤菌通過豆科植物根毛或側(cè)根杈口侵入其根部形成侵染線，進(jìn)到根的皮層，刺激宿主皮層細(xì)胞分裂進(jìn)而形成根瘤［4］。根瘤菌在侵染細(xì)胞內(nèi)以類菌體形式存在，由根瘤菌泡囊包圍，并隨類菌體的增多積累聚β-羥基丁酸鹽（poly-β-hydroxybutyrate，PHB）和多磷酸鹽顆粒（polyphosphate particle，PP）等物質(zhì)［5］，豆科根瘤中PHB的積累程度與根瘤固氮和糖代謝能力息息相關(guān)［6］。豆科植物結(jié)瘤固氮能力與根瘤鮮重、大小及固氮酶活性等顯著關(guān)聯(lián)。

在植物中，類胡蘿卜素主要存在于葉綠體和液泡中，可作為抗氧化劑防止光氧化損傷，在光合作用中發(fā)揮重要作用。類胡蘿卜素可以被裂解為一些醇類、酚類等小分子，如獨(dú)腳金內(nèi)酯、維生素A、脫落酸（abscisic acid，ABA）以及一些有揮發(fā)性氣味的芳香類化合物［7-8］。分解類胡蘿卜素的類胡蘿卜素雙加氧酶可分為2類：9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenases，NCEDs）和類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases， CCDs）。NCEDs和CCDs的功能在玉米、水稻、大豆等多種作物中已被報(bào)道［9］，NCEDs主要與脫落酸形成有關(guān)，而CCDs主要參與一些色素類、酚類、萜類物質(zhì)和獨(dú)腳金內(nèi)酯的合成。玉米中發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素雙加氧酶VP14屬于NCED類，其被證實(shí)與ABA合成有關(guān)［10］；擬南芥中通過同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)4個(gè)CCDs（CCD1、4、7、8），并證明CCDs與NCEDs具有不同的酶活性和催化底物，說明它們具有不同的生物學(xué)功能［10-11］。

據(jù)報(bào)道，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶CCD1參與了多種植物果實(shí)成熟過程，同時(shí)與植物生殖生長(zhǎng)及根系形成有關(guān)［12-13］；CCD1在樹莓、玫瑰等植物成熟過程中參與揮發(fā)性芳香化合物形成［14］；CCD4參與多種植物花和果實(shí)芳香類化合物合成和果實(shí)成熟過程，在花和其他生殖組織中高水平表達(dá)［15-18］；CCD7和 CCD8 參與激素獨(dú)腳金內(nèi)酯（strigolactones，SLs）合成［19］，其中CCD7被證實(shí)與水稻分蘗有關(guān)［20］，擬南芥AtCCD7主要在根、莖、葉、花等的維管束中特異表達(dá)［21-22］；CCD8可通過調(diào)控SLs影響馬鈴薯主枝側(cè)枝和匍匐莖的形成［23］；但CCDs對(duì)根瘤形成和生長(zhǎng)的影響鮮見報(bào)道。

本研究通過分析根瘤不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，隨著根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育，GmCCD8表達(dá)量遞增，且接種根瘤菌28 d后達(dá)到最大值，暗示GmCCD8可能參與大豆根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育。為此，本研究通過基因克隆、實(shí)時(shí)定量、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子表達(dá)分析、過表達(dá)和基因干擾等技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證GmCCD8在大豆根瘤固氮中的生物學(xué)功能，以期為大豆根瘤固氮相關(guān)基因功能解析提供理論支撐，為大豆高效固氮分子育種奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

大豆品種中黃15和野生型擬南芥（Columbia）由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆課題組提供；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；發(fā)根農(nóng)桿菌K599購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；慢生根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiensUSDA110為中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供。

將整齊一致、顆粒飽滿的大豆種子用氯氣消毒10～12 h，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中28℃催芽3 d，待芽長(zhǎng)至5 cm左右播種于裝滿蛭石的花盆中，每盆1粒，共60盆，生長(zhǎng)條件為16 h光照、8 h黑暗，光照強(qiáng)度10 000 lx，溫度28℃，濕度60%，生長(zhǎng)期間所澆灌低氮營(yíng)養(yǎng)液（2.5 mmol·L?1K2SO4、2 mmol·L?1MgSO4·7H2O、0.5 mmol·L?1KH2PO4、0.15 mol·L?1FeCl2、0.1mol·L?1NH4NO3、0.046 mmol·L?1H3BO3、0.004 2 mmol·L?1MnCl2·4H2O、0.000 8 mmol·L?1ZnSO4、0.000 5 mmol·L?1CuSO4、0.001 mmol·L?1MoO3、0.000 1 mmol·L?1CoCl2·6H2O）。將慢生根瘤菌 USDA110 在 YMB液體培養(yǎng)基（北京酷來博科技有限公司）中28℃培養(yǎng)2～3 d，待大豆第1片真葉展開時(shí)，用注射器吸取蒸餾水稀釋的根瘤菌液（OD600=0.08）澆于大豆植株根部，每株30 mL。接種根瘤菌后10、17、28 d分別為根瘤發(fā)育初期、中期和成熟期，每個(gè)時(shí)期選取15株大豆植株上符合發(fā)育時(shí)期的大小一致的根瘤進(jìn)行取樣，樣品于液氮速凍，?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1GmCCD8的克隆 使用天根生化科技有限公司的RNA多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取28 d根瘤樣品的RNA；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? 1stStrand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄cDNA；利用NCBI中的Primer Blast設(shè)計(jì)特異引物（表1）擴(kuò)增GmCCD8ORF。擴(kuò)增體系參照大連TaKaRa公司PrimeSTAR@Max DNA Polymerase說明書，采用推薦三步擴(kuò)增法：98℃3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃5 min；12℃保溫）。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收、純化、連接轉(zhuǎn)化等過程將目的片段連接到測(cè)序載體，篩選到的陽性克隆送蘇州金唯智有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.2GmCCD8表達(dá)模式分析 提取10、17、28 d根瘤樣品總RNA；使用大連TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfert Real Time）反轉(zhuǎn)錄cDNA，通過BIORAD CFX96 Real-Time PCR儀，采用2×SYBR@染料法進(jìn)行qRT-PCR分析（引物見表1，以actin11為內(nèi)參對(duì)照）。qRT-PCR體系為：SYBR 10μL，cDNA 1μL，前引物和后引物各1μL，H2O 7μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃15 s，30個(gè)循環(huán)；10℃保溫。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 GmCCD8亞細(xì)胞定位 利用WoLF PSORT（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/）預(yù)測(cè)GmCCD8的亞細(xì)胞定位，利用限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ（TaKaRa）在37℃條件下分別雙酶切326-GFP載體和GmCCD8PCR產(chǎn)物30 min，然后使用T4 DNA Ligase（TaKaRa）在 16 ℃連接 16 h，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆，凱杰生物質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，?20℃保存。野生型擬南芥種植于光照培養(yǎng)室，生長(zhǎng)條件為16 h光照、8 h黑暗，溫度23℃，濕度70%，定期澆Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。取20片生長(zhǎng)4周左右的擬南芥葉片，用刀片切割后轉(zhuǎn)移到10 mL酶解液中，室溫避光酶解3 h，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)算原生質(zhì)體數(shù)量，達(dá)到約105cell·100 μL?1；吸取10 μg 326-GFPGmCCD8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，以35S-GFP為陽性對(duì)照，培養(yǎng)16 h后利用FV10i激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）觀察GFP發(fā)光情況。

1.2.4GmCCD8基因表達(dá)模式分析 將GmCCD8起始密碼子上游2 000 bp序列克隆到PHY107載體，構(gòu)建PGmCCD8-GUS融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)GmCCD8啟動(dòng)子的毛狀根：利用注射器針頭劃傷并侵染萌發(fā)3～4 d的大豆下胚軸，種植在蛭石中，14 d后利用GUS染色技術(shù)對(duì)劃傷處生長(zhǎng)的毛狀根進(jìn)行篩選。對(duì)染色成功的陽性毛狀根接種根瘤菌，分別取接菌后10、17、28 d的根和根瘤進(jìn)行GUS染色，觀察GmCCD8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)情況。

1.2.5GmCCD8生物學(xué)功能分析 將GmCCD8ORF利用限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切30 min，T4 DNA Ligase連接16 h，克隆到帶有GUS報(bào)告基因的PCAMBIA1304過表達(dá)載體；將GmCCD8220 bp特異片段分別用KpnⅠ和SpeⅠ、SacⅠ和BamHⅠ酶切，并連接構(gòu)建到帶有GUS報(bào)告基因的PTCK303 RNAi載體。利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)GmCCD8過表達(dá)（overexpression，OX）和RNAi干擾的復(fù)合陽性植株（方法同1.2.4）。利用GUS染色技術(shù)對(duì)劃傷處生長(zhǎng)的毛狀根染色，篩選染色成功的陽性毛狀根進(jìn)行根瘤菌接種，28 d后鑒定表型，野生型根作為陰性對(duì)照。采用乙炔還原法［24］測(cè)定固氮酶活性。每處理選取30株帶有根瘤的陽性根分別放于10 mL真空管中，用注射器抽出2 mL空氣，再打進(jìn)制備好的乙炔氣體2 mL，將該真空管放入28℃搖床，3～4 h后抽取1 mL氣體，用氣相色譜儀檢測(cè)固氮酶活性。色譜條件為：色譜柱為毛細(xì)管柱，載氣速度1 mL·min?1，進(jìn)樣量5 μL，進(jìn)樣口溫度130℃，檢測(cè)器溫度230℃，柱溫80℃。制備完乙烯氣體之后，分別摘取真空管中的所有根瘤，將根瘤稱重后，根據(jù)氣相色譜結(jié)果計(jì)算固氮酶活性［24］。

1.2.6GmCCD8RNAi根瘤透射電鏡分析 將接菌28 d的野生型和RNAi根瘤取下，用刀片切取觀察部位，將樣品浸入混合固定液中進(jìn)行前固定，放置4℃冰箱2 h左右；用PBS沖洗3次，10 min后進(jìn)行脫水、置換，用丙酮和812包埋劑包埋，聚合后切片干燥，用2%醋酸鈾飽和酒精溶液染色，隨后用HT7800透射電鏡（Hitachi，日本）進(jìn)行掃描，觀察野生型和RNAi根瘤的內(nèi)部結(jié)構(gòu)［25］。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmCCD8的序列分析

以接種根瘤菌28 d的大豆根瘤cDNA為模板，利用GmCCD8ORF特異引物擴(kuò)增目的序列，得到與目的序列大小相似的擴(kuò)增片段，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)該基因序列長(zhǎng)度為1 692 bp，與Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）已公布的Glyma.06G085800序列相同。該基因組序列全長(zhǎng)3 888 bp，包含5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子；cDNA長(zhǎng)度為2 046 bp，除1 692 bp的ORF外，還包含134 bp的5’非翻譯區(qū)（5’-UTR）和220 bp的3’非翻譯區(qū)（3’-UTR），編碼563個(gè)氨基酸。

2.2 不同發(fā)育時(shí)期根瘤GmCCD8表達(dá)分析

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期根瘤的GmCCD8進(jìn)行qRTPCR分析，結(jié)果表明，隨著根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育GmCCD8表達(dá)量持續(xù)上升，且接種后28 d的表達(dá)量與根瘤生長(zhǎng)初期和中期相比極顯著提高，此時(shí)根瘤已成熟，并具有旺盛的固氮能力。因此，推測(cè)GmCCD8的高效表達(dá)與根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育及固氮能力相關(guān)（圖1）。

圖1 GmCCD8根瘤表達(dá)量Fig.1 Relative expression of GmCCD8 in nodules

2.3 GmCCD8亞細(xì)胞定位分析

WoLF PSORT預(yù)測(cè)GmCCD8定位于細(xì)胞質(zhì)。為了對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證，本研究利用構(gòu)建的亞細(xì)胞定位載體326-GFP-GmCCD8和35S-GFP陽性對(duì)照載體轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，培養(yǎng)室培養(yǎng)16 h后觀察GFP熒光信號(hào)，結(jié)果顯示GmCCD8定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2），與預(yù)測(cè)結(jié)果相同，說明GmCCD8在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

圖2 GmCCD8在擬南芥原生質(zhì)體中亞細(xì)胞定位Fig.2 Subcellular localization of GmCCD8 in Arabidopsis protoplasts

2.4 GmCCD8表達(dá)模式分析

轉(zhuǎn)基因毛狀根中的GUS染色結(jié)果顯示，GmCCD8在根和根瘤中均有表達(dá)，且隨著根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育GUS染色逐漸加深，成熟期著色最深（圖3），與實(shí)時(shí)定量結(jié)果一致，進(jìn)一步暗示GmCCD8參與根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育，并且主要在根瘤成熟期發(fā)揮作用。

圖3 轉(zhuǎn)GmCCD8啟動(dòng)子的陽性根瘤不同發(fā)育時(shí)期GUS染色Fig.3 Histochemical GUS staining of nodules with GmCCD8 promoter in different developmental stages

2.5 GmCCD8在根瘤中的生物學(xué)功能分析

將構(gòu)建好的PCAMGIA1304-GmCCD8過表達(dá)載體、PTCK303-GmCCD8RNAi載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌并侵染毛狀根，通過GUS染色篩選陽性毛根，分析其GmCCD8表達(dá)量、根瘤鮮重和固氮酶活，結(jié)果顯示，GmCCD8在過表達(dá)陽性毛根（OX）的表達(dá)量比對(duì)照組提升2.3倍，根瘤鮮重提升36%，固氮酶活活性提高33%；與對(duì)照組相比，GmCCD8在RNAi陽性毛根（RNAi）的表達(dá)量下降了2.5倍，隨著GmCCD8表達(dá)量的下降，根瘤鮮重與固氮酶活分別降低40%和30%（圖4）。根瘤鮮重和固氮酶活是根瘤固氮能力的重要指標(biāo)，由此推測(cè)GmCCD8在根瘤發(fā)育和固氮中具有重要的作用。

圖4 GmCCD8轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株根瘤表型及指標(biāo)分析Fig.4 Index and phenotypic of nodules in GmCCD8 transgenic composite plants

2.6 GmCCD8干擾根瘤透射電鏡分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證GmCCD8在根瘤發(fā)育中的作用，本研究對(duì)根瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，野生型根瘤具有正常生長(zhǎng)的共生體，根瘤內(nèi)部的根瘤菌在泡囊中分裂增殖，泡囊不斷伸長(zhǎng)隨之根瘤也不斷加大，并且積累了大量聚β-羥基丁酸鹽（PHB）；然而GmCCD8干擾后，根瘤內(nèi)泡囊受損或整體變成長(zhǎng)橢圓形且邊緣不規(guī)則化，泡囊內(nèi)類菌體減少且PHB積累降低（圖5）。說明GmCCD8嚴(yán)重影響根瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu)和根瘤菌與大豆根瘤的共生互作，推斷GmCCD8對(duì)根瘤發(fā)育具有重要作用。

圖5 GmCCD8 RNAi 28 d根瘤顯微結(jié)構(gòu)Fig.5 Nodule ultrastructure of GmCCD8 RNAi at 28 d

3 討論

諸多研究證明，類胡蘿卜素雙加氧酶在植物生長(zhǎng)過程中發(fā)揮著重要作用，不同的CCDs表達(dá)部位不同，說明它們的功能不同。Kim等［26］研究發(fā)現(xiàn)，GmCCD8在根瘤中表達(dá)量較高，并且在瘤成熟期時(shí)表達(dá)量最高。本研究在根瘤不同發(fā)育時(shí)期對(duì)GmCCD8進(jìn)行了qRT-PCR分析，結(jié)果顯示，隨著根瘤的生長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸增加，在生長(zhǎng)28 d的成熟根瘤中表達(dá)量與其他時(shí)期相比顯著提高，GmCCD8啟動(dòng)子-GUS表達(dá)模式研究表明，隨著根瘤的生長(zhǎng)，GUS在毛狀根和根瘤中的著色逐漸加深。上述結(jié)果說明，GmCCD8在根瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用。

獨(dú)腳金內(nèi)酯（SLs）及其衍生物作為新型內(nèi)源性植物激素可調(diào)控植物根系發(fā)育過程，如主根伸長(zhǎng)、側(cè)根形成、不定根及根毛生長(zhǎng)等［21］。目前明確的SLs合成途徑為：all-trans-β-類胡蘿卜素在類胡蘿卜素異構(gòu)酶催化作用下生成9-cis-β-類胡蘿卜素，隨后9-cis-β-類胡蘿卜素在CCD7裂解作用下生成 9-cis-β-apo-10’-胡蘿卜醛，繼而在CCD8的作用下生成己內(nèi)酯，己內(nèi)酯在己內(nèi)酯氧化酶作用下生成5-脫氧獨(dú)腳金醇，再經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)楠?dú)腳金內(nèi)酯［21，27］。近期研究表明，SLs在根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育中也發(fā)揮著很重要的作用［28］。GR24是SL的人工合成類似物，在苜蓿中通過外施GR24，首次發(fā)現(xiàn)SLs參與根瘤菌與豆科植物共生結(jié)瘤過程，能夠促進(jìn)根瘤的形成［29］；豌豆CCD8突變體rms1根瘤數(shù)較野生型降低40%，同時(shí)通過對(duì)CCD8突變體rms1外施GR24可增加其結(jié)瘤數(shù)［30］；苜蓿根瘤感染區(qū)中同時(shí)檢測(cè)到SLs生物合成基因MtD27、MtCCD7和MtCCD8的表達(dá)［31］；在番茄中，CCD8被敲除后，列當(dāng)醇和茄酚含量下降，與野生型相比主根長(zhǎng)度變短，側(cè)根減少，列當(dāng)醇是番茄根中分泌的獨(dú)腳金內(nèi)酯，其含量下降說明CCD8基因的表達(dá)量影響了獨(dú)腳金內(nèi)酯的含量及根系的生長(zhǎng)［32］；百脈根LjCCD7基因沉默后，根瘤數(shù)目比野生型減少20%［33］。

本研究利用毛根轉(zhuǎn)化法獲得GmCCD8過表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因根瘤，GmCCD8過表達(dá)后根瘤鮮重和固氮酶活性與對(duì)照相比分別提高36%和33%，而GmCCD8干擾后根瘤鮮重與固氮酶活性分別下降40%和30%，與前人結(jié)果一致，表明GmCCD8參與大豆根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育及生物固氮。

前人研究表明，根瘤中糖酵解生成的丙酮酸在進(jìn)入TCA循環(huán)的同時(shí)也形成PHB，在土壤低氧環(huán)境中TCA循環(huán)會(huì)受到NADH/NAD＋氧化還原狀態(tài)的限制，PHB合成會(huì)減緩這些氧化還原產(chǎn)物的限制來維持TCA循環(huán)，大豆固氮所需的能量主要由TCA循環(huán)提供，所以PHB的含量直接影響了根瘤的固氮能力［5，34］。本研究對(duì)GmCCD8RNAi陽性根瘤的透射電鏡觀察結(jié)果分析，GmCCD8的沉默影響了PHB的含量及類菌體與泡囊的形成，由此推測(cè)，GmCCD8會(huì)影響根瘤菌與根瘤的互作從而影響根瘤的固氮能力。